阅读说明：本技术 一种半胱氨酸近红外荧光探针的制备和应用 (Preparation and application of cysteine near-infrared fluorescent probe ) 是由 李春艳 刘娟 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及了一种半胱氨酸(Cys)近红外荧光探针的制备和应用,该荧光探针的结构式为：<Image he="367" wi="422" file="DDA0002500522610000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明提供了以6-甲氧基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-甲醛、2-(3,5,5-三甲基环己烯-2-乙烯基)丙二腈、丙烯酰氯等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种近红外半胱氨酸荧光探针；首先,该荧光探针具有大的斯托克斯位移,为180nm；另外,该荧光探针可以高灵敏的检测Cys,与Cys反应之后荧光强度显著增强6倍；然后,该荧光探针可以高选择性检测Cys,不受其他生物硫醇,氨基酸,阳离子,活性氧以及活性硫的干扰；其次,该荧光探针对Cys的响应时间为10min；并且,该荧光探针可以监控活细胞内Cys含量的变化。(The invention relates to preparation and application of a cysteine (Cys) near-infrared fluorescent probe, wherein the structural formula of the fluorescent probe is as follows: the invention provides a preparation method for synthesizing the fluorescent probe by taking 6-methoxy-2, 3-dihydro-1H-xanthene-4-formaldehyde, 2- (3,5, 5-trimethylcyclohexene-2-vinyl) malononitrile, acryloyl chloride and the like as raw materials; the fluorescent probe is a near-infrared cysteine fluorescent probe; firstly, the fluorescent probe has a large Stokes shift of 180 nm; in addition, the fluorescent probe can detect Cys with high sensitivity, and the fluorescence intensity is obviously enhanced by 6 times after the fluorescent probe reacts with Cys; then, the fluorescent probe can detect Cys with high selectivity and is free from other CysInterference of biological thiols, amino acids, cations, active oxygen and active sulfur; secondly, the response time of the fluorescent probe to Cys is 10 min; and the fluorescent probe can monitor the change of Cys content in the living cell.)

一种半胱氨酸近红外荧光探针的制备和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种半胱氨酸近红外荧光探针的制备和应用。

背景技术

半胱氨酸(Cys)是一种小分子生物硫醇，在调节生理过程和维持生物系统平衡方面起着重要的作用，与生物的自解毒，蛋白质的合成，人体的新陈代谢等生命过程息息相关(Y.Li,W.Liu,P.Zhang,H.Zhang,J.Wu,J.Ge,P.Wang,Biosens.Bioelectron.,2017,90,117-124；M.Li,N.Kang,C.Zhang,W.Liang,G.Zhang,J.Jia,C.Dong,Spectrochim.Acta.A.Mol.Biomol.Spectrosc.,2019,222,117262；Y.Dai,Y.Zheng,T.Xue,F.He,H.Ji,Z.Oi,Spectrochim.Acta.A.Mol.Biomol.Spectrosc.,2020,225,117490；X.Song,Y.Yang,J.Ru,Y.Wang,F.Qiu,Y,Feng,W.Liu,Talanta,2019)。近年来研究表明，Cys的异常水平会导致肝损伤，生长迟缓，皮肤损伤。此外，Cys水平与心血管并发症、神经毒性、阿尔茨海默病、帕金森病密切相关(X.Lu,W.Wang,Q.Dong,X.Bao,X.Lin,W.Zhang,W.Zhao,Chem.Commun.,2015,51,1498-1501；X.Ren,H.Tian,L.Yang,L.He,Y.Geng,X.Liu,X.Song,Sens.Actuators.B.Chem.,2018,273,1170-1178；C.F.Yang,L.Y.Zeng,B.K.Ning,J.Y.Wang,H.Zhang,Z.H.Zhang,Spectrochim.Acta.A.Mol.Biomol.Spectrosc.,2020,225,117482；S.Yang,C.Guo,Y.Li,J.Guo,J.Xiao,Z.Qing,ACS Sens.,2018,3,2415-2422)。所以，我们迫切需要开发一种能在生物系统中准确、高效地检测Cys的方法。

