阅读说明：本技术 一种莱茵衣藻ift144蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用 (Chlamydomonas reinhardtii IFT144 protein polyclonal antibody and preparation method and application thereof ) 是由 冯雳 丁梅 胡长峰 邢俊俏 李丽丽 花梦婷 陈龙 蒋俊龙 石畅 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用,属于生物工程领域。该莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。该方法包括：构建重组表达载体,重组表达载体的核苷酸序列包括如序列表中SEQ ID NO：2所示的序列；将重组表达载体转化至感受态细胞中,得到重组表达菌株；诱导重组表达菌株的蛋白表达,得到莱茵衣藻IFT144蛋白；将莱茵衣藻IFT144蛋白作为抗原,并进行免疫处理,得到莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体。该莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻IFT144蛋白,且效价高和特异性好；该制备方法通过PCR扩增克隆得到编码莱茵衣藻IFT144蛋白的cDNA序列,再通过构建重组表达载体,从而通过体外表达和纯化获得了制备抗体的抗原。(The invention discloses a chlamydomonas reinhardtii IFT144 protein polyclonal antibody, a preparation method and application thereof, and belongs to the field of bioengineering. The amino acid sequence of the chlamydomonas reinhardtii IFT144 protein polyclonal antibody is shown as SEQ ID NO:1 is shown. The method comprises the following steps: constructing a recombinant expression vector, wherein the nucleotide sequence of the recombinant expression vector comprises the nucleotide sequence shown as SEQ ID NO: 2; transforming the recombinant expression vector into a competent cell to obtain a recombinant expression strain; inducing the protein expression of the recombinant expression strain to obtain Chlamydomonas reinhardtii IFT144 protein; and (3) taking the Chlamydomonas reinhardtii IFT144 protein as an antigen, and performing immune treatment to obtain the Chlamydomonas reinhardtii IFT144 protein polyclonal antibody. The Chlamydomonas reinhardtii IFT144 protein polyclonal antibody can specifically recognize Chlamydomonas reinhardtii IFT144 protein, and has high titer and good specificity; the preparation method obtains a cDNA sequence for coding the Chlamydomonas reinhardtii IFT144 protein through PCR amplification cloning, and obtains the antigen for preparing the antibody through in vitro expression and purification by constructing a recombinant expression vector.)

一种莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究真核生物纤毛功能的主要模式生物之一。纤毛又叫鞭毛，是突起于真核生物的细胞表面具有极性结构的一类细胞器。研究发现纤毛中大概有600多种可溶蛋白，但是纤毛中并没有蛋白质合成所需要的细胞器，例如核糖体等，使得纤毛生物合成所需蛋白分子进出纤毛均是由纤毛内运送体(IntraflagellarTransport，IFT)蛋白进行运送的，一旦IFT蛋白发生缺失会导致纤毛的组装或者解聚发生异常。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

IFT蛋白对应的抗体是研究该相应蛋白功能所需的重要材料之一，目前IFT蛋白对应的抗体种类非常少，且已有的抗体的特异性和效价均不高，这为研究IFT蛋白的功能带来了不便，也不利于研究纤毛相关疾病的发病机理以及预防该疾病的发生。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体，所述莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本发明实施例提供了一种上述莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体的制备方法，所述方法包括：

构建重组表达载体，所述重组表达载体的核苷酸序列包括如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列；

将所述重组表达载体转化至感受态细胞中，得到重组表达菌株；

诱导所述重组表达菌株的蛋白表达，得到莱茵衣藻IFT144蛋白；

将所述莱茵衣藻IFT144蛋白作为抗原，并进行免疫处理，得到所述莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体。

具体地，构建重组表达载体的方法包括：提取莱茵衣藻的总RNA；

将所述莱茵衣藻的总RNA作为模板，进行反转录，获得莱茵衣藻cDNA；

将所述莱茵衣藻cDNA作为模板，进行PCR扩增，获得莱茵衣藻IFT144目的基因；

将所述莱茵衣藻IFT144目的基因与原核表达载体连接，得到重组表达载体。

进一步地，其特征在于，所述原核表达载体为双酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a。

进一步地，在PCR扩增时采用上游引物和下游引物进行扩增，且所述上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述下游引物如序列表中SEQ ID NO:4所示。

进一步地，所述诱导所述重组表达菌株的蛋白表达的方法包括：将所述重组表达菌株于37℃过夜培养，然后将所述重组表达菌株转接到含50μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基的小摇瓶中，制备成菌液，当所述菌液的浓度达到OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1～1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，且所述诱导的温度为37℃，所述诱导的时间为3h，得到所述莱茵衣藻IFT144蛋白。

