阅读说明：本技术 大豆不溶性膳食纤维及其应用 (Soybean insoluble dietary fiber and application thereof ) 是由 于寒松 高俊鹏 王赛男 房佳琦 卢佳宏 代伟长 刘俊梅 朴春红 王玉华 其他发明人 于 2020-04-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了大豆不溶性膳食纤维,它是由下述方法制备的,它包括：取大豆经过脱皮、脱脂,提取分离蛋白,得湿豆渣；挤压脱水；淀粉水解；蛋白酶水解,水洗,过滤,冻干,得大豆不溶性膳食纤维。通过动物实验,得到的结果说明：1)长期摄入HCIDF能有效预防高脂饮食引起的小鼠体重增加；2)摄入大豆不溶性膳食纤维,可以调节血清TC、TG、LDL和HDL水平,对高脂饮食引起的血清脂质代谢紊乱具有积极预防作用；3)摄入大豆不溶性膳食纤维可减少腹部和肾周脂肪重量,减少小鼠肝损伤；4)大豆不溶性膳食纤维(HCIDF)可以通过调控与脂肪代谢相关的基因表达水平来预防小鼠由高脂饮食引起的肥胖。(The invention discloses soybean insoluble dietary fiber, which is prepared by the following method, wherein soybean is subjected to peeling and degreasing, protein extraction and separation to obtain wet soybean dregs, extrusion dehydration, starch hydrolysis, protease hydrolysis, water washing, filtration and freeze drying to obtain the soybean insoluble dietary fiber, and animal experiments prove that 1) the mouse weight increase caused by high-fat diet can be effectively prevented by taking the soybean insoluble dietary fiber for a long time, 2) the serum TC, TG, L D L and HD L levels can be regulated by taking the soybean insoluble dietary fiber, and the soybean insoluble dietary fiber has a positive prevention effect on the serum lipid metabolism disorder caused by the high-fat diet, 3) the mouse obesity caused by the high-fat diet can be prevented by taking the soybean insoluble dietary fiber to reduce the fat weight of the abdomen and the kidney periphery and reduce the liver injury of the mouse, and 4) the soybean insoluble dietary fiber (HCIDF) can be used for preventing the mouse obesity caused by the high-fat diet by regulating the gene expression level related to the fat metabolism.)

大豆不溶性膳食纤维及其应用

技术领域

本发明属于保健食品技术领域，具体涉及大豆不溶性膳食纤维及其应用。

背景技术

肥胖是由多种因素引起的慢性代谢疾病，例如高脂肪饮食（high fat diet,HFD），并且与许多代谢紊乱症有关，包括血脂异常，2型糖尿病，非酒精性脂肪肝和心血管疾病。随着社会科技和经济的发展，人们生活节奏的加快和膳食结构的改变引起高脂食物的过多摄入，导致世界上许多国家肥胖症的发病率和死亡率也随之不断升高，预防和治疗肥胖症己经成为21世纪的首要公共安全卫生问题。据报道，摄入来自全谷物，蔬菜和水果的膳食纤维可以降低肥胖和代谢疾病的风险，调节与控制代谢综合征相关的参数，从而改善葡萄糖稳态，脂质代谢等。肥胖已经是全世界范围内所关注的健康问题之一，长期摄入HFD会导致体重增加，肝脏脂质积聚。肝脏脂质积聚（主要是甘油三酯（TG））与脂肪酸合成和脂肪酸氧化水平有关。其中二酰甘油酰基转移酶1（diacylglycerol acyltransferase-1,DGAT1）、二酰甘油酰基转移酶2（diacylglycerol acyltransferase- 2, DGAT2）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearyl-coenzyme A dehydrogenase-1, SCD1）是甘油三酯合成关键酶。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptor-α,PPARα）在肝脏中高度表达，主要是通过增强其靶基因的表达促进β氧化，在代谢调节中起重要作用。肉碱棕榈酰转移酶1（carnitine palmtoyl transferase-1, CPT1）是PPARα的靶基因，可以将脂肪酸转运到线粒体基质中进行β氧化。因此，可通过调节机体脂质代谢相关基因的表达水平来预防和缓解肥胖。

