阅读说明：本技术 一种具有近红外性质的His-tag荧光探针及其制备和应用 (His-tag fluorescent probe with near-infrared property and preparation and application thereof ) 是由 胡琦 叶秀丽 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种具有近红外性质的His-tag荧光探针及其制备和应用,所述近红外性质的His-tag荧光探针可应用于His-tag富集蛋白的标记和纯化。所述的荧光检测原理为：荧光探针的亚氨基二乙酸(IDA)可以与镍离子进行螯合。螯合后的荧光探针可以与组氨酸标签结合,使标记后的蛋白呈现红色荧光,从而可以通过蛋白质凝胶电泳分离鉴定。本发明可以为蛋白的纯化和分离提供新的思路和方法。(The invention provides a His-tag fluorescent probe with near-infrared property, and preparation and application thereof. The fluorescence detection principle is as follows: iminodiacetic acid (IDA) of the fluorescent probe may chelate with nickel ions. The chelated fluorescent probe can be combined with a histidine tag, so that the labeled protein presents red fluorescence, and the protein can be separated and identified through protein gel electrophoresis. The invention can provide a new idea and method for the purification and separation of protein.)

一种具有近红外性质的His-tag荧光探针及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种具有近红外性质的His-tag荧光探针及其制备和应用。

背景技术

蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。

固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)，简称金属螯合亲合层析，是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸，使之与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等，其中以6个组氨酸残基组合的融合标签(His-Tag)在原核蛋白表达中的应用最为显著。

荧光探针技术是近些年来发展比较热门的标记和检测技术。由于他的灵敏性、稳定性吸引了研究者们广泛的关注。在这些荧染料中，近红外染料由于可以用于对生物损伤小、穿透性强而被广泛的应用于生物监测和应用。基于这个设想，我们设计了一种一种具有近红外性质的His-tag荧光探针的制备和应用。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种具有近红外性质的His-tag荧光探针及其制备和应用。本发明第二个目的是提供一种蛋白质纯化和鉴定的方法。

本发明为实现上述目的采用以下技术方案：

本发明提供了一种如式(III)所示的化合物，该化合物为具有近红外性质的荧光探针：

一种式(III)所示的化合物的制备方法，所述制备方法的原理为：荧光探针的亚氨基二乙酸(IDA)可以与镍离子进行螯合，螯合后的荧光探针可以与组氨酸标签结合，使标记后的蛋白呈现红色荧光,从而可以通过蛋白质凝胶电泳分离鉴定，制备方法的流程示意图如图1所示。

本发明另外提供了一种近红外His-Tag荧光探针的合成方法：

化合物(1-1)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)在二环己基碳二亚胺(DCC)的作用下，生成化合物(1-2)；

其中化合物(1-1)的结构如下式：

其中化合物(1-2)的结构如下式：

所述制备方法为：1.0mmol化合物罗丹明6G，1.2mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于10ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，向其中加入1.0mmol的二环己基碳二亚胺(DCC)，常温反应12小时。向反应液中加入30mL饱和氯化钠溶液，用乙酸乙酯(30mL)萃取三次,收集有机相，用30mL饱和氯化钠水溶液洗三次.取有机层经过无水硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，以二氯甲烷你和甲醇的体积比为1:30的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到化合物1-2。

一种新型近红外荧光探针的制备方法，所述制备方法为：

化合物(1-2)和亚氨基二乙酸(IDA)在DMF溶液中，生成化合物His-1；所述制备方法为：1.0mmol化合物1-2，1.2mmol亚氨基二乙酸(IDA)溶于10ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，常温反应12小时。反应结束后向反应液中加入30mL饱和氯化钠溶液，用二氯甲烷(30mL)萃取三次,收集有机相，用30mL饱和氯化钠水溶液洗三次.取有机层经过无水硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，以二氯甲烷你和甲醇的体积比为1:15的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到化合物荧光探针(III)；

反应路线如下：

本发明提供检测所述荧光探针(III)具有近红外荧光特征的应用。所述荧光探针近红外特征为：化合物(III)在水溶液中具有良好的溶解性，在540nm的激发光作用下，会在625nm出显示出明显的近红外荧光发射波长。

进一步，检测所述荧光探针荧光性质的具体方法为:化合物(III)分别加入到超纯水中，测定在激发为540nm时发射波长620nm处探针的荧光强度；从而说明所述探针具有良好的近红外特征。

本发明所述化合物(III)作为一种荧光探针，可应用于His-tag富集蛋白的标记和纯化。所述的荧光检测原理为：荧光探针的亚氨基二乙酸(IDA)可以与镍离子进行螯合。螯合后的荧光探针可以与组氨酸标签结合，使标记后的蛋白呈现红色荧光。

进一步，所述所标记的蛋白可以通过凝胶蛋白进行分离。

更进一步，分离后的凝胶在凝胶扫描仪下呈现红色的荧光条带。

附图说明

图1是具有近红外性质的荧光探针的制备方法的流程示意图。

图2是本发明中实施例2制备的化合物(III)的核磁氢谱。

图3为本发明中实施例2化合物(III)的荧光发射光谱，荧光探针的激发波长是540nm。

图4为本发明中实施例2制备的化合物(III),荧光探针的发射波长为620nm.

