具体实施方式

以下具体结合实施例进一步描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1牦牛I型胶原蛋白的制备

1.制备方法

将牦牛筋腱进行清洗，去除异物，粉碎成小块；用1％洗必泰和5％过氧化氢对粉粹后的小块进行处理，取沉淀，水洗至中性；将得到的沉淀用10％正丁醇进行脱脂，取沉淀，水洗至中性；将前步中得到的沉淀用0.5M盐酸进行脱钙，脱钙结束，取沉淀，水洗至中性；将前步中得到的组织沉淀浸泡于0.5M的氢氧化钠溶液中，10℃搅拌处理2h，取沉淀，水洗至中性；用含1g/L胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液提取胶原蛋白，得到粗的胶原蛋白提取液；调pH至中性，进行酶灭活；8-14kDa透析袋进行透析，透析结束后，冷冻干燥，最终得到低内毒素含量的牦牛I型胶原蛋白。

2.内毒素含量测定

采用ToxinSensor^TM显色法LAL内毒素检测试剂盒，并按试剂盒说明书所述的方法，得到内毒素含量的标准曲线为：y＝0.5038x+0.3387(R²＝0.9483)；对牦牛I型胶原蛋白提取过程中各操作步骤后的内毒素含量进行测定，该测定方法灵敏可靠，测定结果见下表1(已知医疗器械中内毒素含量要求为<0.5Eu/mL，药品中内毒素含量要求一般为<0.3Eu/mL)。

表1牦牛I型胶原蛋白制备各步骤内毒素含量检测结果

从表1可以看出：以本发明所述的方法提取制备的牦牛I型胶原蛋白，能够显著降低牦牛I型胶原蛋白产品中内毒素的含量，使牦牛I型胶原蛋白产品中内毒素的含量低于检测限，是一种安全低毒的牦牛I型胶原蛋白。

3.胶原蛋白结构鉴定

凝胶电泳实验：采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法对上述实施例制备的低内毒素胶原蛋白的结构进行分析。

本发明制备的牦牛胶原蛋白的凝胶电泳图如图1所示，在分子量为100kDa附近有两条α带，分别为α1和α2，在分子量为200kDa附近有两条β带，分别为β11和β12，其中β11和β12为两条α链形成的二聚体肽链，而且在低分子量处没有多余的条带，本发明制备的牦牛胶原蛋白是由三条具有左手螺旋结构的多肽链相互缠绕形成右手螺旋结构，属于典型的I型胶原蛋白结构，没有发生降解。

圆二色谱实验：圆二色谱是用于表征蛋白质结构的常用方法，其中225nm处的正峰和205nm处的负峰，是胶原蛋白三重螺旋结构的特征峰。对本发明制备的牦牛胶原蛋白进行圆二色谱鉴定，结果如图2a所示，本发明制备的牦牛胶原蛋白在225nm左右处具有正峰，在205nm左右处具有负峰，符合胶原蛋白特征性的三重螺旋结构；同时，对牦牛胶原蛋白的热变温度进行了测定，由图2b可知，牦牛胶原蛋白的热变温度为37℃，符合天然胶原蛋白的特点。

实施例2皮肤光损伤修复液体复合物的制备

皮肤光损伤修复液体复合物按质量比由以下组分制成：牦牛胶原蛋白10％，丁二醇10％，赤藓醇8％，牛油果树提取物1％，甘油5％，烟酰胺3％，透明质酸2％，红没药醇0.5％，羟苯甲酯0.14％，余量为水。

制备过程：将A相物质(水、甘油、赤藓醇、烟酰胺、透明质酸)加热至85度，搅拌至完全溶解后，均质3min，保温10-15min；预溶B相物质(丁二醇)，完全溶解至透明，降温到70度加入；预溶C相物质(牛油果树提取物、牦牛胶原蛋白)、D相物质(羟苯甲酯、红没药醇)；降温至40度加入D相物质，降温至35度加入C相物质，搅拌至完全溶解透明。降温至30度，用洁净滤网过滤，出料静置。得到牦牛胶原蛋白液体复合物。