近年来，荧光探针由于高灵敏度、无创性、高时空分辨率受到人们广泛的关注和应用。到目前为止，已成功开发出许多用于Cys检测的探针。这些探针多是以萘酰亚胺、荧光素、咔唑等为荧光团，发射波长较短(K.B.Li,W.B.Qu,Q.Shen,S.Zhang,W.Shi,L.Dong,D.M.Han,Dyes Pigments.,2020,173,107918；H.Song,J.Zhang,X.Wang,Y.Zhou,C.Xu,SensActuators B Chem.,2018,259,233-240；X.Hou,Z.Li,B.Li,C.Liu,Z.Xu,Sens.Actuators.B.Chem.,2018,260,295-302；Y.Huang,Q.Ren,S.Li,Y.Feng,W.Zhang,G.Fang,Sens.Actuators.B.Chem.,2019,293,247-255.)。然而，以新型萘荧光素、吲哚类染料为荧光团的探针，虽然具有近红外发射波长，但是斯托克斯位移小(S.Xue,S.Ding,Q.Zhai,H.Zhang,G.Feng,Biosens.Bioelectron.,2015,68；316-321；S.J.Li,Y.J.Fu,C.Y.Li,Y.F.Li,L.H.Yi,J.Ou-Yang,Anal.Chim.Acta.,2017,994,73-81)。因此，设计和合成一种具有近红外发射波长，大斯托克斯位移的Cys荧光探针是十分有意义的。

异佛尔酮衍生物与发色团结合，可以使所合成的荧光团具有大的斯托克斯位移。荧光探针的斯托克斯位移大具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度高等优点。目前，有工作将异佛尔酮衍生物与对甲氧基苯甲醛、6-羟基-2-萘醛合成具有大斯托克斯位移的荧光探针用来测定Cys，但是，其发射波长较短，不足以满足生物成像的要求(J.Hou,P.Cai,C.Wang,Y.Shen,Tetrahedron.Lett.,2018,59,2581-2585；W.Zhang,J.Liu,Y.W.Yu,Q.R.Han,T.Cheng,J.Shen,B.X.Wang,Y.L.Jiang,Talanta,2018,185,477-482)。因此，设计并合成一种基于异佛尔酮衍生物-氧杂蒽染料的长波长探针用于检测Cys是迫切需要的。

发明内容

根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种半胱氨酸近红外荧光探针，该探针具有较大的斯托克斯位移。

本发明的技术方案是，一种半胱氨酸近红外荧光探针，其结构式如下：

一种半胱氨酸近红外荧光探针的制备方法。步骤如下：

1)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的固体化合物6-甲氧基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-甲醛溶于6～10mL乙酸酐，随后向其加入1当量的固体化合物2-(3,5,5-三甲基环己烯-2-乙烯基)丙二腈和2当量的碳酸钾，反应混合物在N₂氛围下于80℃下搅拌13～15h，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为1:1二氯甲烷/石油醚洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物(IX-OMe)(产率50％)。2)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的固体化合物IX-OMe溶于20～30mL无水二氯甲烷，在N₂氛围下置于0℃的冰水混合物中，随即缓慢滴加20当量的三溴化硼，反应混合物室温下搅拌15～17h，停止反应，0℃下，滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取水层，得到有机层，干燥，过滤，通过减压蒸馏除去有机层溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物(IX-OH)(产率60％)。3)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的固体化合物IX-OH溶于20～30mL无水二氯甲烷，加入2当量的三乙胺和2当量的烯丙酰氯，反应混合物室温下搅拌15～20分钟，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体产物(IX)(产率71％)，即为所述的荧光探针。

本发明的有益效果是，一种半胱氨酸近红外荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究荧光探针IX的荧光光谱。荧光探针本身，在590nm激发下，在743nm处you微弱的近红外发射峰；加入Cys之后，在770nm处出现了新的的近红外发射峰。并且随着Cys浓度的增大，荧光探针在770nm处的近红外荧光强度不断增强。斯托克斯位移较大，为180nm。当Cys浓度为70μM，IX的荧光强度增强6倍。然后，记录荧光探针IX的紫外吸收光谱。荧光探针IX自身在534nm处出现吸收带；加入70μM Cys之后，吸收峰发生红移，移动至570nm。其次，评估荧光探针IX对Cys的选择性。分别测定探针与半胱氨酸、生物硫醇(Hcy,GSH)、氨基酸(His,Ala,IIe,Leu,Met,Ser,Thr,Tyr,Asp,Phe,Pro,Trp,Val,Asn,Gln,Gly,Glu,Arg,Lys)、阳离子(K⁺,Na⁺,Mg²⁺,Ca²⁺)，活性氧(H₂O₂,HClO)，活性硫(H₂S,S^2-)的荧光响应。荧光探针IX对Hcy,GSH有微弱的响应，对其他竞争物基本没有响应。只有在Cys存在的情况下，探针IX的荧光强度显著增强。接着，考察pH值对IX检测Cys的影响，荧光探针IX测定Cys的适宜pH范围为7.0-10.0。最后，测定荧光探针IX对Cys的响应时间，在10min之内。