豆渣是大豆加工过程中产生的副产物。豆渣的产量逐年增加，其中大部分来自中国，日本和韩国等亚洲国家。中国是大豆的主要生产国和最大消费国，每年生产约7000万吨豆渣。然而，豆渣的利用尚未完全最大化，大量的豆渣因高含水量、易腐性、不良风味和质地而被丢弃，从而导致严重的资源浪费和巨大的环境问题。

豆渣中含有丰富的营养物质，尤其是被誉为第七营养素的膳食纤维（dietaryfiber, DF），可占豆渣干物质的50-60%，其中不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber,IDF）占膳食纤维总量的90%以上。IDF中包括纤维素、木质素和大部分的半纤维素等，由于其特殊的结构性质，如疏松多孔、含有大量的-OH、-COOH等亲水基，使其具有良好的保健功能，包括促进肠道蠕动、降低血液胆固醇和调节血糖等作用。DF作为人体健康饮食框架中关键的营养素，在许多生理过程和预防不同代谢疾病中起着非常重要的作用。目前对膳食纤维一些研究的报道表明，充分补充膳食纤维，能够维持肠道菌群的平衡，降低血脂和胆固醇水平，同时维持人体内血糖的稳定，预防便秘及结肠癌的发病。由于人类的饮食水平不断地趋于精细化，导致饮食上膳食纤维的严重摄入不足，人们逐渐地意识到膳食纤维在饮食上的重要性，因此对膳食纤维进行开发已经成为目前研究的热点问题。

膳食纤维的提取方法主要有物理法、化学法、酶法和复合法等。国内外关于膳食纤维提取方法的研究报道，物理法：邵卓等通过超高压处理与高温蒸煮处理豆渣进而提高了可溶性膳食纤维的提取率。化学法：段振等通过碱法从石榴皮中提取不溶性膳食纤维提取率为30.42%；张君通过碱法从柚子皮中提取膳食纤维提取率为48.93%；刘倩倩等利用碱法从火龙果皮中提取不溶性膳食纤维提取率为30.29%；Ullah等碱法提取豆渣中不溶性膳食纤维提取率为33.3%。酶法：薛山通过酶法从漳州圣女果提取不溶性膳食纤维的提取率为59.4%；范道春等通过酶法从柚子皮中提取不溶性膳食纤维的提取率为57.5%；李刚凤等通过酶法从薇菜提取膳食纤维提取率为74.28%；张金堂等、Zhao、Daou等通过酶法提取不溶性膳食纤维，不溶性膳食纤维的品质较高。复合法：宋荣珍等通过酶法结合化学法从姜渣中提取不溶性膳食纤维的提取率为66.21%；杨秀芳等通过超声波辅助酶法从花椒籽中提取不溶性膳食纤维的提取率为68.15%。综上所述，物理方法不适合提取不溶性膳食纤维，化学方法对膳食纤维的品质影响较大、相对提取率较低。

发明内容

本发明为解决大豆副产品浪费的问题，而提供大豆不溶性膳食纤维及大豆不溶性膳食纤维干预脂肪酸合成通路的用途。

大豆不溶性膳食纤维，它是由下述方法制备的，它包括：

1）取大豆经过脱皮、脱脂，提取分离蛋白，得湿豆渣；

2）挤压脱水，得粗膳食纤维；

3）淀粉水解；

4）蛋白酶水解；

5）水洗，醇沉，过滤，冻干；

步骤3）所述的淀粉水解，它包括：步骤2）所得粗膳食纤维，加水，加入浓度为1.25g/5ml的热稳定α-淀粉酶液，搅拌，在95℃-100℃下震荡30~40min，冷却；

