一种抑制tert出核的纳米粒子、制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种抑制tert出核的纳米粒子、制备方法及应用 (Nanoparticles for inhibiting TERT (TERT-terminal electron transfer) nucleation, preparation method and application ) 是由 秦洪双 于 2021-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,公开了一种抑制TERT出核的纳米粒子、制备方法及应用,所述抑制TERT出核的纳米粒子即纳米粒子Dox-LMB@MSN-HA。所述抑制TERT出核的纳米粒子制备方法包括：将抑制TERT出核的化合物leptomycin B即LMB与化疗药物Dox同时载入介孔硅纳米粒子,并在负载药物的介孔硅外包裹靶向肿瘤干细胞的透明质酸,即可。本发明的纳米粒子Dox-LMB@MSN-HA,可以通过抑制TERT出核,提高肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性,增强Dox对线粒体的损伤,从而有效清除肿瘤干细胞。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and discloses nanoparticles for inhibiting TERT (TERT-like transition nucleus), a preparation method and application thereof. The preparation method of the nanoparticle for inhibiting TERT nuclear evolution comprises the following steps: loading the compound leptin B (LMB) for inhibiting TERT from generating nucleus and the chemotherapeutic drug Dox into the mesoporous silicon nano particles at the same time, and wrapping hyaluronic acid of the targeted tumor stem cells outside the drug-loaded mesoporous silicon. The nanoparticle Dox-LMB @ MSN-HA can improve the sensitivity of tumor stem cells to chemotherapeutic drugs and enhance the damage of Dox to mitochondria by inhibiting TERT (telomerase reverse transcriptase) to nucleate, thereby effectively removing the tumor stem cells.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种抑制TERT出核的纳米粒子、制备方法及应用。
背景技术
目前：肿瘤干细胞是肿瘤转移和复发的根源。传统的抗肿瘤药物能够杀死大部分的肿瘤细胞，使肿瘤体积减小，但是不能清除肿瘤干细胞。存活下来的肿瘤干细胞快速增殖、分化形成新的肿瘤细胞，使病人最终死于肿瘤的转移或复发。随着靶向化疗的快速发展，很多针对不同靶点的抗肿瘤干细胞化合物被发现，例如针对多种激酶、线粒体或肿瘤微环境的化合物。但是这些化合物(如寡霉素A、哌立福辛、repertaxin)对肿瘤干细胞的选择性较弱，对正常体细胞有强烈的毒副作用。因此，根据肿瘤干细胞的生物学特点寻找更有效的靶点，从而研发出毒性小的抗肿瘤干细胞化合物是亟待解决的问题。
近年来，端粒酶在癌症的治疗中引起了广泛关注。端粒酶在肿瘤干细胞和绝大多数恶性肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞中不表达或低表达。因此，端粒酶是开发毒性小、疗效显著的抗肿瘤干细胞药物的良好靶点。端粒酶包括一个RNA模板(TERC)和一个蛋白催化亚单元(TERT)。它的经典功能是以自身的RNA为模板通过TERT的催化功能把DNA重复序列5′-TTAGGG-3′加在端粒末端。近年来研究发现，除了经典功能，在细胞应激状态下，TERT能够从细胞核转位到线粒体，保护线粒体DNA免受DNA损伤、增强呼吸链活性和线粒体膜电势、抑制ROS产生，进而增强线粒体功能、促进细胞存活、抑制凋亡，最终导致严重的化疗药物抵抗，包括依托泊苷、顺铂、5-氟尿嘧啶和阿霉素(Dox)等。因此，抑制TERT从细胞核转移到线粒体，能够增强化疗药物对肿瘤干细胞的杀伤作用。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有抑制肿瘤生长或抗肿瘤药物能够杀死大部分的肿瘤细胞，使肿瘤体积减小，但是不能清除肿瘤干细胞。
