阅读说明：本技术 在糖尿病足的情况下增强组织氧合的医药制剂及其用途 (Pharmaceutical preparation for enhancing tissue oxygenation in the case of diabetic foot and use thereof ) 是由 亚历山大·弗拉季斯拉沃维奇·特罗菲莫夫 弗拉基米尔·哈茨克列维奇·哈温松 奥列格·米哈伊洛维奇· 于 2017-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明提出了二肽L-谷氨酸-L-色氨酸(L-Glu-L-Trp)作为在糖尿病足的情况下通过抑制(减少合成)HIF-1α因子来增强组织氧合的试剂的新用途；一种医药制剂,包含作为活性剂的有效量的所述二肽L-Glu-L-Trp,和药用载体；以及一种治疗糖尿病足的方法,由以下组成：以每kg体重1.0-10.0μg的剂量、每天至少一次地局部给予所提及的包含二肽L-Glu-L-Trp的医药制剂,持续对达到治疗效果所必需的时间段。本发明的技术结果在于提供了一种肽制剂,其在两种糖尿病中均产生了抗缺氧效果。(The present invention proposes a novel use of the dipeptide L-glutamic acid-L-tryptophan (L-Glu-L-Trp) as an agent for enhancing tissue oxygenation by inhibiting (decreasing synthesis of) HIF-1 α factor in the case of diabetic foot, a pharmaceutical preparation comprising an effective amount of the dipeptide L-Glu-L-Trp as an active agent and a pharmaceutically acceptable carrier, and a method for treating diabetic foot consisting of topically administering the mentioned pharmaceutical preparation comprising the dipeptide L-Glu-L-Trp at a dose of 1.0-10.0. mu.g per kg body weight at least once per day for a period of time necessary for achieving a therapeutic effect.)

在糖尿病足的情况下增强组织氧合的医药制剂及其用途

技术领域

本发明涉及药物，并且在糖尿病并发症的情况下，特别是在糖尿病足(diabeticfoot)的情况下，本发明可用于增强组织氧合。

背景技术

在现代医学中，特别是在糖尿病学中，糖尿病并发症的治疗问题仍然充满挑战。根据世界卫生组织(World Health Organization)，确诊患有糖尿病的患者人数目前约为1.6亿人，而到2025年，具有这种诊断的患者人数预计将翻一番。糖尿病并发症之一是“糖尿病足”综合征。这种并发症表现为复杂的解剖和功能变化，这会导致组织缺血(缺氧)的发展，伴随着增加的足部软组织创伤和感染。

应当注意的是，这些并发症会导致患者早期残疾，并最终导致足部截肢和死亡。在糖尿病的情况下，组织缺血发展的基本机制在于HIF-1因子(特异性调节蛋白-缺氧诱导因子)的激活。HIF-1α因子的致病作用揭示了不仅可以纠正缺氧本身，还可以治疗糖尿病并发症(如“糖尿病足”)的可能性。因此，旨在通过抑制HIF-1α因子合成来激活软组织氧合的药理学疗法的发展是医学的重要任务，也是治疗糖尿病并发症的病理学途径。

已知一组具有抗缺氧效果、抑制特异性调节蛋白-缺氧诱导因子(HIF 1α)合成的医药制剂(药物配制品，医学制剂，medical preparations)：曲妥珠单抗(赫赛汀(herceptin))、吉非替尼、钙磷蛋白C(蛋白激酶C抑制剂)、渥曼青霉素(PI3K抑制剂)、PD98095(MAPK抑制剂)、雷帕霉素(西罗莫司，FRAP/mTOR抑制剂)、索拉非尼和舒尼替尼(多激酶抑制剂)、那可丁(诺司卡品，noscapin)(参见Nilsson M.B.,Zage P.E.,Zeng L.etal.Multiple receptortyrosine kinases regulate HIF-1α and HIF-2α innormoxiaand hypoxia in neuroblastoma:implications forantiangiogenicmechanisms of multikinase inhibitors//Oncogene.—2010.—Vol.29.—P.2938–2949；Y.S.Chang,L.Adnane,A.Henderson et al.Sorafenib(bay43–9006)inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor necrosis inthe human rcc xenograft model,786-o//Clin.Cancer.Res.—2005.—Vol.11.—Р.9011；Zhang H.,Qian D.Z.,Tan Y.S.et al.Digoxin and other cardiac glycosidesinhibit HIF-1synthesis and blocktumor growth//PNAS.—2008.—Vol.105,N 50.—P.19579–19586；Newcomb E.W.,Lukyanov Y.,Schnee T.etc.Noscapineinhibitshypoxia-mediated HIF-1alpha expression andangiogenesis in vitro:a novelfunction for an old drug//Int.J.Oncol.—2006.—Vol.28,N 5.—P.1121–1130)。