步骤4）所述的蛋白酶水解，它包括：调节pH至6.8~7.2，在55~65℃下水浴，加入浓度为0.125g/25ml的蛋白酶溶解液，震荡25~35min，边搅拌边加入3mol/mL乙酸溶液，调节pH至4~5，加入浓度为0.25g/12.5ml的淀粉葡糖苷酶酶解液，继续震荡25~35min；

步骤5）所述的水洗，是加入65~75℃的蒸馏水洗涤；所述的醇沉为乙醇沉淀。

大豆不溶性膳食纤维干预脂肪酸合成通路的用途。

本发明提供了大豆不溶性膳食纤维，它是由下述方法制备的，它包括：取大豆经过脱皮、脱脂，提取分离蛋白，得湿豆渣；挤压脱水；淀粉水解；蛋白酶水解，水洗，过滤，冻干，得大豆不溶性膳食纤维。通过大豆不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber fromsoybean, IDFS）干预高脂饮食（high fat diet, HFD）诱导的C57BL/6J小鼠，连续20 w，探究IDFS对小鼠血清和肝脏脂质代谢的影响。结果显示IDFS可抑制肥胖小鼠的体重增加，降低小鼠血清和肝脏甘油三酯，总胆固醇水平来减少脂肪的积累（P<0.05）。此外，IDFS干预后可下调肝脏中脂质合成相关基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）和甘油三酯合成相关基因二酰甘油酰基转移酶1（diacylglycerol acyltransferase-1, DGAT1）、二酰甘油酰基转移酶2（diacylglycerol acyltransferase-2，DGAT2）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearyl-coenzyme A dehydrogenase-1, SCD1）的表达（P<0.05），同时上调脂肪酸β氧化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activatedreceptor-α, PPARα）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A（carnitine palmtoyl transferase-1a,CPT1a）和产热相关基因解偶联蛋白2（uncoupling protein, UCP2）的表达（P<0.05）。研究结果表明IDFS对HFD诱导小鼠脂质代谢具有调节作用，可以作为一种预防肥胖的潜在膳食补充剂。结果说明：1）长期摄入HCIDF能有效预防高脂饮食引起的小鼠体重增加，同时对机体食欲并无显著影响；2）摄入大豆不溶性膳食纤维，可以调节血清TC、TG、LDL和HDL水平，对高脂饮食引起的血清脂质代谢紊乱具有积极预防作用；3）摄入大豆不溶性膳食纤维可减少腹部和肾周脂肪重量；4）摄入大豆不溶性膳食纤维，可以减少小鼠肝损伤；5）大豆不溶性膳食纤维（HCIDF）可以通过调控与脂肪代谢相关的基因表达水平来预防小鼠由高脂饮食引起的肥胖。

附图说明

图1 不同加酶量对蛋白质水解程度的影响；

图2 不同酶解温度对蛋白质水解程度的影响；

图3 不同的酶解pH值对蛋白质水解程度的影响；

图4 不同的酶解时间对蛋白质水解程度的影响；

图5 HCIDF对HFD诱导小鼠、体重、摄食量、卡路里摄入量的影响；(a)体重，(b)摄食量，(c)卡路里摄入量；

图6 HCIDF对HFD诱导小鼠血清指标的影响结果；(a)总胆固醇; (b)甘油三酯；(c) 高密度脂蛋白；(d)低密度脂蛋白；

图7 HCIDF对HFD诱导小鼠肝脏指标的影响结果；(a)总胆固醇; (b)甘油三酯；

图8 HCIDF对HFD诱导小鼠肝脏系数的影响；

图9 HCIDF对小鼠肝脏病理学形态的影响（×200）；

图10 HCIDF对HFD诱导小鼠肝脏影响；（a）甘油三酯合成相关基因；（b）脂质代谢相关基因表达。

具体实施方式

实施例1 高纯度大豆不溶性膳食纤维的制备

一、粗膳食纤维制备

取大豆经过脱皮、脱脂，提取分离蛋白，得到湿豆渣，此时豆渣的水分为80~90%；将湿豆渣放入121℃、20~30min进行灭菌（由于豆渣的保水性较强，在适宜的温度下特别适合微生物的繁殖）；灭菌后的豆渣放入12 Mpa的脱水机中进行挤压脱水，脱水后豆渣的含水量为70~80%；脱水后的豆渣放入温度控制在150℃的闪蒸干燥机内，进行干燥，干燥后豆渣的温度为35℃，此时含水量为5~10%；干燥后的豆渣经粉碎放入干燥器内干燥，得到粗膳食纤维（LCDF）；