具体地，所述方法还包括：将所述得到莱茵衣藻IFT144蛋白进行纯化；所述纯化的方法包括：将所述得到莱茵衣藻IFT144蛋白经过第一次离心，得到第一次离心沉淀；

将所述第一次离心沉淀用PBS重悬洗涤后进行第二次离心，得到第二次离心沉淀；

将所述第二次离心沉淀用所述PBS重悬，加入溶菌酶后，得到重悬液；

将所述重悬液加入PMSF后进行超声，然后加入Triton X-100和DTT，并进行离心，得到沉淀；

将所述沉淀利用变性液进行变性溶解，得到变性溶液；

将所述变性溶液利用复性液进行稀释复性，得到复性溶液；

将所述复性溶液进行柱层析分离，并洗脱，得到纯化的所述莱茵衣藻IFT144蛋白。

具体地，所述免疫处理的方法包括：将所述莱茵衣藻IFT144蛋白抗原与完全弗氏佐剂混合，得到第一混合液，将所述第一混合液注射至免疫动物体内，12天后，将所述IFT144蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合，得到第二混合液，将所述第二混合液注射至所述免疫动物体内，14天后，将所述IFT144蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合，得到第三混合液，将所述第三混合液注射至所述免疫动物体内，14天后，将所述IFT144蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合，得到第四混合液，将所述第四混合液注射至所述免疫动物体内。

具体地，所述免疫动物为新西兰白兔。

另一方面，本发明实施例提供了一种上述莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体的应用，所述应用包括：将所述莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体用于莱茵衣藻IFT144蛋白的检测和功能鉴定。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用，该莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻IFT144蛋白，且具有效价高和特异性好的特点；该制备方法通过PCR扩增克隆得到编码莱茵衣藻IFT144蛋白的cDNA序列，再通过构建重组表达载体，从而通过体外表达和纯化获得了制备抗体的抗原；该莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体用于莱茵衣藻IFT144蛋白的检测和功能鉴定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的蛋白进行SDS-PAGE电泳图，图中，纵坐标为蛋白质标准分子量；横坐标中1为4mg/mL BSA；2为Marker；3为超声后上清；4为包涵体洗涤液上清；5为包涵体2倍稀释；6为包涵体5倍稀释；7为包涵体10倍稀释；

图2是本发明实施例提供的纯化后包涵体蛋白蛋白进行SDS-PAGE电泳图，图中Marker为蛋白质标准分子量；1为Marker；2为4mg/mL BSA；3为纯化后包涵体蛋白5倍稀释；4纯化后包涵体蛋白10倍稀释；

图3是本发明实施例提供的ELISA法评定抗体效价图，图中，横坐标为不同稀释比例；纵坐标为OD₄₅₀吸收值；

图4是本发明实施例提供的莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体的Westernblot测定结果图，图中，左侧纵坐标标注为蛋白质标准分子量；

图5是本发明实施例提供的莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体与莱茵衣藻21gr分离鞭毛所得鞭毛蛋白的Westernblot测定结果图，其中，左侧纵坐标标注为蛋白质标准分子量。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明实施例提供了一种莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体，莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

下面简单介绍一下该莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体的制备方法，该方法包括：

构建重组表达载体，重组表达载体的核苷酸序列包括如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列；

将重组表达载体转化至感受态细胞中，得到重组表达菌株；

诱导所述重组表达菌株的蛋白表达，得到莱茵衣藻IFT144蛋白；

将所述莱茵衣藻IFT144蛋白作为抗原，并进行免疫处理，得到所述莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体。

具体地，构建重组表达载体的方法包括：提取莱茵衣藻的总RNA；

将所述莱茵衣藻的总RNA作为模板，进行反转录，获得莱茵衣藻cDNA。

将所述莱茵衣藻cDNA作为模板，进行PCR扩增，获得莱茵衣藻IFT144目的基因。

将所述莱茵衣藻IFT144目的基因与原核表达载体连接，得到重组表达载体

具体地，所述原核表达载体为双酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a。

具体地，在PCR扩增时采用上游引物和下游引物进行扩增，且所述上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述下游引物如序列表中SEQ ID NO:4所示。

具体地，所述诱导所述重组表达菌株的蛋白表达的方法包括：将所述重组表达菌株于37℃过夜培养，然后将所述重组表达菌株转接到含50μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基的小摇瓶中，制备成菌液，当所述菌液的浓度达到OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1～1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，且所述诱导的温度为37℃，所述诱导的时间为3h，得到所述莱茵衣藻IFT144蛋白。

