一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法
阅读说明：本技术 一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法 (Method for in vitro activating adipose-derived stem cells to convert adipose-derived stem cells into protochondrocytic cells ) 是由 谢海涛 薛卫巍 王斌 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法,包括如下步骤：配置DMEM培养基,所述DMEM培养基配比为1％胎牛血清、10ng/mlTGF－β、100ng/mlBMP－6、6.25μg/ml胰岛素、0.1μmol/L地塞米松、6.25μg/ml转铁蛋白、50μmol/L抗坏血酸磷酸酯；将形成微团的脂肪源干细胞置于DMEM培养基中进行培养；将培养7-9天的脂肪源干细胞注射进入关节腔转化为原软骨细胞。本发明具有节约时间、过程控制简单、产生的软骨细胞排斥低的优点。(The invention discloses a method for activating adipose-derived stem cells to convert into protochondrocytes in vitro, which comprises the following steps: preparing a DMEM medium, wherein the proportion of the DMEM medium is 1% fetal calf serum, 10ng/ml TGF-beta, 100ng/ml BMP-6, 6.25 mu g/ml insulin, 0.1 mu mol/L dexamethasone, 6.25 mu g/ml transferrin and 50 mu mol/L ascorbic acid phosphate; placing the adipose-derived stem cells forming the micelles in a DMEM culture medium for culturing; injecting the adipose-derived stem cells cultured for 7-9 days into joint cavity to transform into protochondrocytes. The invention has the advantages of time saving, simple process control and low rejection of the generated chondrocytes.)
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法。
背景技术
至今较多运用的间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)中骨髓间质干细胞(bonemarrowderivedstemcells，BMSCs)曾经是研究的热点，并被广泛应用于科学研究中。2001年，Zuk等从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中第1 次分离获得了多向分化的干细胞。脂肪源干细胞(adipose－derivedmesenchymalcells，ASCs)是一种优于BMSCs的干细胞，这是由于从脂肪组织提取的干细胞具有取材容易、取材量大、能反复取材及细胞增殖快速等优点。同时，ASCs可以在特定的微环境分别分化成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等。因此ASCs有望成为良好的组织工程种子细胞。
主要存在的问题是:(1)目前已知的ASCs表面分子种类繁多，但多数与其他间充质干细胞存在交叉，没有明确的特异性表面抗原，很难通过选择其中的高特异性表面标志抗原进行组合筛选；(2)虽然很多实验室尝试使用不同材料和技术诱导ASCs分化成软骨组织，但都避免不了软骨组织间出现炎症反应的结果；(3)在很多实验培养的软骨细胞，其后期实验结果都出现了软骨细胞肥大增生的现象；(4)目前诱导ASCs分化成软骨细胞基本上都是采取构建3D模型，但是这一方法的临床实用性不高。
发明内容
有鉴于此，针对目前干细胞转化为软骨细胞存在的问题，本发明目的在于提供一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法。
本发明的目的是采用如下技术方案实现：
一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法，包括如下步骤：
配置DMEM培养基，所述DMEM培养基配比为1％胎牛血清、10ng/mlTGF－β、100ng/mlBMP－6、6.25μg/ml胰岛素、0.1μmol/L地塞米松、6.25μ g/ml转铁蛋白、50μmol/L抗坏血酸磷酸酯；
将形成微团的脂肪源干细胞置于DMEM培养基中进行培养；
将培养7-9天的脂肪源干细胞注射进入关节腔转化为原软骨细胞。
可选的，所述脂肪源干细胞的制备步骤为：
利用缓冲液清洗脂肪组织去除残留的血液和组织碎片，将清洗后的脂肪组织剪成小块，在震荡箱中消化20min～60min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，将脂肪细胞液置于0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时，密封离心分离，去除上清液，制成脂肪干细胞悬液；
将脂肪干细胞悬液置于细胞激活培养基中进行激活培养10-20小时，以便得到初步扩增的脂肪干细胞；
将脂肪干细胞置于至少一种细胞培养基中加激活试剂进行脂肪干细胞悬液培养12-15小时，以便得到激活的脂肪干细胞；
将激活的脂肪干细胞从培养基中取出，加入生理盐水清洗干净，然后加入酶液消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传三到六代培养；
将传代后的培养液自然放置3～5小时得到微团的脂肪源干细胞。
可选的，将培养8天的脂肪源干细胞注射进入关节腔转化为原软骨细胞。
可选的，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传五代培养。