二、淀粉水解

取5g粗膳食纤维，置于1000mL的锥形瓶中，加入蒸馏水250mL；加入0.5mL热稳定α-淀粉酶液（1.25g/5ml），缓慢搅拌，加盖铝箔，置于95℃-100℃恒温震荡水浴箱中持续震摇，当温度达到95℃开始计时，反应35min，将锥形瓶取出，冷却至60℃，打开铝箔盖，用刮勺轻轻将附着于锥形瓶内壁的胶状物刮下到液体中，用少量水进行冲洗瓶壁，防止浪费；

三、蛋白质水解

调节溶液pH至7.0±0.02，置于60℃水浴中，向锥形瓶中加入1.5mL蛋白酶溶解液（（0.125g/25ml）），盖上铝箔，持续震摇，反应30min；打开铝箔盖，一边搅拌一边加入50mL3mol/mL乙酸溶液，温度保持在60 ℃，用6 mol/L NaOH或6 mol/L HCl溶液调节试样液pH至4.5±0.02，边搅拌边加入2mL淀粉葡糖苷酶酶解液（0.25g/12.5ml），盖上铝箔，继续于60℃水浴中持续震摇，反应30min；

三、脱色干燥

酶解完成后，加入预热好的70℃的蒸馏水，静止1.5-2.0h，待溶液澄清，进行离心3500r，离心10min。然后进行醇沉。抽滤，挥发乙醇，进行冻干，得到高纯度大豆不溶性膳食纤维（HCIDF）。

实施例2 蛋白质水解优化实验

1、单因素实验

利用中性蛋白酶对LCDF中的蛋白质进行水解，主要影响因素有酶用量、酶解温度、酶解pH值和酶解时间。以上四个因素作为单因素试验，分别探讨酶用量（1000，1500，2000，2500和3000 U/g），酶解温度（45、50、55、60和65℃），酶解pH值（5.5、6.0、6.5、7.0和7.5）和酶解时间（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h），作L₉（3⁴）的正交试验，蛋白质去除率为指标，方差分析找出最优的水解条件。在单因素试验中对其中一个因素讨论时，其余的各个因素取值分别为：酶用量为2500 U/g、酶解温度为60℃、酶解pH值为7.0和酶解时间为2.0 h。蛋白质去除率计算公式如下：

式中：W ₀— 酶解后HCIDF中蛋白质的含量；W— LCDF中蛋白质的含量。

结果如下：

1）不同的加酶量与LCDF中蛋白质去除率的关系如图1所示，加酶量为1000 U/g到2500U/g时，蛋白质的水解程度增加较快，但是在2500 U/g到3000 U/g时，蛋白质的水解程度趋于缓慢。酶对底物水解程度的强弱取决于底物浓度，当两者之间达到饱和时，即便增加酶的添加量，也不会增大蛋白质的水解程度。所以本试验所选取中性蛋白酶的添加量分别为2000、2500、3000 U/g进行正交试验。

2）不同酶解温度与LCDF蛋白质水解程度的关系如图2所示，在45℃到60℃的范围内蛋白质的水解程度不断地增强，当温度达到60℃时，蛋白质的去除率为78.82%，但是随着温度大于60℃时，蛋白质的水解程度有所下降。这是因为中性蛋白酶在最适温度时酶的活性最强，温度过高或者过低，中性蛋白酶的活性均会下降或失活。所以本试验所选取中性蛋白酶的酶解温度分别为55、60、65℃进行正交试验。