上述制剂具有不同程度毒性的缺点，其表现在以下副作用的发展中：高血压、凝血系统失调(障碍，紊乱，disorders)、心脏功能不全、胃肠道(恶心、呕吐和腹泻)、神经性(虚弱、头痛)和皮肤病症状(皮疹)，如Llovet等人所述(参见J.M.Llovet,S.Ricci,V.Mazzaferro et al.Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma//N.Engl.J.Med.—2008.—Vol.359.—P.378–390)。

专利US 5811399(1998年9月22日公开)公开了由于肽合成而产生的二肽L-Glu-L-Trp。

名为“Thymogen”(二肽L-Glu-L-Trp)的医药制剂已在俄罗斯联邦(RussianFederation)被批准用于治疗用途(注册号R N 002408/01)并且已被列入俄罗斯药典(Russian Pharmacopoeia)中，已知该医药制剂显示出免疫调节活性，并且影响细胞和体液免疫反应以及全身的非特异抗性(耐受性，resistance)(参见1996年7月23日公开的专利US5538951)。然而，所述二肽的已知活性表征了免疫调节作用，这不是该肽在胰岛素依赖型和非胰岛素依赖型糖尿病的情况下抑制HIF-1α因子的合成并增强组织氧合的能力的明显和一致的表现，并且该已知活性未定义其临床应用的具体适应症。下文提供的二肽L-Glu-L-Trp在糖尿病并发症的情况下、特别是在糖尿病足的情况下增强组织氧合的抗缺氧作用的实施例，客观地证实了在其已知能力和请求保护的能力之间缺乏关联性。

因此，本发明的一个目的在于提供一种肽医药制剂，该肽医药制剂发挥抗缺氧作用，并能够在糖尿病并发症的情况下、且特别是在糖尿病足的情况下，通过抑制HIF-1α因子合成来增强组织氧合。

发明内容

该目的通过以下达到的：在糖尿病足的治疗中使用二肽L-Glu-L-Trp作为通过抑制(减少合成)HIF-1α因子来增强组织氧合的试剂(工具，手段，means)。

该二肽可以通过在溶液中合成肽的标准方法获得，如例如专利US 5538951(1996年7月23日公开)中所述。

本发明的另一个方面是一种医药制剂，其用于在糖尿病足的治疗中通过抑制(减少合成)HIF-1α因子来增强组织氧合，该医药制剂包含有效量的作为活性剂的二肽L-Glu-L-Trp和药用载体。

本文所用的术语“医药制剂”是指包含二肽的不同药物衍生物的任何配制品(配方，formulation)的使用，这些药物衍生物对于必需增强组织氧合的糖尿病并发症的治疗发挥治疗作用。

本文所用的术语“有效量”是指根据活性剂的活性和毒性的定量值以及基于本领域技术人员的知识，该活性剂的使用量在给定的配制品中必须是有效的。

在一些实施方式中，二肽L-Glu-L-Trp可以以本领域中技术人员所熟知的化学修饰(例如不同的盐和其它衍生物)的形式使用。

为了获得根据本发明的药物组合物，根据药物学中使用的复配(混合，调制，组合，compounding)技术，将作为活性成分的二肽L-Glu-L-Trp或其药用衍生物与药物载体混合。

载体可以采取不同的形式，这取决于需要给药至体内的药物配制品(药物制剂，drug formulation)，例如，肠胃外、鼻内、口服或局部(例如，以敷料(applications)或软膏的形式)。

任何已知的药物组分可用于以口服或局部给药的优选剂型制备组合物。

对于肠胃外(鼻腔内)给药，载体通常包括无菌水，尽管也可以包括促进稳定性或保持无菌性的其它成分。

在本发明的优选实施方式中，所提出的医学制剂以药物制剂的形式用于局部给药。

对于局部给药，载体包含水溶液，例如，生理盐水。

在本发明的一个优选的实施方式中，药用载体是生理盐水。

根据本发明，当以每kg体重1.0-10.0μg的剂量给药时，二肽是有活性的，尽管基于疾病的严重程度和病程也可以使用较低(较高)的剂量。

本发明还提供了一种在需要这种刺激的人或动物中增强氧合过程的方法，特别是一种在治疗糖尿病足时通过抑制(减少合成)HIF-1α因子来增强组织氧合的方法。

根据本发明，一种在糖尿病并发症的情况下、特别是在糖尿病足的情况下增强氧合过程的方法，由给予医药制剂组成，该医药制剂包含有效量的作为活性剂的二肽L-Glu-L-Trp，以及药用载体，剂量为每kg体重1.0-10.0μg，每天至少一次，持续达到治疗效果所必需的时间段。