可选的，所述细胞激活培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基。
可选的，所述细胞激活培养基中添加了哺乳动物血清。
可选的，所述哺乳动物血清为哺乳动物胎血清。
可选的，所述激活试剂为钙离子载体。
可选的，所述钙离子载体选自A23187或离子霉素。
本发明提供的体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法为了充分利用有限的时间，尽快激活ASCs向软骨细胞转化，本发明人创造性地发明了在保证其原有的活性的同时，只在体外进行激活，将其刺激到激活状态，保证能向一个软骨细胞方向转变的过程，调整好激活的时间点和强度，再把激活状态的ASCs注射到病变的关节腔内，使其按照原定规划，继续向软骨细胞转化。这样做节约时间，不再强调使用三维模型和较难控制的扩增生长环境，产生的软骨细胞也减少相应的排斥反应。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法，根据本发明待处理的脂肪组织可以从患者或免疫学上可接受的供体获得，从脂肪样品中分离脂肪组织，并培养激活的脂肪组织。“免疫学上可接受的供体”是具有组织的人，其包括脂肪组织。首先利用缓冲液清洗脂肪组织去除残留的血液和组织碎片，在本实施例中使用D-Hanks缓冲液清洗，将清洗后的脂肪组织剪成小块，在震荡箱中消化20min～60min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液；并将脂肪细胞液置于0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时，发明人发现利用前期在0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时能增加脂肪细胞液的活性，再密封离心分离，去除上清液，制成脂肪干细胞悬液；将脂肪干细胞悬液置于细胞激活培养基中进行激活培养10-20小时，以便得到初步扩增的脂肪干细胞；尽管可以在本发明的方法中可使用任何细胞激活培养基，但优选使用添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基培养10-20小时，以便得到初步扩增的脂肪干细胞；在另一实施例中细胞激活培养基还可以添加哺乳动物血清，其中的哺乳动物血清优选为哺乳动物胎血清，例如胎牛血清，添加量为 10％和15％左右。体外激活细胞最基本的营养物质是合适的培养基。这些培养基一般由生理盐水、氨基酸、维生素和其他化合物组成，它们可以直接地被细胞利用，优选RPMI1640培养基或无血清培养基AIM-V。培养基可以补充哺乳动物免疫血清，如胚胎牛免疫血清将脂肪干细胞置于至少一种细胞培养基中加入激活试剂进行脂肪干细胞培养12-15小时，以便得到激活的脂肪干细胞；在本发明的方法中可使用任何细胞培养基，但优选使用添加了钙离子载体的细胞培养基培养12-15小时，其中的钙离子载体选自A23187或离子霉素；在另一实施例中激活试剂也可以选择腺病毒。将激活的血细胞经过至少一次的生理盐水清洗，在本发明实施例中优选经过二次的生理盐水清洗，然后加入酶液消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传三到六代培养，在本实施例中优选五代；将传代后的培养液自然放置3～5小时得到微团的免疫原性较低的P5代ASCs细胞，在各种刺激因子作用下在体外进行诱导激活，使其处在被激活的状态。配置DMEM培养基，所述DMEM培养基配比为1％胎牛血清、10ng/mlTGF－β、100ng/mlBMP－6、6.25μg/ml胰岛素、0.1μ mol/L地塞米松、6.25μg/ml转铁蛋白、50μmol/L抗坏血酸磷酸酯；将形成微团的脂肪源干细胞置于DMEM培养基中进行培养；将培养7-9天的脂肪源干细胞注射进入关节腔转化为原软骨细胞。经实验证明，ASCs培养天数与激活状态之间的关系，在培养8天左右(7-9天)ASCs是最佳的关节腔注射期，此时ASCs既保持原有的活力和归巢性，又能准确的向原软骨细胞进行转化。在 6天之间，ASCs活力有但是转化为原软骨细胞的几率小。如果多于9天，ASCs 活力减弱归巢性降低，导致转化为原软骨细胞的转化率低。因此最佳的激活时间确定在8天左右。
本发明人创造性地发明了在保证其原有的活性的同时，只在体外进行激活，将其刺激到激活状态，保证能向一个软骨细胞方向转变的过程，调整好激活的时间点和强度，再把激活状态的ASCs注射到病变的关节腔内，使其按照原定规划，继续向软骨细胞转化。这样做节约时间，不用强调使用三维模型和较难控制的扩增生长环境，产生的软骨细胞也减少相应的排斥反应。
培养温度例如在30和42℃之间。在其他实施方案中，在32和40℃之间，或在37和38℃之间，或其中包含的任何范围。本领域普通技术人员将认识到，在这些明确范围内的其他范围的时期和温度是预期的，并且在本公开内。或其中包含的任何范围。本领域普通技术人员将认识到，在这些明确范围内的其他范围的时期和温度是预期的，并且在本公开内。或其中包含的任何范围。本领域普通技术人员将认识到，在这些明确范围内的其他范围的时期和温度是预期的，并且在本公开内。
本发明涉及的含有脂肪干细胞的制备中本发明人发现当在其中加入钙离子载体或腺病毒后，被激活的脂肪干细胞进入人体后可以激发外泌体的分泌量，是其它培养方式分泌量的2-3倍。通过使脂肪干细胞与有激活试剂接触，可以激活这些脂肪干细胞，被激活的脂肪干细胞具有可以激发分泌的功能水平，并通过进一步传代培养使其外泌体的分泌量进一步增多。
钙离子载体是一种特殊金属离子物质，它可以自由通过脂质双分子层和可溶性脂质。有两种离子载体：载体或通道形成的离子，像腺病毒为载体，在特殊的离子周围形成一个像笼状般的结构，可以在疏水性双分子层疏水区进行自由扩散；通道形成的离子，如革兰氏阳性菌，在双层分子膜中形成连续的液体的极面，允许离子扩散通过。另外，除了上述所述的载体外，本发明适合的离子载体包括钙离子载体A23187(钙霉素)、钠盐、镁盐等。如钙离子载体A23187，这些载体能够对PH梯度的变化作出反应，以聚集钙离子。钙离子载体A23187具有一个酸性羧基团，它可以在整个生物膜中与其他阳离子进行交换，当离子交换完成之后，则回到膜的另一端。离子载体的有效浓度在0.05-0.5ug/毫升，离子载体的有效浓度是脂肪干细胞激活的有效浓度。
上面对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。