3）酶解pH值与LCDF蛋白质去除率的关系如图3所示，在pH为7.0时中性蛋白酶对蛋白质的水解程度最强，当pH = 7时，蛋白质去除率为76.32%。当pH值小于或大于7.0时蛋白质的水解程度都会相应的下降。由于中性蛋白酶的最适pH值为7.0，因此对蛋白质的水解程度最强。所以本试验所选取中性蛋白酶的酶解pH分别为6.0、6.5、7.0进行正交试验。

4）酶解时间与LCDF蛋白质去除率的关系如图4所示，在0.5 h到2.0 h范围内蛋白质的水解程度不断地增强，随着时间的增加，蛋白质的水解程度趋于平稳。这可能是由于随着酶解时间的延长，酶被消化完全进而蛋白质的水解程度趋于稳定。所以本试验所选取的中性蛋白酶的酶解时间分别为1.5、2.0、2.5 h进行正交试验。

2、中性蛋白酶酶解LCDF中蛋白质的正交试验

在单因素试验的基础上，以蛋白质的去除率为指标，设计了四因素三水平的L₉（3⁴）正交试验。

由方差分析如表2结果表明，加酶量（A）和酶解温度（B）差异极显著（p < 0.01），酶解pH值（C）差异显著（p < 0.05），酶解时间（D）差异不显著（p > 0.05）。各因素对酶解效果的影响大小为：酶解温度（B）> 加酶量（A）> 酶解pH值（C）> 酶解时间（D），温度的变化对中性蛋白酶酶活的影响较为敏感，所以酶解温度对酶解效果的影响较大，中性蛋白酶在1.5h时，对底物的酶解已经达到极限，所以酶解时间对酶解效果的影响最小。由正交试验结果表明，最优的组合为A₂B₂C₃D₃，按最优组合进行验证试验，结果与正交试验中5号的结果接近，因此选定5号的试验条件A₂B₂C₃D₁作为HCIDF提取纯化的最佳工艺条件。综上所述，酶解蛋白的最佳条件为：酶解温度60℃，加酶量2500 U/g，酶解pH值7.0，酶解时间1.5 h，在此条件下，蛋白质去除率达到79.74%，酶法从LCDF中提取纯化出HCIDF的纯度达到90.50%。

实施例3 大豆不溶性膳食纤维成分测定

粗膳食纤维和大豆不溶性膳食纤维的成分测定方法如下：

1）蛋白质含量的测定：参照食品安全国家标准GB 5009.5-2016测定。

2）淀粉含量的测定：参照食品安全国家标准GB/T 5009.9-2016测定。

3）灰分含量的测定：参照食品安全国家标准GB 5009.4-2016测定。

4）水分含量的测定：参照食品安全国家标准GB 5009.3-2016测定。

5）可溶性膳食纤维（SDF）、不可溶性膳食纤维（IDF）和总膳食纤维（TDF）含量的测定：参照食品安全国家标准GB 5009.88-2014测定。

结果如表3所示，LCDF含有蛋白质为15.40%，灰分为1.22%，水分为8.30%，淀粉为3.98%，总膳食纤维（TDF）为70.10%，其中不溶性膳食纤维（IDF）的含量为64.30%，可溶性膳食纤维（SDF）为5.80%；实施例1制备的高纯度大豆不溶性膳食纤维（HCIDF），大豆不溶性膳食纤维含量高于粗膳食纤维，也高于一些果渣中IDF的含量（见表3柑橘果渣）。

实施例4 大豆不溶性膳食纤维的辅助降脂功效实验

一、动物分组及饲养

选用C57BL/6J小鼠，适应性饲养7 d后随机分为5组：正常组（ND）、高脂组（HFD）、低剂量不溶性膳食纤维组（L-HCIDF）（250mg/kg）、中剂量不溶性膳食纤维组（M-HCIDF）（500mg/kg）、高剂量不溶性膳食纤维组（H-HCIDF）（1g/kg），每组10只小鼠，每笼饲养5只；