实施例3皮肤光损伤修复膏霜复合物的制备

皮肤光损伤修复膏霜复合物按质量比由以下组分制成：牦牛胶原蛋白15％，丁二醇10％，甘油8％，甜菜碱7％，辛酸/癸酸甘油三脂6％，聚硅氧烷6％，鲸蜡硬脂基葡糖苷3％，母菊花提取物1％，甘油硬脂酸1％，透明质酸钠1％，苯氧乙醇0.2％，积雪草提取物0.1％，余量为水。

将A相物质(辛酸/癸酸甘油三脂、环己氧烷、聚二甲基硅氧烷、甘油硬脂酸、鲸蜡硬脂基葡糖苷)搅拌升温至90度，并搅拌均匀，将B相物质(水、甘油、甜菜碱、透明质酸钠)搅拌升温至90度，搅拌均匀，再将A相物质真空抽入B相中，两相混合乳化，均质3-5min，搅拌均匀，保温10-20min；降温至45度，再加入C相原料(丁二醇、积雪草提取物、母菊花提取物，苯氧乙醇)，均质5min；降温至35度，加入牦牛胶原蛋白，混合搅拌均匀。降温至30度，用洁净滤网过滤，出料静置。得到牦牛胶原蛋白膏霜复合物。

实施例4晒后修复实验

1.实验过程

选用40只SPF级的健康成年小鼠，雌性，体重为27±2g。用飞利浦理发器对小鼠背部进行剃毛，再用脱毛膏进行脱毛，脱毛区域约为2×4cm。对小鼠随机分为8组：空白组、模型组、实验组1(实施例1制备的牦牛I型胶原蛋白溶液，胶原蛋白浓度为1.5mg/ml)、实验组2(实施例2制备的牦牛胶原蛋白液体复合物)、实验组3(实施例3制备的牦牛胶原蛋白膏霜复合物)、对照组1(市售鱼胶原蛋白溶液，胶原蛋白浓度为1.5mg/ml)、对照组2(市售猪胶原蛋白溶液，胶原蛋白浓度为1.5mg/ml)，对照组3(市售牛胶原蛋白溶液，胶原蛋白浓度为1.5mg/ml)。其中空白组除脱毛外不做任何处理；模型组不做任何修复处理。

建立无毛小鼠的紫外损伤模型：用连续波长的UVA(波长：320-440nm)和UVB(280-320nm)紫外灯管对模型组和实验组小鼠进行照射，照射剂量用紫外辐照计进行定量，UVA和UVB的照射总量均为100mJ/cm²，可造成小鼠背部皮肤急性皮肤炎症。

处理：照射后1h，分别用牦牛I型胶原蛋白溶液(实施例1制备)、实施例2制备的皮肤光损伤修复敷料、实施例2制备的皮肤光损伤修复霜、市售鱼胶原蛋白溶液、市售猪胶原蛋白溶液、市售牛胶原蛋白溶液分别对相应的实验组和对照组进行涂抹治疗；剂量为4ml(其中胶原蛋白浓度为1.5mg/ml)或4g。治疗第4天对小鼠进行脱臼处死并取材背部皮肤，将皮肤组织冷冻；取采集的皮肤组织，用10％中性甲醛进行固定48h。随后取固定后的皮肤组织进行取材、浸蜡、脱水、透明、包埋，进行石蜡切片。切片厚度为3.5μm。

HE染色：对石蜡切片进行脱蜡和脱水处理后进行HE染色，水浸洗后用苏木素染色5-8min，流水冲洗1min；分化液分化1-3s，冲洗1min；返蓝液返蓝30-60s；浸于95％乙醇中醇化1min；醇溶性伊红浸染5-8s；浸于95％乙醇I、II各2-3s；浸于100％乙醇I、II脱水各1min；电吹风吹干；二甲苯透明5-15min；中性树胶封片，室温下晾干，拍照。