通过抑制特异性调节蛋白-缺氧诱导因子(HIF 1α)的合成来实现增强氧合过程，针对胰岛素依赖型和非胰岛素依赖型糖尿病的情况，这致使组织氧合增强。

在本发明的一个实施方式中，根据疾病的性质和严重程度，达到治疗效果所必需的时间段为10至40天。

依据下面给出的几个实施方式，本发明将变得清晰。

具体实施方式

本发明通过以下示出：具有式L-谷氨酸-L-色氨酸(L-Glu-L-Trp)的二肽的合成实施例(实施例1)，测试该二肽的毒性和生物活性的实施例(实施例2、3)，以及证明其药物性质并确认达到治疗效果的可能性的二肽临床给药结果的实施例(实施例4、5)。

应当注意的是，后续描述的这些实施方式仅是示例性的实施方式，而非详尽的实施方式。

实施例1

R’-Glu-Trp-R”的合成

方便地，二肽R’-Glu-Trp-R”是通过现在普遍可用的多种自动化技术中任一种合成的。一般来说，这些技术涉及通过连续添加氨基酸以产生逐渐增大的分子的逐步合成。氨基酸通过一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的基团之间的缩合反应而连接在一起，从而形成肽键。为了控制这些反应，必需阻断一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基。

应当选择容易去除而不会不利地影响肽的阻断基团(保护基团，封闭基团，blocking group)，即，通过外消旋作用或通过形成的肽键的水解。带羧基的氨基酸(例如，Asp、Glu)或带羟基的氨基酸(例如，Ser、高丝氨酸、和Tyr)也需要在缩合之前阻断。存在多种方法用于肽合成，通常优选的是固相合成。在这一程序中，一种氨基酸与树脂颗粒结合，并通过将受保护的氨基酸连续添加至生长链上，逐步生成肽。通常使用Merrifield所述的技术(参见Merrifield,R.В.，J.Am.Chem.Soc.96:2989-2993(1964))的改良。

在示例性的自动固相方法中，通过将羧基末端氨基酸加载至共价连接到与二乙烯基苯交联的不溶性聚苯乙烯树脂的有机连接体(例如，РАМ、4-氧甲基苯乙酰氨甲基)上。带t-Boc的封端用于保护末端胺，通常用邻苄基阻断羟基和羧基。在自动肽合成仪(AppliedBiosystems,Foster City,Calif.，例如，型号430-A)中完成合成。合成后，可根据既定方法从树脂中移除产物，并使用氢氟酸或三氟甲基磺酸除去阻断基团(参见Bergot,B.J.,McCurdy S.N.,Applied Biosystems Bulletin(1987))。

常规合成可制备0.5毫摩尔的肽树脂。断裂和纯化后的产率约为60至70％。例如，Glx活化酯的氨基和侧链保护的衍生物与侧基保护的Trp反应，在其C端连接至固相。在消除α-氨基保护基后，可从固相或以类似方式添加的另一个氨基酸上断裂该肽。以类似方式连续添加其它氨基酸。然后用通常也会去除保护基团的酸断裂该肽。然后，这些肽可以被分离、冻干以及储存以供将来使用。Stewart J.M.,Young J.D.Solid phase peptidesynthesis,第2版,1984和Tam,et al.,J.Am.Chem.Soc.105:6442,1983中详细描述了肽合成的合适技术，两者均通过引用并入本文。

产物肽的纯化是通过以下进行的：例如，从有机溶剂如甲基乙基醚结晶该肽，然后溶解在蒸馏水中，并渗析(dialysis)(如果肽的分子量大于约500道尔顿)，薄层色谱、凝胶色谱、冻干或反向高效液相色谱(例如，使用含0.1％三氟乙酸和乙腈作为溶剂的C18柱)(如果肽的分子量小于500道尔顿)。将纯化的肽冻干，以干燥状态保存直至使用。典型的R’-Glu-Trp-R”药物制剂是纯化的二肽L-Glu-L-Trp，其包含白色粉末(如果冻干；否则，其会结晶)，溶于水、DMF；不溶于氯仿和醚。[α22_D＝+12.6；C＝0.5Н₂О。Rf＝0.65(丁醇:乙酸:水＝3:1:1)。UV(275±5nm，max)。NMR(500MHz)：0.001mol/l肽溶液，Trp(3.17；3.37；4.57；7.16；7.24；7.71；7.49)；Glu(1.90；1.96；2.21；3.72)]。