各组的动物饲料配比如表4，除正常组饲喂基础饲料外，其余实验组均饲喂高脂饲料，低、中、高剂量不溶性膳食纤维组每天灌胃处理；持续饲喂20w，摄食量及小鼠体重分别每天及每周进行监测记录；动物实验末期，将所有小鼠隔夜禁食12h，进行眼球采血，3500 rpm15 min离心后取上清备用；取肝脏、腹部脂肪、附睾脂肪及肾周脂肪，称重后-80℃条件储存。

二、体重和摄食量指标测定

实验过程中每周定时对各个小鼠进行称重并记录，精确到0.1 g。每次投放适量的食物，投放前对饲料进行称重，隔天称余下饲料的重量，计算每日食物摄入量。

结果：为了评估HCIDF对高脂饮食（HFD）诱导的小鼠体重和摄食量的影响，干预期间分别记录了每周体重和每日食物摄入量。如图5(a)所示，HFD组小鼠体重增加比ND组更快。补充HCIDF 12 w后，与HFD相比，L-HCIDF组、M-HCIDF组和H-HCIDF组小鼠体重增加均显着降低（p<0.05），且H-HCIDF组小鼠体重下降程度较大（p<0.001）。与ND组相比，HFD组食物摄入量显着减少（p<0.05），但该组能量摄入较高（p <0.05），就食物（图5b）和能量（图5c）摄入而言，HCIDF组和HFD组之间没有显着差异。由此可见，长期摄入HCIDF能有效预防高脂饮食引起的体重增加，同时对机体食欲并无显著影响。

三、血清中脂类指标的测定

分别用试剂盒测定小鼠血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG），高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）的含量，具体试验步骤参照试剂盒说明书。

结果：如图6所示，长期高脂饮食会导致血清中脂质代谢紊乱。与ND组相比，HFD组血清中TC（5.75 mmol/L）、TG（0.58 mmol/L）和LDL（2.16 mmol/L）水平显著升高（p<0.05），HDL（6.67 mmol/L）水平显著降低（p<0.05）。与HFD组相比，HCIDF组显著降低小鼠血清中TC（5.11 mmol/L）、TG（0.43 mmol/L）和LDL（1.36 mmol/L）水平（p<0.05），同时显著升高HDL（9.31 mmol/L）水平（p<0.001），并且H-HCIDF组优于L-HCIDF组和M-HCIDF组。实验结果表明，摄入HCIDF可以调节血清TC、TG、LDL和HDL水平，对高脂饮食引起的血清脂质代谢紊乱具有积极的预防作用。

四、肝脏中脂类指标的测定

把-80℃保存的小鼠肝脏（约100 mg）取出置于预冷的试管中，分别用试剂盒测定肝脏中TC和TG含量，具体实验步骤参照试剂盒说明书。

结果：如图7所示，高脂饮食导致小鼠肝脏TC（2.07 mmol/L）和TG（2.79 mmol/L）水平升高，与HFD组相比，M-HCIDF组（1.89 mmol/L）和H-HCIDF组（1.69 mmol/L）可显著降低小鼠肝脏中TC水平（p<0.05），同时与HCIDF的摄入量呈正相关。HCIDF组均可降低小鼠肝脏中TG水平，同时统计分析结果表明与HFD组相比，其具有显著性差异（p<0.05），其中M-HCIDF组（1.20 mmol/L）和H-HCIDF组（1.55 mmol/L）差异极显著（p<0.001）。此实验结果表明，摄入HCIDF对肝脏脂质代谢异常具有改善作用。