Masson染色：对石蜡切片进行脱蜡和脱水处理后进行Masson三色染色，用Weigert铁苏木素染色5-10min，冲洗；分化液分化5-15s，水洗；返蓝液返蓝1-5min，水洗；丽春红品红染色5-10min；弱酸洗1min；磷钼酸溶液洗1-2min；弱酸洗1min；苯胺蓝染色2min；95％的乙醇快速脱水；无水乙醇I、II、III各5-10s；二甲苯I、II、III各1-2min；中性树胶封固。

羟脯氨酸含量测定：首先称取20-30mg去除脂肪的皮肤组织，尽量切碎，用0.5M的醋酸和10g/L的胃蛋白酶进行提取，磁子搅拌12h；离心去除沉淀取上清，在上清中加入等体积的浓盐酸，110℃水解16h；按照国标的羟脯氨酸法将水解后的样品稀释一定倍数，调节pH至中性，加入氯胺T溶液混匀后室温放置20min；加入显色剂，充分混匀，铝箔封口于60℃水浴20min；流动水冷却至少3min，在室温下放置30分钟，以空白显色剂做对照，测定各样品在560nm处的吸收值并通过标准曲线进行计算得到羟脯氨酸含量。同样的步骤制备羟脯氨酸标准工作液用于标准曲线的绘制，实验独立重复3次。

2.实验结果

2.1皮肤损伤及修复情况

2.1.1小鼠皮肤HE染色结果

(1)空白组

空白组小鼠除脱毛外未进行紫外照射及治疗，从图3可以看到，脱毛后第2天时，空白组小鼠皮肤在纵切面上，可观察到表皮层的下层呈波浪状起伏，其中表皮向下生长形成皮突；小鼠背部皮肤较薄，颗粒层和透明层不明显，可见基底层和棘层；真皮主要由乳头层和网织层组成，两者间无明显界限，纤维致密有序，细胞核形态良好，无炎性细胞，附属器形态良好。第4天时，空白组小鼠皮肤在横切面上表皮下层波浪起伏不明显，附属器从表皮延伸至真皮。真皮层纤维连续，呈有序排列，细胞核形态良好，无炎性细胞；皮下脂肪及网状纤维形态良好。可见，空白组小鼠在第2天及第4天时皮肤整体呈健康、正常的状态。

(2)模型组

紫外照射后的模型组的小鼠未进行治疗，从图3可以看到，紫外照射第2天的皮肤HE染色结果显示，小鼠皮肤表皮全层受损，局部基底层水肿，局部结构缺失；真皮层血管扩张充血明显，网织层疏松水肿，炎性细胞浸润；附属器受损明显，大部分毛囊受损(纤维鞘萎缩乃至消失)。第4天，小鼠皮肤表皮结构比第二天较完整但棘层松解，局部增厚；真皮层纤维明显变粗，更加疏松，纤维间基质增多，水肿严重，炎性细胞浸润；附属器数量明显减少。可见，在未进行任何治疗的情况下，在紫外光损伤后第四天时，小鼠皮肤水肿持续加剧，炎性细胞浸润持续增多，损伤程度持续加剧。

(3)实验组1

实验组1的小鼠在紫外照射后1h用4ml牦牛胶原蛋白溶液(1.5mg/ml的实施例1制备的牦牛I型胶原蛋白)进行涂抹治疗，此后每天以相同剂量涂抹一次。从图3可以看到，牦牛胶原蛋白溶液治疗的小鼠皮肤在第2天时，小鼠表皮层损伤明显，结构不完整，局部基底层受损；真皮疏松水肿，炎性细胞浸润，毛囊受损(纤维鞘萎缩乃至消失)。第4天表皮全层可见，结构完整；真皮结构完整，附属器数目及形态正常；未见血管充血扩张。