图5荧光探针结合组氨酸标签蛋白的考马斯亮蓝染色图。

图6为荧光探针结合组氨酸标签蛋白的荧光凝成像图。只有在加入加入荧光探针的电泳泳道才会显示荧光信号。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

化合物(1-2)的制备

1.0mmol化合物罗丹明6G，1.2mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于10ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，向其中加入1.0mmol的二环己基碳二亚胺(DCC)，常温反应12小时，得到反应液。向反应液中加入30mL饱和氯化钠溶液，用乙酸乙酯(30mL)萃取三次,收集有机相，用30mL饱和氯化钠水溶液洗三次.取有机层经过无水硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，以二氯甲烷你和甲醇的体积比为1:30的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到化合物(1-2)。

实施例2：

荧光探针(III)的制备方法。

取1.0mmol化合物(1-2)，1.2mmol亚氨基二乙酸(IDA)溶于10ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，常温反应12小时，得到反应液。反应结束后向反应液中加入30mL饱和氯化钠溶液，用二氯甲烷(30mL)萃取三次,收集有机相，用30mL饱和氯化钠水溶液洗三次.取有机层经过无水硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，以二氯甲烷你和甲醇的体积比为1:15的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到化合物荧光探针HIS-1。核磁图见图2。

实施例3：

探针(III)在纯水中的紫外-可见吸收光谱

准确称取一定量实施例2制备的荧光探针，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，用移液枪吸取5μL加入到纯水溶液中，摇晃均匀后，加入到96孔板中，然后测定化合物(III)的紫外吸收光谱。设置含有0.1％DMSO的纯水溶液为对照组.

实验结果表明，所合成的荧光探针在540nm的位置具有良好的紫外吸收峰,见图3。

实施例4：

探针(III)在纯水中的发射光谱

准确称取一定量实施例2制备的荧光探针，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，用移液枪吸取5μL加入到纯水溶液中，摇晃均匀后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光发射光谱。设置含有0.1％DMSO的纯水溶液为对照组.

实验结果表明，所合成的荧光探针在625nm的位置具有良好的发射峰,见图4。

实施例5：

荧光探针与与组氨酸富集蛋白的标记。

将0.5μM组氨酸富集蛋白溶解在50mM HEPES(100mM NaCl,pH 7.2)缓冲液中。向其中加入终浓度为5μM的镍离子与蛋白进行螯合。该反应在37摄氏度下孵化90分钟，向反应体系中加入终浓度为5μM的荧光探针，继续与蛋白孵化90分钟。向反应中加入2.0μM咪唑淬灭反应。反应液直接浓缩进行SDS-PAG分离纯化。

实施例6：

考马斯亮蓝染色。

1)电泳结束后，切取少量含有MARK蛋白以及少许样品的小部分凝胶进行染色，其余部分用保鲜膜包好，放在4℃冰箱保存。取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。

2)倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。

3)加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。

4)完成脱色后，用dd H₂O浸泡，至于未染色凝胶长度相等时，参照MARK蛋白，与未染色凝胶对比，切下所需蛋白成分的凝胶，收集起来。然后把所要提纯的蛋白从凝胶中分离出来。实验结果表明，不同离子对黏度的检测没有干扰。

实施例7：

凝胶荧光成像。

电泳结束后，将蛋白凝胶用超纯水清洗两遍，并用擦镜纸擦除表面残留的水。将凝胶平整放置在荧光扫描成像仪中。选择红光窗口，对凝胶进行扫描。实验结果表明：荧光探针可以与蛋白质进行组氨酸标签蛋白进行结合，使蛋白呈现红色荧光。图中显示为亮白点。

实施例8(对照组1)：

荧光探针与与组氨酸富集蛋白的标记

将0.5μM组氨酸富集蛋白溶解在50mM HEPES(100mM NaCl,pH 7.2)缓冲液中。向反应体系中加入终浓度为5μM的荧光探针，继续与蛋白孵化90分钟。向反应中加入2.0μM咪唑淬灭反应。反应液直接浓缩进行SDS-PAG分离纯化。并进行实施案例6和实施案例7。实验结果表明，在不添加镍离子螯合的时候，无法对蛋白进行荧光标记。

实施例9(对照组2)：

荧光探针与组氨酸富集蛋白的标记

将0.5μM胎牛血清蛋白溶解在50mM HEPES(100mM NaCl,pH 7.2)缓冲液中。向其中加入终浓度为5μM的镍离子与蛋白进行螯合。该反应在37摄氏度下孵化90分钟，向反应体系中加入终浓度为5μM的荧光探针，继续与蛋白孵化90分钟。向反应中加入2.0μM咪唑淬灭反应。反应液直接浓缩进行SDS-PAG分离纯化。并进行实施案例6和实施案例7。实验结果表明，在探针无法对非组氨酸富集蛋白进行标记。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。