(2)现有的抗肿瘤干细胞药物对肿瘤干细胞的选择性较弱，对正常体细胞有强烈的毒副作用。
解决以上问题及缺陷的难度为：根据肿瘤干细胞的生物学特点寻找有效的靶点，从而研发出特异性靶向肿瘤干细胞、对正常体细胞毒性小的抗肿瘤干细胞化合物。
解决以上问题及缺陷的意义为：寻找到特异性靶向肿瘤干细胞的靶点，从而研发出毒性小的抗肿瘤干细胞化合物，能够为抗肿瘤干细胞药物的设计提供新的思路，为肿瘤干细胞的治疗提供新的机遇。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抑制TERT出核的纳米粒子、制备方法及应用。
本发明是这样实现的，一种抑制TERT出核的纳米粒子，所述抑制TERT出核的纳米粒子即纳米粒子[email protected]。此纳米平台所用材料二氧化硅和透明质酸在体外和体内均具有较好的生物相容性，使此纳米平台具有良好的开发为临床用药的潜力。
本发明的另一目的在于提供一种所述抑制TERT出核的纳米粒子的抑制TERT出核的纳米粒子制备方法，所述抑制TERT出核的纳米粒子制备方法包括：
将抑制TERT出核的化合物leptomycin B即LMB与化疗药物Dox同时载入介孔硅纳米粒子，并在负载药物的介孔硅外包裹靶向肿瘤干细胞的透明质酸，即可。
进一步，所述抑制TERT出核的纳米粒子制备方法包括以下步骤：
步骤一，利用N-cetyltrimethylammonium bromide即CTAB与NaOH合成介孔硅纳米粒子MSP；
步骤二，对制备的介孔硅纳米粒子进行搅拌、超声、分散、回流及其他处理将介孔硅氨基化；
步骤三，利用Dox、LMB对氨基化的介孔硅进行药物负载，得到负载药物的纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]；
步骤四，对得到的负载药物的纳米粒子进行透明质酸包裹，得到透明质酸包裹的介孔硅纳米粒子MSN-HA，和透明质酸包裹的负载药物的介孔硅纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]。
进一步，步骤一中，所述利用N-cetyltrimethylammonium bromide即CTAB与NaOH合成介孔硅纳米粒子包括：
将0.50g CTAB溶解于240mL超纯水中，得到CTAB溶液；将1.75mL 2MNaOH加入所述CTAB溶液中，加热到80℃，得到混合溶液；
将2.5mLTEOS逐滴加入所述混合溶液中，搅拌2h，直至白色沉淀出现，过滤，保留白色沉淀；利用去离子水和乙醇清洗所述白色沉淀，并对清洗后的白色沉淀干燥即可得介孔硅纳米粒子。
进一步，步骤二中，所述对制备的介孔硅纳米粒子进行搅拌、超声、分散、回流及其他处理将介孔硅氨基化包括：
将500mg MSP加入到50mLPhMe中，搅拌、超声，充分分散，得到混合溶液；将250μL的0.2μmol的3-(2-aminoethylamino)-propyl-trimethoxysilane加入到上述混合溶液中，在通N2条件下回流24h；将产物过滤，依次用PhMe、THF和EtOH清洗；清洗后，将产物真空干燥24h，得到氨基化的介孔硅amino-functionalizedMSP即MSN。
进一步，步骤三中，所述利用Dox、LMB对氨基化的介孔硅进行药物负载，得到负载药物的纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]包括：
将4mg Dox加入到超纯水中，充分搅拌后，再加入20mg MSN，搅拌24h；离心分离纳米粒子，用超纯水充分洗涤，去除未装载和吸附的药物分子，得到负载药物的纳米粒子[email protected]；
将0.16mg LMB加入到超纯水中，充分搅拌后，再加入20mg MSN，搅拌24h；离心分离纳米粒子，用超纯水充分洗涤，去除未装载和吸附的药物分子，得到负载药物的纳米粒子[email protected]；
将4mg Dox和0.16mg LMB加入到超纯水中，充分搅拌后，再加入20mg MSN，搅拌24h；离心分离纳米粒子，用超纯水充分洗涤，去除未装载和吸附的药物分子，得到负载药物的纳米粒子[email protected]。
进一步，步骤四中，所述对得到的负载药物的纳米粒子进行透明质酸包裹，得到透明质酸包裹的介孔硅纳米粒子MSN-HA，和透明质酸包裹的负载药物的介孔硅纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]包括：
将30mg透明质酸hyaluronic acid即HA加入超纯水中，搅拌过夜，充分水化；将水化的透明质酸HA加入含有2mg mL-1EDC、2mg mL-1NHS的2-(N-morpholino)ethane-sulfonicacidpH 6.0buffer中，搅拌30min；
再加入20μL的100mM、pH 7.4的PBS buffer，再加入12mg MSN或者装载药物的MSN，室温搅拌20h；