五、脏器指数

肝脏指数是指肝脏重量与小鼠体重的比值。脂肪指数是指脂肪（腹部脂肪/附睾脂肪/肾周脂肪）重量与小鼠体重的比值。

结果：由图8可知，与ND组相比，HFD组肝脏系数显著降低（p<0.01），可能是由于长期摄入高脂饮食导致体重增加。此外，与HFD组相比，HCIDF组肝脏系数显著降低（p<0.05），可能是由于摄入HCIDF能抑制肝脏脂肪堆积，减缓体重增长。同时，由表5 可知，与HFD组相比，HCIDF组脂肪系数显著降低（p<0.001），且H-HCIDF组优于L-HCIDF组和M-HCIDF组，存在剂量关系。此外，与HFD组相比，HCIDF组均显著减少腹部和肾周脂肪重量（p<0.05），缓解小鼠体内脂肪积累，对预防肥胖具有一定的积极作用。

六、HE染色

把小鼠肝脏（约 100 mg）浸于4%的多聚甲醛固定液中，常规石蜡包埋，石蜡切片，将石蜡切片进行苏木素-伊红（HE）染色。光学显微镜下从低倍到高倍依次观察肝脏组织病理变化。

结果：由图9可知，与ND组相比，HFD组的肝脏组织中脂肪空泡明显，有大量脂滴聚集，存在细胞肿胀和核消失的现象，说明长期高脂饮食引起了肝脏组织脂肪变性，有明显病变的特征。HCIDF组相比于HFD组，其肝脏组织中存在少数脂滴，细胞肿胀和核消失的现象有所缓解，且随着HCIDF摄入量增加，改善效果越好，说明摄入HCIDF能后减少肝脏脂滴聚集，减少非酒精性脂肪肝的患病风险。

七、肝脏组织中总RNA的提取及反转录

采用Trizol法提取肝脏组织中总RNA，称取肝脏组织50 mg, 置于无RNA酶离心管内，加入1 mL Trizol试剂，用手持式匀浆机匀浆后，每管加入200 μL预冷的三氯甲烷，轻微震荡20 s，冰上静置15 min，4℃ 12000g离心15min，离心后可清晰看到分层，其中上清液层为RNA，下边两层为基因组和蛋白质，小心移取400 μL上清液至新的无RNA酶离心管中，向每管加入等体积异丙醇用来沉淀RNA，室温静置10 min，4℃ 12000g离心10min，离心后可在离心管底部观察到凝胶样沉淀，此沉淀即为RNA，弃去液体，沉淀用75%乙醇洗涤，静置5min，4℃8000g离心5min，弃去液体，沉淀用无RNA酶水溶解并测定其在260 nm和280 nm下吸光度的比值。根据测得浓度进行反转录制得cDNA于-20℃储存备用。将所得的cDNA取2μL于试管中，分别加入SYBR Green I染料12.5μL，上下游引物各1μL以及蒸馏水8.5μL进行PCR 扩增。各基因引物的上下游序列见表6。

结果：为了进一步探究摄入HCIDF对肥胖的潜在预防机制，研究了几种脂质代谢相关基因。如图10（a）所示，DGAT1，DGAT2和SCD1是甘油三酯合成过程中的关键酶，与ND组相比，HFD组小鼠肝脏中DGAT1，DGAT2和SCD1 mRNA表达水平显著升高（p<0.01）。此外，长期摄入HCIDF有助于改善HFD引起的甘油三酯合成紊乱，H-HCIDF组可显著下调DGAT1, DGAT2,SCD1 mRNA表达（p<0.05），降低甘油三酯合成速率。如图10（b），与ND组相比，HFD组FAS mRNA表达均显着增加（p<0.01），但在补充HCIDF后，H-HCIDF组FAS mRNA表达水平显著降低（p<0.001）。HFD组中CPT1a mRNA表达水平得到显着抑制（p<0.01）与ND组相比。在摄入HCIDF 20周后，PPARα，CPT1a mRNA表达以剂量依赖性方式恢复至正常水平且差异显著（p<0.05）。此外，同时，H-HCIDF组可以通过调节UCP2 mRNA表达来改善产热（p<0.01）。此实验结果说明，HCIDF可以通过调控与脂肪代谢相关的基因表达水平来预防小鼠由高脂饮食引起的肥胖。