一种半胱氨酸近红外荧光探针的应用。在细胞中只加入荧光探针，红色通道有微弱荧光，这说明探针可以检测细胞内源性Cys。细胞中加入N-乙基马来酰亚胺(NEM)进行预处理，随后加入探针培育，红色通道没有荧光，这是因为NEM清除了活细胞内源性Cys。细胞中加入NEM预处理，在加入Cys培育，最后加入探针培育，红色通道有强烈的荧光。因此荧光探针IX能够检测细胞内Cys并监控Cys浓度的变化，有望成为监控Cys含量和诊断Cys相关疾病的有利工具。

附图说明

图1为荧光探针IX的合成路线。

图2为荧光探针IX与不同浓度的Cys反应后的荧光光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针IX浓度为10μM，Cys浓度分别为：0,10,20,30,40,50,60,70μM。荧光激发波长为590nm。

图3为荧光探针IX与各种浓度Cys的线性响应图。

图4为荧光探针IX与Cys反应后的紫外可见吸收光谱图。

图5为荧光探针IX的选择性图。

荧光探针IX浓度为10μM，Cys浓度为70μM，其他分析物浓度为400μM。

图6为pH对荧光探针IX的影响图。

图7为荧光探针IX与不同浓度Cys反应后的时间响应图。

图8为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针IX的浓度，纵坐标为细胞的存活率。

图9为荧光探针IX与Cys反应后的细胞成像图。(a)细胞与探针培育1h；(b)细胞先用NEM培育30min，加入探针培育1h；(c)细胞先用NEM培育30min，加入Cys培育30min，最后加入探针培育1h；(d)(a)的荧光强度图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。

实施例1：

荧光探针IX的合成

合成路线如图1。化合物IX-OMe合成：在100mL的圆底烧瓶中，将固体化合物6-甲氧基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-甲醛(0.24g，1.0mmol)溶于10mL乙酸酐，随后向其加入固体化合物2-(3,5,5-三甲基环己烯-2-乙烯基)丙二腈(0.22g，1.2mmol)和碳酸钾(0.28g，2.0mmol)，反应混合物在N₂氛围下，于80℃下搅拌14h，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为1:1二氯甲烷/石油醚洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物(0.21g，产率：50％)，即为化合物IX-OMe。

化合物IX-OH合成：在100mL的圆底烧瓶中，将固体化合物IX-OMe(0.21g，0.5mmol)溶于30mL无水二氯甲烷，在N₂氛围下，置于0℃的冰水混合物中，随即缓慢滴加三溴化硼(0.95mL，10mmol)，反应混合物室温下搅拌16h，停止反应，0℃下滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，静置分层，用二氯甲烷萃取水层，得到有机层，干燥，过滤，通过减压蒸馏除去有机层溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体化合物(0.12g，产率：60％)，即为化合物IX-OH。

荧光探针IX的合成：在100mL的圆底烧瓶中，将固体化合物IX-OH(0.41g，1.0mmol)溶于30mL无水二氯甲烷，加入三乙胺(0.28mL，2.0mmol)和丙烯酰氯(0.16mL，2.0mmol)，反应混合物在室温下搅拌15min，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到固体产物(0.32g，产率；71％)，即为荧光探针。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,ppm):δ7.56(d,J＝16.0Hz,1H),7.09(d,J＝8.0Hz,1H),6.96(s,1H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.75(s,1H),6.66(d,J＝17.2Hz,1H),6.43-6.31(m,3H),6.08(d,J＝10.4Hz,1H),2.60-2.47(m,8H),1.83(t,J＝6.0Hz,2H),1.11(s,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,ppm):δ169.0,164.3,155.4,153.2,150.9,150.7,133.3,132.0,130.5,127.6,126.5,126.3,122.5,122.1,120.2,114.4,113.6,112.5,109.0,75.5,43.0,39.2,32.1,28.1,24.6,20.7.MS(TOF):450.2.