具体地，感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞。

进一步地，感受态细胞为大肠杆菌Rosetta感受态细胞。

具体地，所述方法还包括：将所述得到莱茵衣藻IFT144蛋白进行纯化；所述纯化的方法包括：将所述得到莱茵衣藻IFT144蛋白经过第一次离心，得到第一次离心沉淀；

将所述第一次离心沉淀用PBS重悬洗涤后进行第二次离心，得到第二次离心沉淀；

将所述第二次离心沉淀用所述PBS重悬，加入溶菌酶后，得到重悬液；

将所述重悬液加入PMSF后进行超声，然后加入Triton X-100和DTT，并进行离心，得到沉淀；

将所述沉淀利用变性液进行变性溶解，得到变性溶液；

将所述变性溶液利用复性液进行稀释复性，得到复性溶液；

将所述复性溶液进行柱层析分离，并洗脱，得到纯化的所述莱茵衣藻IFT144蛋白。

具体地，免疫处理的方法包括：将莱茵衣藻IFT144蛋白抗原与完全弗氏佐剂混合，得到第一混合液，将第一混合液注射至免疫动物体内，12天后，将IFT144蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合，得到第二混合液，将第二混合液注射至免疫动物体内，14天后，将IFT144蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合，得到第三混合液，将第三混合液注射至免疫动物体内，14天后，将IFT144蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合，得到第四混合液，将第四混合液注射至免疫动物体内。

进一步地，免疫动物为新西兰白兔。

该莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体的应用，该应用包括将莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体用于莱茵衣藻IFT144蛋白的检测和功能鉴定。

在本实施例中，构建重组表达载体的方法包括：

提取莱茵衣藻的总RNA，得到莱茵衣藻总RNA，具体采用北京百泰克生物技术有限公司提供的通用植物总RNA提取试剂盒提取莱茵衣藻总RNA，其提取方法参照该试剂盒的说明书。

将莱茵衣藻总RNA作为模板，进行反转录获得莱茵衣藻cDNA。

将莱茵衣藻cDNA作为模板，进行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增获得莱茵衣藻IFT144目的基因。

在PCR扩增时采用上游引物和下游引物进行扩增，扩增程序为预变性95℃，5min；(变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，1min)×35个循环；延伸72℃，5min。上游引物为5’-AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCCC GGGAGCGG-3’，且上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，上游引物中的GGATCC为BamHⅠ酶切位点；下游引物为5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTACACCGCAGCCTGCGTC-3’，且下游引物如序列表中SEQ ID NO:4所示，下游引物中的GAATTC为EcoRⅠ酶切位点。

将莱茵衣藻IFT144目的基因与经过BamHⅠ酶和EcoRⅠ双酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a一同进行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并切胶回收，得到回收的P CR产物和回收的大肠杆菌表达载体pET-28a。

将回收后的PCR产物用同源重组酶连接到回收的大肠杆菌表达载体pET-28a的BamHⅠ和EcoRⅠ位点上，得到重组表达载体，连接条件为37℃反应30min。将重组表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞(大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌Rosetta感受态细胞)中，得到含莱茵衣藻IFT144基因编码序列的重组表达菌株，在含100μg/mL卡那霉素的LB固体平板上于37℃培养，培养时间为15h，在LB固体平板上挑取单菌落，将单菌落经过PCR鉴定正确后，再进行测序分析，由测序结果可知，得到的目的基因(莱茵衣藻IFT144)编码区与预计相符，该目的基因(莱茵衣藻IFT144)编码区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

将重组表达菌株于37℃过夜培养，然后将其转接到含50μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基的50mL小摇瓶中，制备成菌液，当菌液的浓度达到OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1～1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，诱导重组表达菌株的蛋白表达，诱导温度为37℃，诱导时间为3h。离心去上清，加入1×SDS沸水煮样10min，取少量诱导得到的莱茵衣藻IFT144蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，诱导结果良好，扩大细菌培养体积以获得大量莱茵衣藻IFT144蛋白。