通常，谷氨酸的活化酯的氨基和侧链保护的衍生物与受保护的L-色氨酸反应。在消除保护基团和常规纯化后，例如，通过薄层色谱或GL色谱，该肽可以通过例如冻干、凝胶纯化等被纯化。

实施例2二肽L-谷氨酸-L-色氨酸(L-Glu-L-Trp)的毒性研究

根据“Guidelines for preclinical assessment of safety ofpharmacological preparations(GLP)”进行二肽L-谷氨酸-L-色氨酸(L-Glu-L-Trp)的一般毒性研究，并按照欧洲指令(European Directive)86/609/EC(5欧洲共同体理事会。1986年11月24日关于成员国关于保护用于实验和其它科学目的的动物的法律、法规和行政条款的理事会指令86/609/EEC。欧共体以外地区L358:1–28)饲养所有动物。

实验方案被St.Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology(Russia)的Commission on Humane Treatment of Animals批准。

该研究旨在确定制剂的可耐受毒性剂量、评估生物体各种器官和组织中病理变化的程度和性质、以及确定毒性效应对制剂给药剂量和给药持续时间的依赖性。

使用Kerber’s方法确认二肽L-Glu-L-Trp的急性毒性。该研究对60只体重为20-25g的白色雄性杂交小鼠进行，这些小鼠根据标准方案进行饲养，并在饲养箱中接受标准营养。随机将动物分为6等组，每组10只小鼠。将该制剂给予动物一次，肌内注射，体积为0.25ml，剂量为1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg(超过推荐用于临床研究的治疗剂量的几千倍)。给予对照组动物等体积的生理盐水。

在72小时和之后的14天内，任一组中均未发生动物死亡。未观察到动物的一般状态、行为、运动活动、头发和皮肤、肠道和膀胱功能的变化。

因此，以超过治疗剂量(临床研究推荐的剂量)几千倍的剂量，二肽L-Glu-L-Trp不会产生急性毒性反应，这表明制剂具有很宽的安全裕度。

二肽L-Glu-L-Trp的亚急性毒性的研究对60只体重为150-250mg的白色杂交大鼠上进行。实验组的动物接受肌内注射制剂90天，在0.5ml的生理盐水中的剂量为1μg/kg、0.3μg/kg、3μg/kg。对照组动物接受相同体积的生理盐水。

在整个研究期间，每天对动物进行观察。监测动物的行为、食物和水的消耗、毛发状态和粘膜。这些动物每天都进行称重。在给予制剂之前，在给予制剂开始后第30天、第60天和第90天研究动物外周血的形态组成和性质。实验完成后，研究血液生化性质和凝血指数。

通过长期给药至体重为150-250mg的大鼠，研究由本发明的方法获得的二肽L-Glu-L-Trp的慢性毒性。每天将制剂肌内给予动物，在0.5ml生理盐水中的剂量为1μg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg，持续6个月。

监测动物行为、食物和水消耗、毛发状态和粘膜。在实验的前3个月期间，这些动物每天都进行称重，然后每个月一次。给药开始后3个月以及实验一经完成，即进行血液学和生物化学研究。评估心血管系统、肝、胰腺、肾和肾上腺的功能。在制剂给药完成后，对一些动物进行病理形态学研究，以评估大脑和脊髓、心脏、主动脉、肺、肝、肾、内分泌和免疫系统器官不同部位的状态。

对动物的一般状态、外周血形态和生化指标、内部器官的形态状态、心血管和呼吸系统的状态、肝和肾功能的评估未显示出该生物体的任何病理变化。

二肽L-Glu-L-Trp的急性和非急性毒性研究指出，以超过治疗剂量100-1000倍的剂量长期给予制剂不会产生副作用。

实施例3：针对链脲佐菌素(streptozotocin)诱导的糖尿病的情况，二肽L-Glu-L-Trp对氧合激活及由此对软组织创面愈合的影响(治疗)