离心去除未反应的透明质酸，得到透明质酸包裹的介孔硅纳米粒子MSN-HA，和透明质酸包裹的负载了药物的介孔硅纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]。
本发明的另一目的在于提供一种所述抑制TERT出核的纳米粒子在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述抑制TERT出核的纳米粒子在制备用于清除或杀灭肿瘤干细胞的药物中的用途。
本发明的另一目的在于提供一种所述抑制TERT出核的纳米粒子制备用于治疗和/或预防因肿瘤干细胞而产生耐药性和复发的肿瘤疾病的药物中的用途。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供一种纳米粒子[email protected]，可以通过抑制TERT出核，提高肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性。本发明的纳米粒子表面的透明质酸HA通过与肿瘤干细胞细胞膜上的CD44受体结合，把LMB和Dox同时载入肿瘤干细胞，进入细胞后，LMB通过抑制TERT出核，增强Dox对线粒体的损伤，从而有效清除肿瘤干细胞。
附图说明
图1是本发明实施例提供的纳米粒子[email protected]合成示意图。
图2是本发明实施例提供的抑制TERT出核的纳米粒子制备方法流程图。
图3是本发明实施例提供的氨基化介孔硅纳米粒子MSN的透射电镜TEM图像。
图4是本发明实施例提供的包裹透明酸HA后，纳米粒子的透射电镜TEM图像。
图5是本发明实施例提供的纳米粒子对乳腺癌干细胞线粒体DNA完整性的影响示意图。
图6是本发明实施例提供的纳米粒子对乳腺癌干细胞ATP水平的影响示意图。
图7是本发明实施例提供的纳米粒子对乳腺癌干细胞活力影响示意图。
图8是本发明实施例提供的纳米粒子对乳腺癌干细胞活力影响示意图。
图9是本发明实施例提供的纳米粒子对乳腺癌干细胞活力的影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抑制TERT出核的纳米粒子，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的抑制TERT出核的纳米粒子即纳米粒子[email protected]。
如图1所示，本发明实施例提供的抑制TERT出核的纳米粒子制备方法包括：
将抑制TERT出核的化合物leptomycin B即LMB与化疗药物Dox同时载入介孔硅纳米粒子，并在负载药物的介孔硅外包裹靶向肿瘤干细胞的透明质酸，即可。
如图2所示，本发明实施例提供的抑制TERT出核的纳米粒子制备方法包括以下步骤：
S101，利用N-cetyltrimethylammoniumbromide即CTAB与NaOH合成介孔硅纳米粒子MSP；
S102，对制备的介孔硅纳米粒子进行搅拌、超声、分散、回流及其他处理将介孔硅氨基化；
S103，利用Dox、LMB对氨基化的介孔硅进行药物负载，得到负载药物的纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]；
S104，对得到的负载药物的纳米粒子进行透明质酸包裹，得到透明质酸包裹的介孔硅纳米粒子MSN-HA，和透明质酸包裹的负载药物的介孔硅纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]。
本发明实施例提供的利用N-cetyltrimethylammonium bromide即CTAB与NaOH合成介孔硅纳米粒子包括：
将0.50g CTAB溶解于240mL超纯水中，得到CTAB溶液；将1.75mL 2MNaOH加入所述CTAB溶液中，加热到80℃，得到混合溶液；
将2.5mLTEOS逐滴加入所述混合溶液中，搅拌2h，直至白色沉淀出现，过滤，保留白色沉淀；利用去离子水和乙醇清洗所述白色沉淀，并对清洗后的白色沉淀干燥即可得介孔硅纳米粒子。
本发明实施例提供的对制备的介孔硅纳米粒子进行搅拌、超声、分散、回流及其他处理将介孔硅氨基化包括：
将500mg MSP加入到50mLPhMe中，搅拌、超声，充分分散，得到混合溶液；将250μL的0.2μmol的3-(2-aminoethylamino)-propyl-trimethoxysilane加入到上述混合溶液中，在通N2条件下回流24h；将产物过滤，依次用PhMe、THF和EtOH清洗；清洗后，将产物真空干燥24h，得到氨基化的介孔硅amino-functionalizedMSP即MSN。
本发明实施例提供的利用Dox、LMB对氨基化的介孔硅进行药物负载，得到负载药物的纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]包括：
将4mg Dox加入到超纯水中，充分搅拌后，再加入20mg MSN，搅拌24h；离心分离纳米粒子，用超纯水充分洗涤，去除未装载和吸附的药物分子，得到负载药物的纳米粒子[email protected]；