对比模型组可见，牦牛I型胶原蛋白溶液对于紫外光损伤的皮肤修复效果良好，损伤后第四天，小鼠损伤皮肤恢复，且基本接近空白组小鼠皮肤的健康形态。

(4)实验组2

实验组2的小鼠在紫外照射后1h用4ml牦牛胶原蛋白液体复合物(实施例2制备)进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图4可以看到，第2天时，小鼠表皮层损伤明显，结构不完整，局部基底层受损；真皮层疏松水肿，炎性细胞浸润，毛囊受损(纤维鞘萎缩乃至消失)。第4天时，小鼠皮肤表皮结构完整，表皮全层可见，分层较明显；真皮层未见水肿，纤维致密连续，未见血管扩张；毛囊修复，附属器数量正常，形态良好。

(5)实验组3

实验组3的小鼠在紫外照射后1h用4g牦牛胶原蛋白膏霜复合物(实施例3制备)进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图4可以看到第2天时，小鼠表皮损伤、结构不完整且伤及基底层；真皮层疏松水肿，炎性细胞浸润，血管扩张充血。第4天时，小鼠表皮结构完整，表皮全层可见，分层明显；局部表皮较厚，真皮层纤维正常排列，附属器数量及形态正常，未见水肿及血管扩张。

可见，以含有牦牛胶原蛋白制成的液体及膏霜复合物对于紫外光损伤的皮肤具有良好的修复效果。

(6)对照组1

对照组1的小鼠在紫外照射后1h用4ml(1.5mg/ml)市售鱼胶原蛋白溶液进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图5可以看到第2天时小鼠表皮层受损严重，基底层受损；真皮层疏松水肿，炎性细胞浸润，血管充血扩张明显。第4天时，表皮结构较第二天完整但局部基底层水肿，棘层松解；真皮层疏松水肿，纤维变粗，基质增多；附属器数量明显减少，毛囊受损严重，炎性细胞浸润。修复效果不明显。

(7)对照组2

对照组2的小鼠在紫外照射后1h用4ml(1.5mg/ml)市售猪胶原蛋白溶液进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图5可以看到第2天时，小鼠表皮层损伤明显，结构不完整，局部基底层受损；真皮疏松水肿，炎性细胞浸润，毛囊受损(纤维鞘萎缩乃至消失)。第4天时，表皮结构较第二天完整但局部缺损，伤及基底层，伴有棘层松解；真皮层疏松水肿，纤维变粗，基质增多；附属器数量明显减少，毛囊受损严重，炎性细胞浸润。修复效果不明显。

(8)对照组3

对照组3的小鼠在紫外照射后1h用4ml(1.5mg/ml)市售牛胶原蛋白溶液进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图5可以看到第2天时，小鼠表皮损伤明显，结构不完整，部分表皮脱落(基底层尚连续，局部缺损)；真皮层水肿，纤维变粗、断裂，炎性细胞浸润，毛囊受损(纤维鞘萎缩乃至消失)，血管扩张充血。第4天时，小鼠皮肤表皮结构较第二天完整但不连续，局部有断裂；真皮层水肿，纤维变粗、断裂更加明显，血管扩张充血；附属器数量明显减少。修复效果不明显。

可见，市售鱼胶原蛋白、市售猪胶原蛋白、市售牛胶原蛋白对于紫外损伤的皮肤修复效果都不显著。

综上所术，本发明提供的牦牛I型胶原蛋白及其组合物对紫外损伤小鼠皮肤具有显著的修复作用，且效果优于市售鱼胶原蛋白、市售鱼胶原蛋白、市售牛胶原蛋白。

2.1.2小鼠皮肤组织学Masson染色结果

(1)空白组

空白组的小鼠除脱毛外未进行紫外照射及治疗。从图6可以看到，第2天时，空白组小鼠皮肤真皮乳头层内胶原纤维纤细并交织成网；此外，毛-皮脂腺单位、外泌汗腺、顶泌汗腺均被纤细网状胶原包绕，而血管也是被纤细薄层胶原纤维所环绕；网状层的胶原纤维是真皮最大的组成部分，其间的胶原纤维形成粗大的纤维束，在纵切面上呈轻微的波浪状，在水平面上向各个方向延伸，成纤维细胞散布在胶原纤维之间。第4天时，小鼠皮肤真皮层胶原纤维致密连续，附属器数目及形态良好，被胶原纤维围绕；胶原纤维形成较均匀粗大的纤维束，在纵切面上呈轻微的波浪状，在水平面上向各个方向延伸，成纤维细胞散布在胶原纤维之间