实验对30只Wistar系雄性大鼠群进行。链脲佐菌素模型是最适合用于创面愈合研究的模型之一，其允许准确量化愈合创面的主要方面，例如创面闭合、表皮再植(再上皮化，reepithelialization)和GT(肉芽组织)形成(参见Hirsch T.,Spielmann M.,ZuhailiB.et al.Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healingmodel//BMC Surgery.–2008.–Vol.8(5).–P.1-8和Mendes J.,Leandro C.,BonaparteD.et al.A Rat Model of Diabetic Wound Infection for the Evaluation of TopicalAntimicrobial Therapies//Comparative Medicine.–2012.–Vol.62(1).–P.37-48)。切除伤口模型可对涉及伤口愈合的机制进行最广泛的评估，包括上皮形成、肉芽化(granulation)和血管生成(参见Wong V.W.,Sorkin M.,Glotzbach J.P.,Longaker M.T.,Gurtner G.C.Surgical approaches to create murine models of human woundhealing//J Biomed Biotechnol.–2011:969618.；Toker S.,Gulcan E.,Cayc M.K.,OlgunE.G.,Erbilen E.,Ozay Y.Topical atorvastatin in the treatment of diabeticwounds//Am J Med Sci.–2009.–Vol.338.–P.201–204；以及Tsuboi R.,RifkinD.B.Recombinant basic fibroblast growth factor stimulates wound healing inhealing-impaired db/db mice//J Exp Med.–1990.–Vol.172.–P.245-251)。

将大鼠饲养在控制湿度(50％至70％)和温度(20至22℃)的房间中的微隔离笼中，14:10h的光:暗周期，并可以自由食用粒状啮齿动物食物(RM3,Special Diet Systems,Essex,UK)和过滤消毒水。根据Good Laboratory Practice(GLP)Guidelines对动物进行饲养，并根据欧洲指令86/609/EC对所有动物进行饲养。

实验方案被St.Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology(Russia)的Commission on Humane Treatment of Animals批准。

随机将动物分为两组—对照组(n＝15)和实验组(n＝15)。实验病理通过以60mg/kg的剂量腹膜内一次给予链脲佐菌素(Sigma,US)而在实验组和对照组动物中形成。

为了确定糖尿病及其晚期并发症的生化和组织学表现，对所有动物进行了动态研究(评估外周血葡萄糖和网织红细胞)，并且还进行组织学研究。二肽L-Glu-L-Trp对组织氧合激活的影响通过免疫组织化学研究来评估。该方法能够分析对照组和实验组动物组织中的HIF-1α蛋白含量。

用血糖仪OneTouch Horizоn(“Lifescan”,US)测量外周血(尾静脉)中的葡萄糖浓度。线性测量范围为1.1-33.3mmol/l。网织红细胞计数是在试管中用现成的染料-亮甲酚蓝(Diachem-HemiStain-RTC)染色后，采用统一的技术进行(试管中的体外活体染色法)。

取对照组和实验组动物的皮肤组织用于组织学和免疫组织化学研究。将该材料在10％中性***溶液中固定24小时，并使用标准技术将其包埋在石蜡中。然后产生5-7μm厚的切片，将其用苏木精和曙红染色以进行组织学研究。组织学制剂的形态学研究通过光学显微镜CarlZeiss(Germany)进行。

免疫组织化学研究包括对HIF-1α因子表达的确认(鉴定，识别，identification)。在切片机上切割获得的石蜡块。将切片脱蜡(除去石蜡)。将抗HIF1α的原代兔多克隆抗体以1:100的稀释度施涂在切片上，并在+4℃的潮湿室内温育过夜。然后在室温下在潮湿室内用生物素化的山羊抗兔抗体(稀释度为1:200)处理切片30分钟。然后漂洗，并使用一种通用的亲和素-生物素复合物体系(ABC,Vector Laboratories,Inc,USA)，并在室温下静置以温育30分钟。二氨基联苯胺试剂盒(DAB Substratekit,VectorLabs,USA)用于观察抗体和抗原之间的结合反应。通过数码相机ProgressCT1(“Jenoptic”,Germany)进行显微照相。使用形态计量站分析制剂，这可以通过以标准光密度单位表示的免疫反应强度来定量基因产物的表达。形态计量站包括光学显微镜OlympusCX1(Japan)、数码相机ProgressCT1(“Jenoptic”,Germany)和装有Videotest Master Morfology软件的IBM PC。使用Videotest Master Morfology软件对免疫阳性细胞的数量进行计数。