将0.16mg LMB加入到超纯水中，充分搅拌后，再加入20mg MSN，搅拌24h；离心分离纳米粒子，用超纯水充分洗涤，去除未装载和吸附的药物分子，得到负载药物的纳米粒子[email protected]；
将4mg Dox和0.16mg LMB加入到超纯水中，充分搅拌后，再加入20mg MSN，搅拌24h；离心分离纳米粒子，用超纯水充分洗涤，去除未装载和吸附的药物分子，得到负载药物的纳米粒子[email protected]。
本发明实施例提供的对得到的负载药物的纳米粒子进行透明质酸包裹，得到透明质酸包裹的介孔硅纳米粒子MSN-HA，和透明质酸包裹的负载药物的介孔硅纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]包括：
将30mg透明质酸hyaluronic acid即HA加入超纯水中，搅拌过夜，充分水化；将水化的透明质酸HA加入含有2mg mL-1EDC、2mg mL-1NHS的2-(N-morpholino)ethane-sulfonicacidpH 6.0buffer中，搅拌30min；
再加入20μL的100mM、pH 7.4的PBS buffer，再加入12mg MSN或者装载药物的MSN，室温搅拌20h；
离心去除未反应的透明质酸，得到透明质酸包裹的介孔硅纳米粒子MSN-HA，和透明质酸包裹的负载了药物的介孔硅纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1乳腺癌干细胞的富集培养与鉴定
将MCF-7细胞以5000个/ml的密度接种到DMEM/F12培养基中，在其中添加20ng/ml碱性成纤维生长因子bFGF、20ng/ml人重组上皮生长因子EGF、4μg/ml肝素、1％链霉素和青霉素，并在6孔超低粘附培养板中培养，接种之后将培养板置于37℃、5％CO2、潮湿的培养箱中孵育培养，7d后，将形成的微球体用0.25％的胰蛋白酶消化成单个细胞，以5000个/ml的细胞密度进行第二次培养，7d后，收集微球体，同样消化成单个细胞。
将1×106个细胞分散在100μl的PBS缓冲液中，在其中加入PE标记的CD24抗体和APC标记的CD44抗体，在室温下孵育30min，然后用PBS洗涤两次，重悬在500μl PBS中，最后用流式细胞技术检测CD44+/CD24-/low细胞的比例。
在1×106个细胞中加入1mL的Trizol裂解液，将细胞吹起转移到1.5mL EP管中。在Trizol溶液中加入200μL氯仿，剧烈混匀15-20s，室温静止2min后，离心15min(4℃，12000rpm)。将水相移到另一个EP管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀数次，室温静止10min。离心10min(4℃，12000rpm)，弃上清，在沉淀中加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，离心5min(4℃，7500rpm)，重复此步骤一次。弃上清，自然干燥，加入15-20μL的0.1％DEPC水，37℃溶解30min，得到RNA溶液。将RNA溶液进行逆转录，反应体系：mRNA模板1μg；AnchoredOligo(dT)18(0.5μg/mL)1μL；2×TS Reaction Mix 10μL；TransScript RT/RI Enzyme Mix1μL；RNase-free Water加至20μL。反应过程：将上述体系的各种试剂依次加入到EP管中，混匀，42℃孵育30min。85℃加热5min使TransScript RT失活。最后将逆转录产物进行qRT-PCR反应，检测ALDH1表达量。反应体系：Brilliant II SYBR Green QPCR mastermix 1×；cDNA1μg；引物混合0.8μM。反应程序：95℃ 10min；95℃ 10sec；60℃ 1min；60℃30sec，40个循环。ALDH1引物序列：上游5′-TCG TCT GCT GCT GGC GAC AAT G-3′，下游5′-CCC AAC CTGCAC AGT AGC GCA A-3′。
将乳腺癌干细胞以5000个/ml的密度进行培养，同时加入纳米粒子MSP、MSN、MSN-HA、[email protected]、[email protected]和[email protected]。然后用PCR扩增技术、ATP检测技术、流式细胞技术、微球体形成实验检测纳米粒子对乳腺癌干细胞线粒体和细胞活力的影响。
实施例2纳米粒子合成
介孔硅纳米粒子(mesoporous silica nanoparticle，MSP)合成。将0.50gN-cetyltrimethylammoniumbromide(CTAB)溶解于240mL超纯水中，将1.75mL2M NaOH加入到CTAB溶液中，加热到80℃。然后将2.5mL TEOS逐滴加入到上述溶液，搅拌2h，直至白色沉淀出现，此白色粉末就是介孔硅。将产物过滤，用去离子水和乙醇清洗，干燥。