可见，空白组小鼠在第2天及第4天时皮肤真皮层胶原纤维、附属器形态良好，呈健康、正常的状态。

(2)模型组

紫外照射后的模型组的小鼠未进行治疗。从图6可以看到，紫外照射第2天模型组真皮层胶原纤维排列紊乱，胶原纤维明显减少、断裂、破碎、变粗、卷曲扭结、聚集成团；第4天时真皮层胶原纤维更加粗大，聚集成块，断裂严重，真皮层血管充血扩张。

可见，在未进行任何治疗的情况下，在紫外光损伤后第四天时，小鼠皮肤真皮层胶原纤维损伤持续加剧。

(3)实验组1

实验组1的小鼠在紫外照射后1h用4ml牦牛胶原蛋白溶液(1.5mg/ml实施例1制备的牦牛Ⅰ型胶原蛋白)进行涂抹治疗，此后每天以相同剂量涂抹一次。从图6可以看到，Masson染色结果显示，第2天时牦牛组真皮层胶原纤维排列紊乱，胶原纤维明显减少、断裂、破碎、卷曲，毛囊断裂破碎，血管充血扩张；第4天时真皮层胶原纤维明显增多，排列致密有序，附属器形态正常，连续的胶原纤维呈轻微的波浪状，在水平面上向各个方向延伸，成纤维细胞散布在胶原纤维之间。

对比模型组可见，牦牛Ⅰ型胶原蛋白溶液对于紫外光损伤的皮肤真皮层胶原纤维的修复效果良好，胶原纤维恢复到接近空白组的正常形态和密度。

(4)实验组2

实验组2的小鼠在紫外照射后1h用4ml牦牛胶原蛋白液体复合物(实施例2制备)进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图7可以看到第2天时小鼠皮肤真皮层胶原纤维明显减少、断裂、扭曲聚集成团，炎性细胞浸润；第4天时真皮层胶原纤维明显增多、连续，呈轻微的波浪状，在水平面上向各个方向延伸，成纤维细胞散布在胶原纤维之间，附属器形态正常。

(5)实验组3

实验组3的小鼠在紫外照射后1h用4g牦牛胶原蛋白膏霜复合物(实施例2制备)进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图7可以看到第2天时真皮层胶原纤维明显减少、断裂、聚集，真皮层血管充血扩张；第4天时真皮层胶原纤维明显增多，围绕完好的附属器呈波浪状有序排列，同时在水平面上向各个方向延伸，成纤维细胞散布在胶原纤维之间，附属器形态正常

可见，以牦牛Ⅰ型胶原蛋白为主制成的液体及膏霜复合物对于真皮层胶原纤维的修复具有明显的作用。

(6)对照组1

对照组1的小鼠在紫外照射后1h用4ml(1.5mg/ml)市售鱼胶原蛋白溶液进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图8可以看到第2天时真皮层胶原纤维明显减少、断裂、扭结、聚集，血管充血扩张；第四天时真皮层胶原纤维断裂、聚集成块，仍排列疏松，未见明显增多，炎性细胞浸润。基本无修复效果。

(7)对照组2

对照组2的小鼠在紫外照射后1h用4ml(1.5mg/ml)市售猪胶原蛋白溶液进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图8可以看到第2天时，真皮层胶原纤维明显减少、断裂、扭曲聚集，炎性细胞浸润；第四天时真皮层胶原纤维断裂、聚集，排列疏松，未见明显增多。修复效果不明显。

(8)对照组3

对照组3的小鼠在紫外照射后1h用4ml(1.5mg/ml)市售牛胶原蛋白溶液进行治疗，此后每天以相同剂量治疗一次。从图8可以看到第2天时，真皮层胶原纤维明显减少、断裂、扭结、聚集，血管扩张充血；第4天时真皮层胶原纤维断裂、聚集成块，排列疏松，血管充血扩张，炎性细胞浸润，但附属器数目正常。修复效果较不明显。