研究表明，5周后，所有动物均确认出现糖尿病的临床体征，这表明与初始指数相比，其自身的血糖浓度在统计学上显著升高(超过4倍)(参见表1)。

表1

雄性大鼠外周血中的葡萄糖浓度动态

*р<0.05-与对照组和实验组的初始指标相比，差异具有统计学显著性

针对糖尿病的临床体征的情况，于第5周在所有动物中建立软组织病变模型。通过腹膜内注射盐酸赛拉嗪(10mg/kg)和盐酸***(25mg/kg)麻醉所有糖尿病大鼠。为了这一目的，将对照组动物和实验组动物的毛发在股骨软组织区域剃除，并切成1.0cm长和0.3cm深的切口。用Kocher’s镊子夹碎软组织(肌肉、皮下组织)，然后缝合皮肤。72小时后，取出缝合线，并用3％过氧化氢溶液治疗损伤。

在软组织损伤模型建立后72小时，每天将二肽L-Glu-L-Trp肌内给予实验组动物，每天一次，每次注射剂量为100μg(1.0mg)，持续10天。在同一时间以类似的方式将生理盐水给予对照组动物。

众所周知，特异性调节蛋白-缺氧诱导因子(HIF-1α)是缺氧的可靠标志物。当人体血液和组织上的氧气负荷减少时，该因子的活性就会增加。已显示该因子在机体对缺氧的全身响应中起关键作用(参见Semenza G.L.Regulation of oxygen homeostasisbyhypoxia-inducible factor 1//Physiology(Bethesda).—2009.—Vol.24.—P.97-106)。从表2中可以看出，针对糖尿病临床体征的情况，在研究的第5周，所有动物中均发生了HIF-1α因子表达的可靠增加。HIF-1α因子负责形成长期适应低氧的基础。因此，组织中HIF-1α的大量积累表明了实验组动物的组织缺血。

然而，到第11周，在实验组的二肽L-Glu-L-Trp的作用下，HIF-1α表达水平证明可靠地低于对照组。获得的数据证明了二肽L-Glu-L-Trp增强组织氧合的能力。

表2

大鼠皮肤组织中的HIF-1α表达动力学

*р<0.05-与对照组和实验组的初始指数相比，差异具有统计学显著性。

#р<0.05-与对照组的各指数相比，差异具有统计学显著性。

众所周知，针对慢性糖尿病的情况，组织中会发生缺氧。缺氧会增强组织中的HIF-1α表达，从而触发响应生理反应，例如血管生成、红细胞生成以及年轻红细胞和网织细胞向全身血液循环的释放(参见Semenza G.L.Hypoxia-inducible factor 1:masterregulator of O2 homeostasis//Bioch.Pharmacol.–1998.–Vol.8.,N.5.–P.588-594；和Semenza G.L.Involvement of oxygen-sensing pathways in physiologic andpathologic erythropoiesis.//Blood.–2009.–Vol.114,N.10.–P.2015-2019)。已证明了氧化应激下外周血中的网织红细胞水平会反映组织缺氧的程度(参见Wu K.,HuanY.Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats//Curr ProtocPharmacol.–2008,Mar.–第5章:第5.47单元–P.1-14；Chen D.,Wang M.W.Development andapplication of rodent models for type 2 diabetes//Diabetes Obes.Metab.–2005.-Vol.7,№4.–P.307-317；以及Srinivasan K.,Ramarao P.Animal models in type 2diabetes research:an overview//Indian J.Med.Res.–2007.-Vol.125,№3.–P.451-472)。

从对实验组链脲佐菌素诱导的糖尿病建模11周后，确认在对照组的所有动物中网织红细胞水平在统计上显著增加，这是组织缺氧的征兆。然而，在二肽L-Glu-L-Trp的作用下，实验组中的网织红细胞水平证明可靠地低于对照组(表3)。所获得的数据指出，二肽L-Glu-L-Trp激活组织中的细胞代谢过程，并对氧化应激水平和组织氧合增强发挥调节作用。