将得到莱茵衣藻IFT144蛋白进行纯化。离心收集诱导得到的莱茵衣藻IFT144蛋白表达后的重组表达菌株，具体离心条件为4℃2800rpm离心10min，得到第一次离心沉淀，将第一次离心沉淀用PBS(Phosphate Buffer Saline，磷酸缓冲盐溶液)重悬洗涤一次，然后再次进行离心，离心条件同上，得到第二次离心沉淀。将收集的重组表达菌株(由第二次离心获得的沉淀)冻存于液氮中，用PBS将细菌重悬，1L菌液对应用30～40mL的PBS重悬，然后加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶，混匀后，放在冰上静置30～60min，得到重悬液。向该重悬液中加入终浓度为1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)并转移至小烧杯中，并将小烧杯放置在含有冰的容器中，然后通过超声破碎重悬液，含有冰的容器能够保持超声过程在低温中进行，从而防止蛋白降解，超声破碎的时间和功率根据具体情况而定，本实施例超声破碎时，工作7s，间歇5s，功率30％，超声破碎的时间为8min，将重悬液超声破碎至透澈明亮为止。超声破碎完成后，向小烧杯中加入终浓度分别为1％的Triton X-100和1mM的DTT(二硫苏糖醇)，然后将小烧杯于冰上放置30min。然后于4℃、10000rpm离心60min，得到上清液和沉淀。将收集的沉淀洗涤干净，然后用PBS(Phosphate Buffer Saline，磷酸缓冲盐溶液)进行变性溶解，从而使包涵体溶解，该PBS中包括浓度为8mol/L的尿素和浓度为20mmol/L的DTT，将溶解后的包涵体利用复性液(复性液中的溶剂为PBS，且复性液中的溶剂包括：浓度为0.5mmol/L的EDTA、浓度为5％的glycerol、浓度为1mmol/L DTT)进行稀释复性，稀释到尿素的终浓度为0.5mol/L为止，得到复性溶液，将复性溶液进行柱层析分离，使蛋白与beads特异性结合，然后洗脱蛋白，最后将蛋白溶液转换成PBS溶液，并使纯化后的蛋白浓度达到1mg/mL以上，将纯化后的蛋白进行电泳，检测蛋白纯度并估算蛋白浓度，将纯化好的蛋白保存在-80℃环境中。进行SDS-PAGE电泳，并对纯化好的蛋白的表达结果进行分析，结果如图1和图2所示，由图1可知，目的蛋白(重组莱茵衣藻IFT144)诱导表达后分布在包涵体中，选择包涵体的蛋白进行纯化。由图2可知，纯化后的包涵体蛋白(重组莱茵衣藻IFT144)有少量杂带，但纯度达到免疫要求，测定浓度约为5mg/mL，可用于免疫。

将纯化好的重组莱茵衣藻IFT144蛋白作为抗原免疫新西兰白兔。新西兰白兔耳缘静脉取血1mL，于4℃静置过夜，取上层血清作为阴性对照。取0.6mg上述纯化好的重组莱茵衣藻IFT144蛋白，然后加入等体积的弗式完全佐剂，用注射器混匀乳化至混合物在水中不扩散为止，然后在背部皮下免疫六个点以及双后脚皮下各免疫一个点。记录第一次免疫的时间。12天之后，进行第二次免疫，取0.3mg重组莱茵衣藻IFT144蛋白与等体积的弗式不完全佐剂混匀乳化至在水中不扩散为止，在背部皮下免疫四个点。

两周后，进行第三次免疫，取0.3mg重组莱茵衣藻IFT144蛋白，直接在背部皮下免疫四个点。并且此时耳缘静脉取血1ml，初步检测血清抗体效价。

两周后，进行第四次免疫，取0.3mg重组莱茵衣藻IFT144蛋白，直接背部皮下免疫四个点。

12天后，取全血约80mL，麻醉之后，颈动脉取血至死亡，全血4℃冰箱过夜，分离上层血清，得到莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体，且莱茵衣藻IFT144蛋白抗原的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，检测血清中莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体的效价后分装保存于-80℃中。将阴性血清作为阴性对照，通过ELISA法测定抗体效价，稀释后的抗体血清在450nm吸光度大于免疫前血清2.1倍时的最高稀释倍数定义为抗体的效价，ELISA法测定的结果如图3所示，由图3可知，制备的莱茵衣藻IFT144多克隆抗体抗血清效价约为1:512000；通过Westernblot测定抗体特异性，其测定结果分别如图4和图5所示，由图4和图5可知，制备的莱茵衣藻IFT144多克隆抗体可与重组莱茵衣藻IFT144蛋白及莱茵衣藻21gr分离鞭毛所得鞭毛蛋白特异性结合，同时形成的条带大小与预测相符，说明所得抗体特异性良好。

本发明实施例提供了一种莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用，该莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻IFT144蛋白，且具有效价高和特异性好的特点；该制备方法通过PCR扩增克隆得到编码莱茵衣藻IFT144蛋白的cDNA序列，再通过构建重组表达载体，从而通过体外表达和纯化获得了制备抗体的抗原；该莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体用于莱茵衣藻IFT144蛋白的检测和功能鉴定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江汉大学