实施例2：

荧光探针和Cys溶液配制

探针溶液的制备：称取一定量荧光探针溶解在乙腈中，配置成2×10^-4mol·L^-1的探针溶液。Cys溶液的配制：称取一定量Cys溶解在二次蒸馏水中，转移到250mL的容量瓶中，用二次蒸馏水定容，配置成1×10^-3mol·L^-1的半胱氨酸水溶液。将0.5mL的探针溶液，3.5mL乙腈和0.4-3.6mL的半胱氨酸水溶液加入到10mL的容量瓶中，用PBS缓冲溶液定容，配置成1.0×10^-5mol·L^-1荧光探针，4.0×10^-5mol·L^-1-3.6×10^-4mol·L^-1Cys的混合待测溶液。

实施例3：

荧光探针与Cys反应后的荧光光谱的测定

图2为荧光探针IX与不同浓度Cys反应后的荧光光谱，荧光探针浓度为10μM，Cys浓度分别为：0,10,20,30,40,50,60,70μM。激发波长为590nm，发射波长为680-880nm。狭缝宽度为10.0nm/20.0nm，采用日立F4600荧光分光光度计测量。只有探针的存在时，在743nm处有微弱近红外发射峰。加入Cys，发射峰红移至770nm，探针的斯托克斯位移达到180nm。这是因为Cys与探针反应，使丙烯基甲酸酯断裂，释放荧光团IX-OH，并且荧光强度与Cys浓度呈正相关。当Cys的加入量为70μM，探针的荧光强度增强6倍。图3为探针对各种浓度Cys的荧光线性响应图，探针的荧光强度与Cys的浓度存在良好的线性关系。从以上结论可知，荧光明探针IX可以高灵敏检测Cys。

实施例4：

荧光探针与Cys反应前后的紫外可见吸收光谱的测定

图4为荧光探针与Cys反应前后的紫外可见吸收光谱，荧光探针的浓度为10μM，Cys的浓度为70μM。采用安捷伦Cary60紫外可见分光光度计进行测量。只有探针存在的情况下，在534nm处有吸收峰；加入Cys后，吸收峰移动至570nm。

实施例5：

荧光探针对Cys的选择性

图5为荧光探针对Cys的选择性。分别测定荧光探针(10μM)与Cys(70μM)、生物硫醇(Hcy,GSH)、氨基酸(His,Ala,IIe,Leu,Met,Ser,Thr,Tyr,Asp,Phe,Pro,Trp,Val,Asn,Gln,Gly,Glu,Arg,Lys)、阳离子(K⁺,Na⁺,Mg²⁺,Ca²⁺)，活性氧(H₂O₂,HClO)，活性硫(H₂S,S^2-)(400μM)的荧光发射光谱，发现只有在Cys存在的情况下才能使探针产生强烈的荧光发射。因此，荧光探针IX可以高选择性检测Cys。

实施例6：

pH值对荧光探针检测Cys的影响

图6为pH值对荧光探针的影响。分别测定荧光探针(10μM)与Cys(70μM)在不同pH值条件下(2.0-12.0)反应前后的荧光发射光谱。溶液的pH值对于探针自身的荧光强度基本没有影响。但是，加入Cys后，只有当pH＝7.0-10.0时，探针才产生强烈的荧光发射。从以上结论可知，探针可以在pH＝7.0-10.0范围内检测Cys。因此，荧光探针IX可以在生理条件下检测细胞内的Cys。

实施例7：

荧光探针与Cys反应的时间响应

图7为荧光探针对Cys的时间响应。荧光探针IX对Cys的响应时间在10min以内，10min后，探针的荧光强度不再增加。由此，我们知道荧光探针IX可以实时检测Cys。

实施例8：

荧光探针在活细胞中的应用

首先，我们采用MTT方法来评估荧光探针的细胞毒性。从图8中可以看出，当加入0～30μM Cys探针时，肝癌细胞HepG2的成活率均高于90％，并没有受到太大影响，这证明了荧光探针IX的细胞毒性较小，可以用于活细胞中Cys的检测。接着，我们研究了荧光探针在HepG2细胞中的应用。从图9中可以看出，当细胞与探针培育1h，红色通道有荧光产生(图9a)，这表明探针可以检测活细胞内源性Cys。细胞用N-乙基马来酰亚胺(NEM)预先培育30min，然后加入荧光探针培育1h，红色通道没有发现任何荧光(图9b)，因为NEM清除了活细胞的内源性Cys。细胞用NEM培育30min，然后加入Cys培育30min，最后加入探针培育1h，红色通道有强烈的荧光(图9c)。然后，我们对细胞的荧光强度进行分析，a、b、c荧光成像图的相对荧光强度分别为1、0.1、4.3(图9d)。综上所述，荧光探针IX可以监测活细胞内Cys浓度的变化，并有潜力成为一个强大的工具来诊断与Cys有关的疾病。