表3

雄性大鼠外周血中的网织红细胞含量的动态

*р<0.05-与对照组和实验组的初始指数相比，差异具有统计学显著性。

#р<0.05-与对照组的各个指数相比，差异具有统计学显著性。

组织学研究数据证实到第11周时变化的存在，这是糖尿病病理学的典型特征。在实验组和对照组动物中，从组织学上确认了微血管病变的典型体征，这些体征是糖尿病晚期并发症的特征。在所有动物中均观察到伴有轻度血管周围硬化以及小动脉壁硬化的增生性(productive)毛细血管炎。然而，这些体征在实验组动物中不如在对照组中明显，这间接证明了组织氧合的增强。此外，还确定了血管周围淋巴组织细胞浸润，这在对照组中为重度至中度，在实验组中为轻度。在对照组和实验组中，淋巴组织细胞浸润部分影响到神经周围区域。此外，对照组显示出明显的轴突变性、脱髓鞘和局灶性轴索坏死。营养障碍引起两组皮肤(真皮，derm)营养不良。但是，对照组动物的皮肤表现出比实验组动物显著更明显的角化过度和棘皮症，在某些情况下，该过程涉及皮肤附属物(毛囊、皮脂腺和汗腺)。

二肽L-Glu-L-Trp对组织氧合过程的正面作用有助于加快软组织损伤的愈合从而缩短再生时间，引起损伤处肉芽组织的出现、边缘上皮形成或完全上皮形成(表4)。

表4

针对链脲佐菌素诱导的糖尿病的情况，二肽L-Glu-L-Trp对软组织损伤愈合的影响

因此，第11周的研究结果显示，接受肽的实验组中损伤的全上皮形成超过对照组中相同指数3.2倍。另外，在观察的第11周，5只对照组动物中没有发现损伤表面再生的体征。

本发明的二肽的临床研究的以上实施例证明了其药理能力，并证实了实践本发明的可能性。

实施例4在患有胰岛素依赖型糖尿病的患者的“糖尿病足”治疗中给予二肽Thymogen L-Glu-L-Trp的疗效

监测35位患有胰岛素依赖型糖尿病的患者。所有患者均患有糖尿病10-23年，他们的年龄为25至49岁，平均体重为80kg。到检查时，糖尿病得到治疗，所有患者都接受了必要剂量的胰岛素。在所有患者中都确认了“糖尿病足”的神经缺血形式。患者报告了水肿、疼痛、足部易疲劳。皮肤检查显示色素沉淀、皮肤干燥、角化过度、降低的触觉灵敏度。在35位患者中，这一疾病处于病理过程的初始阶段-没有出现皮肤损伤。

随机将患者分成两个组。第一组-对照组(17位受试者)接受胰岛素依赖型糖尿病的基本治疗，第二组-主要组(18位受试者)除基础治疗外，每天还接受肌内注射二肽Thymogen L-Glu-L-Trp，200.0μg，每天2次，即每天的剂量是5μg每kg体重(400.0μg/80kg)，持续20天(每个疗程8.0mg)。

二肽Thymogen L-Glu-L-Trp对糖尿病的并发症“糖尿病足”的临床过程的影响，以及其对组织氧合水平的影响(根据人血浆中蛋白HIF-1α浓度的水平)评价两次—在研究开始时以及在监测结束的第二天，即在第21天。使用酶免疫分析法(EIA)，使用A.Levina等人的技术来评价HIF-1α水平(参见Levina A.A.,Makeshova A.B.,Mamukova Yu.I.,RomanovaE.A.,Sergeeva A.I.,Kazyukova T.V.Oxygen homeostasis regulation.Hypoxiainduced factor(hif)and its role in oxygen homeostasis//Paediatria.–2009.–Vol.87,№4.–p.92-97(rus.))。10位未患糖尿病的健康志愿者作为补充对照组参与，抽取他们的静脉血两次—在研究的第一天和第21天，用于测定血浆中HIF-1α蛋白浓度水平。

从表5中可以看出，患糖尿病的患者血浆中的蛋白HIF-1α浓度值可靠地更高，这是组织缺血的证据。最初，在对照组和主要组之间没有观察到这一指标的可靠差异。然而，与对照组相比，针对L-Glu-L-Trp Thymogen二肽效果的情况，主要组患者的血浆中显示HIF-1α蛋白浓度的可靠降低。所获得的数据证明，在糖尿病的并发症，特别是糖尿病足的情况下，本发明的物质具有增强组织氧合的能力。

表5

二肽Thymogen L-Glu-L-Trp对血浆中HIF-1α含量的影响

#р<0.05-与健康受试者的指数相比，差异具有统计学显著性。

*р<0.05-与初始指数相比，差异具有统计学显著性。

表6

“糖尿病足”综合征的临床体征

*р<0.05-与对照组和实验组的初始指数相比，差异具有统计学显著性。

临床体征特征：

1分–无

2分–轻度

3分–明显

4分–重度(非常明显)