<120> 一种莱茵衣藻IFT144蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ala Gly Ala Leu Leu Thr Pro Leu Val Gly Leu His Thr Leu

1 5 10 15

Leu Ile Val Ala Ala Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ile Met Ala Leu Ala

20 25 30

Gly Gly Ala Leu Thr Val Thr Leu Thr Ala Gly Val Thr Gly Ala Thr

35 40 45

Ile Leu Thr Pro His Leu Leu Ala Val Pro Met Ala Leu Cys Val Ser

50 55 60

Ala Leu Leu Gly Ala Gly Thr Ser Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Ser

65 70 75 80

Leu Ala Ile Ala Ala Leu Thr Leu Thr Ile Met Gly Cys Thr Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Ala Pro Leu Gly Leu Ala Pro Leu Ala Thr Thr Gly Pro Ile

100 105 110

Met Leu His Ser Thr Pro Gly Ala Gly Thr Ile Leu Leu Gly Thr Leu

115 120 125

Ala Gly Thr Val Ala Val Val Ser Ser His Ser Ala Gly Ile Ser Gly

130 135 140

Gly Val His Ser Gly Leu Thr Leu Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Thr

145 150 155 160

Cys Ala Ser Leu Gly Ala Val Ala Met Ala Gly Ala Ala Cys Val Ala

165 170 175

Val Leu Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Gly Ile Leu Gly Ala Ala Val

180 185 190

Ala Leu Ala Ala Ala Gly Ala Ile Gly Leu Val Gly Thr Thr Leu Ala

195 200 205

Gly Gly Val Leu Thr Val Gly Thr His Ala Gly Thr Met His Ser Pro

210 215 220

Leu Ala Ser Leu Pro Met Val Thr Ala Pro His Gly Thr Ala Val Leu

225 230 235 240

Thr Leu Thr Ser Leu Leu Gly Met Thr Leu Leu Ala Val Ser Ala Ala

245 250 255

Gly Thr Val Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gly Pro Ala Pro Cys Gly

260 265 270

Leu Gly Pro Ser His Ala Ala Val Gly Met Ala Ala Gly Ala Ala Pro

275 280 285

Thr Ser Leu Gly Gly Leu Val Gly Leu Val Val Gly Ala Ala Gly Thr

290 295 300

Leu Gly Thr Ile Thr Ala Ile Leu Leu Ala Gly Thr Gly Ala Ala Val

305 310 315 320

<210> 2

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcccgggagc ggaagaagac gccgctggtg ggcaagcaca cgaagaagat tgtggctgcc 60

gcctggaaca aggacaacat catggcgctg gcggggcagg acaagaccgt cacgctgacg 120

gacggcgtca cgggcgacac catcaaaact ttccacctca aggacgtgcc catggacctg 180

tgcgtgtctg acaagaagga ggacggctac tcgcggcgag aggagaacac ctactcgctc 240

aacatcaatc ggaaaacgct gtacatcatg cagtgcactg ccgagggcga ccggccgctg 300

gagctggcgt tcctggacac ctacggcccc atcatgaagc acagctggtt cggcgacggc 360

tacattctgc tgggctacaa gaacggctac gtggcggtgg tgtccagtca cagccgcgag 420

atcagcgagg aggtgcactc cgggaagtac ctggacacgt tgacggacgt gacctactgc 480

gccagcctgg gccgcgtggc catggcgggc gccaactgcg tgcgtgtgct ggacgccaac 540

gccgactaca acgagatcaa gggcgacgcg gtggacctgg acgcaaacca ggccatcgag 600

aaggtcggct ggaccaagga cggccaggtg ctgacggtgg gcacgcacaa tggctacatg 660

cattcgttcc tggcctcgct acccatggtg tacgacttcc acggcacccg cgtgctgtac 720

ctgaccagct tgctggagat gacgctgctg gacgtgagcc ggcgccagac cgtggcgcgc 780

attgagctgg agaacgagcc ggcgttctgc gggctgggcc cctcacacgc ggcggtgggc 840

atgaacaacc aggccgcgtt ctacagcctg ggcgagaagg tgggcaaggt ggtgcagcgg 900

cgcgagtacc tgggcaccat caccgccatc aagctcaacg agacgcaggc tgcggtg 957

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaaatggg tcgcggatcc atggcccggg agcgg 35

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtcgacgg agctcgaatt cttacaccgc agcctgcgtc 40