介孔硅氨基化。将500mg MSP加入到50mL PhMe中，搅拌、超声，使之充分分散。将250μL 3-(2-aminoethylamino)-propyl-trimethoxysilane(0.2μmol)加入到上述溶液，在通N2条件下回流24h。之后将产物过滤，依次用PhMe、THF和EtOH清洗。清洗后，将产物真空干燥24h，得到氨基化的介孔硅amino-functionalizedMSP(MSN)。
药物负载。将4mg Dox、0.16mg LMB、或者4mg Dox和0.16mg LMB加入到超纯水中，充分搅拌。分别在上述溶液中加入20mg MSN，搅拌24h。离心分离纳米粒子，用超纯水充分洗涤，去除未装载和吸附的药物分子，得到负载药物的纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]。
透明质酸包裹。将30mg透明质酸hyaluronic acid(HA)加入到超纯水中，搅拌过夜，使之充分水化。之后将水化的透明质酸HA加入含有2mg mL-1EDC、2mg mL-1NHS的2-(N-morpholino)ethane-sulfonic acid(MES)buffer(pH 6.0)中，搅拌30min。在上述溶液中加入20μL PBS buffer(100mM，pH 7.4)，再加入12mg MSN或者装载了药物的MSN，室温搅拌20h。离心去除未反应的透明质酸，得到透明质酸包裹的介孔硅纳米粒子MSN-HA，和透明质酸包裹的负载了药物的介孔硅纳米粒子[email protected]、[email protected]和[email protected]。
图1是纳米粒子构建示意图。图3是氨基化介孔硅纳米粒子MSN的透射电镜TEM图像，图像显示，MSN有可以负载药物的孔道。图4是包裹透明酸HA后，纳米粒子的透射电镜TEM图像，图像显示，MSN外周成功包裹上透明质酸HA，并成功把载药孔道密封。
实施例3纳米粒子对线粒体的影响
线粒体DNA检测：乳腺癌干细胞与纳米粒子共孵育3d后，提取线粒体DNA。用长链DNA PCR方法检测线粒体DNA完整性。上游引物5'-ATA CCC ATG GCC AAC CTC CTA CTC CTCATT-3'，下游引物5'-CTA GAA GTG TGA AAA CGT AGG CTT GGA TTA AGG C-3'。反应体系：Buffe 1×；dNTP 0.75mM；模板DNA 150ng；引物混合液0.4μM each；long DNA polymerase2.5U/50μl。反应程序：95℃3min；95℃30sec；55℃30sec；68℃5min；68℃15min；30个循环。PCR产物与DNA染料混合后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果在凝胶成像仪中观察。图5是纳米粒子对线粒体DNA完整性的影响。图5中显示，与[email protected]相比，[email protected]对线粒体DNA的损伤更为明显，
说明[email protected]能够显著增强Dox对乳腺癌干细胞线粒体DNA的损伤。
ATP检测：乳腺癌干细胞与纳米粒子共孵育3d后，离心收集细胞。1×106个细胞加入200μL裂解液，裂解细胞。裂解后4℃12000rpm/min离心5min，取上清，用于测定。加100μLATP检测工作液到检测孔。室温放置3-5min，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底。在检测孔内加上20μL样品，迅速用微量移液器混匀，间隔2sec后，用化学发光仪(luminometer)测定RLU值。图6是纳米粒子对乳腺癌干细胞ATP水平的影响。图6中显示，与[email protected]相比，[email protected]能够显著抑制ATP产生，说明[email protected]能够显著增强Dox对乳腺癌干细胞线粒体功能的损伤。
ROS检测：乳腺癌干细胞与纳米粒子共孵育3d，与DCFH-DA(10μM)孵育30min，用流式细胞技术检测细胞内ROS含量。图7是纳米粒子对乳腺癌干细胞ROS水平的影响。图7中显示，与[email protected]相比，[email protected]能够显著增强ROS产生，再次说明[email protected]能够显著增强Dox对乳腺癌干细胞线粒体功能的损伤。
实施例4纳米粒子对乳腺癌干细胞活力的影响
将5000个乳腺癌干细胞接种到6孔超低粘附培养板中，同时加入纳米粒子，3d后，在显微镜下观察微球体个数和大小并拍照；然后用胰蛋白酶把微球体消化成单个细胞、计数。图8是纳米粒子对乳腺癌肿瘤干细胞活力的影响照片，图9是纳米粒子对乳腺癌肿瘤干细胞活力影响的统计数据。从图8和图9可以看出，[email protected]对细胞活力的影响显著强于[email protected]，说明纳米粒子[email protected]能够通过抑制TERT出核显著增强乳腺癌干细胞对Dox的敏感性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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