从表6中可以看出，在二肽Thymogen L-Glu-L-Trp的作用下，“糖尿病足”综合征的临床体征得到可靠降低。改善的组织氧合有助于组织中营养过程的改善，这有助于在主要组患者中足部疲劳的降低。应当注意的是，在接受二肽Thymogen L-Glu-L-Trp的所有患者中触觉灵敏度或多或少得到恢复。另外，皮肤结构得到改善，这表现为皮肤干燥降低，肤色恢复。

因此，本发明的制剂—二肽Thymogen L-Glu-L-Trp—由于其恢复氧合组织氧合过程的能力而具有显著的营养效果。

实施例5.二肽Thymogen L-Glu-L-Trp用于治疗患胰岛素依赖型糖尿病患者的“糖尿病足”的功效

众所周知，糖尿病通过减慢损伤的愈合而不利地影响损伤过程的进程。因此，这样的过程经常具有延缓、反复的进程。

监测了29位患非胰岛素依赖型糖尿病的患者。所有患者均患有糖尿病5-23年，并且他们的年龄为51-82岁。在检查时，糖尿病得到治疗，所有患者均以其必要剂量使用抗高血糖制剂治疗。

在检查过程中，所有患者均显示出包括皮肤、皮下脂肪、肌肉的营养性损伤，未见骨组织损伤。损伤清洁无感染。患者主诉水肿、其损伤中度疼痛、其腿部快速疲劳。皮肤检查显示色素沉着、皮肤干燥、角化过度、触觉敏感度显著降低。对所有患者进行损伤表面的视觉评估，确定损伤过程的性质和阶段，并用消毒剂进行损伤表面的标准治疗。

随机将患者分为两组。第一组—对照组(14位受试者)接受抗高血糖制剂的基础治疗以及损伤表面的标准治疗，第二组—主要组(15位受试者)—除另外其基础治疗外，每天还接受肌内注射二肽Thymogen L-Glu-L-Trp，200.0μg，每天2次，持续20天(每个疗程8.0mg)。

评价两次二肽Thymogen L-Glu-L-Trp对糖尿病并发症—“糖尿病足”的临床进程的影响以及其对组织氧合程度的影响(通过人血浆中HIF-1α蛋白浓度水平来判断)—在研究开始时以及在监测结束的第二天，即在第21天。使用酶免疫测定(EIA)，使用A.Levina等人[24]的技术评估HIF-1α水平。10位未患糖尿病的健康志愿者作为补充对照组参与，抽取他们的静脉血两次—在研究的第一天和第21天，用于测定血浆中蛋白HIF-1α浓度水平。

表7

二肽Thymogen L-Glu-L-Trp对血浆中HIF-1α水平的影响

#р<0.05-与健康受试者的指数相比，差异具有统计学显著性。

*р<0.05-与初始指数相比，差异具有统计学显著性。

从表7中可以看出，患糖尿病患者的血浆中蛋白HIF-1α浓度值可靠地更高，这是组织缺血的证据。最初，在对照组和主要组之间没有观察到这一指数的可靠差异。然而，与对照组相比，针对L-Glu-L-Trp Thymogen二肽效果的情况，主要组患者的血浆中显示HIF-1α蛋白浓度可靠降低30％。所获得的数据证明，在糖尿病并发症、特别是糖尿病足的情况下，本发明的物质具有增强组织氧合的能力。

表8

“糖尿病足”综合征的临床体征

*р<0.05-与对照组和实验组的初始指数相比，差异具有统计学显著性。

临床体征的特征：

1分–无

2分–轻度

3分–明显

4分–重度(非常明显)

从表8中可以看出，在二肽Thymogen L-Glu-L-Trp的作用下，“糖尿病足”综合征的临床体征得到可靠地减低。改善的组织氧合有助于组织中营养过程的改善，这通过皮肤结构改善、皮肤干燥降低、触觉灵敏度恢复、易疲劳度降低所证明。这一过程与主要组患者中损伤表面的愈合率有关。因此，直到研究结束，73.3％的患者中改善的组织氧合过程有助于损伤表面的完全上皮形成，这是对照组的5倍(表9)。

表9

在研究第21天的损伤表面愈合阶段

因此，由于其恢复组织氧合过程的能力，本发明的制剂与标准疗法相比具有显著的损伤愈合效果。二肽Thymogen L-Glu-L-Trp缩短了损伤愈合的时间。

二肽Thymogen L-Glu-L-Trp的临床给药证实了可示出以下的实验数据：该制剂在伴有缺血和组织氧合障碍的疾病和病症的情况下是有效的。