可见，市售鱼胶原蛋白、市售猪胶原蛋白、市售牛胶原蛋白对于真皮层胶原纤维的恢复没有明显的帮助。

综上所述，本发明提供的牦牛I型胶原蛋白及其组合物对紫外损伤小鼠皮肤具有显著的修复作用，能够促进紫外损伤皮肤真皮层胶原纤维的恢复，且效果优于市售鱼胶原蛋白、市售猪胶原蛋白、市售牛胶原蛋白。

2.2皮肤中羟脯氨酸含量测定

吸光度与羟脯氨酸含量的关系，即标准曲线为y＝0.183x+0.0232，R2＝0.9983。

将正常的空白组小鼠皮肤中羟脯氨酸的含量设定为标准，即100％(图9，1所示)，对其他组包括模型组、实验组和对照组进行标准化。模型组小鼠皮肤中羟脯氨酸含量仅为正常空白组的60.59％(图9，5所述)。相对于模型组，实验组1(牦牛Ⅰ型胶原蛋白溶液)小鼠皮肤中羟脯氨酸含量为正常空白组的106.13％(图9，3所示)；实验组2(实施例2制备的牦牛胶原蛋白液体复合物)小鼠皮肤中羟脯氨酸含量为正常空白组的106.65％(图9，2所示)；实验组3(实施例2制备的牦牛胶原蛋白膏霜复合物)小鼠皮肤中羟脯氨酸含量为正常空白组的96.02％(图9，4所述)；实验组1-3小鼠皮肤中羟脯氨酸含量恢复至正常空白组的96％至107％之间，接近或优于正常空白组。市售胶原中，对照组1(市售鱼胶原蛋白)小鼠皮肤中羟脯氨酸含量比例低于模型组，仅为空白组的42.41％(市图9，8所示)；对照组2(市售猪胶原蛋白)小鼠皮肤中羟脯氨酸含量高于模型组，但也仅为空白组的62.82％，与实验组结果(96％-107％)相差显著(图9，6所示)；对照组3(市售牛胶原蛋白)与模型组中羟脯氨酸含量接近，为60.96％(图9，7所示)。以上结果表明，只有本发明所述的牦牛Ⅰ型胶原蛋白及其组合物能够显著提高紫外损伤小鼠皮肤中羟脯氨酸的含量。其中，羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸，羟脯氨酸含量越多，代表胶原蛋白含量越多。所以，只有本发明所述的牦牛Ⅰ型胶原蛋白及其组合物能够显著提高紫外损伤小鼠皮肤中胶原蛋白的含量，促进紫外损伤小鼠皮肤中胶原纤维的修复与重建。

综上所述，本发明所述的牦牛Ⅰ型胶原蛋白及其组合物能够显著提高紫外光损伤小鼠皮肤中胶原蛋白的含量，促进小鼠损伤皮肤中胶原蛋白的修复，牦牛胶原蛋白及其复合物对于紫外光损伤皮肤具有良好的修复效果。紫外光对于皮肤的损伤主要体现在表皮层细胞的损伤和真皮纤维的损伤等，紫外光可直接损伤DNA或诱发氧化反应产生自由基等机制作用于机体细胞，这种光诱导损伤可使DNA空间结构发生变化，从而阻碍了DNA复制、转录进而影响蛋白质的生物功能，同时紫外光辐射为真皮胶原纤维的聚集、交联和断裂等行为提供了能量。皮肤细胞中UV辐射损伤的积累会导致相应的病理变化，如皮肤炎症、免疫抑制，严重时可导致皮肤癌的发生。本实验中的光损伤均为100mJ/cm²的紫外辐射造成的损伤，由此我们可以推论其他类型所造成的至少是同等强度的损伤都可以被牦牛胶原蛋白及其复合物修复，比如激光、红光、蓝光等不同来源的电磁辐射。

以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。