阅读说明：本技术 针对白喉类毒素的检测抗体对及其应用 (Detection antibody pair aiming at diphtheria toxoid and application thereof ) 是由 陈雯 胡业勤 郑梦婷 杨晓明 段凯 李新国 张智 于 2019-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体的,涉及针对白喉类毒素的检测抗体对及其应用,所述的单克隆抗体,所述的抗体为抗体2B17-B和3K8,2B17-B重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；3K8的重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明还涉及编码所述单克隆抗体2B17-B、3K8的核酸序列以及由其制备的检测白喉类毒素的试剂盒。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to a detection antibody pair aiming at diphtheria toxoid and application thereof, wherein the monoclonal antibody is an antibody 2B17-B and 3K8, the amino acid sequence of a heavy chain variable region (VH) of the antibody 2B17-B is shown as SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence of a light chain variable region (VL) is shown as SEQ ID NO. 2; the heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of 3K8 is shown in SEQ ID NO.3, and the light chain variable region (VL) amino acid sequence is shown in SEQ ID NO. 4. The invention also relates to a nucleic acid sequence for encoding the monoclonal antibodies 2B17-B and 3K8 and a kit for detecting diphtheria toxoid by the nucleic acid sequence.)

针对白喉类毒素的检测抗体对及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种针对白喉类毒素的检测抗体对及其应用。

背景技术

白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌，病人及带菌者是唯一的传染源；人对白喉普遍易感，只有通过接种免疫才能使人群获得对白喉毒素持久的免疫力。接种白喉类毒素的不良反应一般由制品中非毒素蛋白引起的，随着白喉类毒素质量的提升，接种反应会减少。因此，在白喉类毒素生产过程中监控其质量尤为重要。根据《中国生物制品规程》的要求，常用的白喉类毒素的效价测定采用两种方法，一是免疫动物产生特异性的免疫应答；二是絮状单位测定法；由于动物实验周期长、影响因素多；絮状单位测定法为肉眼判断，存在一定误差。因此，人们期望采用简单、快速、灵敏、影响因素少的方法监控生产过程中的白喉类毒素质量。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有灵敏、快速、耐受性强的优点，能够用于白喉类毒素生产过程中的类毒素的质量控制。

发明内容

本发明首先涉及一组单独和/或联合检测白喉类毒素(Diphtheria Toxoid，DT)的单克隆抗体，所述的抗体为：

(1)单克隆抗体2B17-B，

其重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，SEQIDNO.1：

轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，SEQIDNO.2：

(2)单克隆抗体3K8，

其重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，SEQIDNO.3：

轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，SEQIDNO.4：

本发明还涉及编码所述单克隆抗体2B17-B、3K8的核酸序列。

所述的2B17-B、3K8单克隆抗体的恒定区(Fc)区为鼠源Fc。

所述的单克隆抗体2B17-B、3K8都是鼠源抗体。

本发明还涉及所述单克隆抗体2B17-B、3K8在制备白喉类毒素得检测试剂中的应用。

本发明还涉及一种检测白喉类毒素的检测试剂盒，所述的试剂盒包含：

(1)检测有效量的2B17-B抗体和/或3K8抗体；

(2)必要的显色或定量试剂。

优选的，所述的试剂盒是酶联免疫(ELISA)试剂盒。

更优选的，所述

酶联免疫试剂盒为双抗夹心法酶联免疫试剂盒，其中，

(1)使用单克隆抗体2B17-B为包被抗体或捕获抗体；

(2)使用标记有定量标签的3K8抗体为检测抗体或第二抗体；

所述的有定量标签优选为辣根过氧化物酶或生物素。

附图说明

图1、双抗ELISA检测时的线性范围。

具体实施方式

本发明所使用的主要试剂及其来源为：

anti-DT-2B17-B单克隆抗体的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示、anti-DT-3K8单克隆抗体的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；

96孔酶标板购自厦门云鹏科技有限公司；白喉类毒素标准品购自NIBSC(编号02/176)；

其他试剂若无特别说明，均为国产分析纯。

实施例1.双抗体ELISA检测方法的建立

1、线性范围与抗体工作浓度的确定

(1)按照常规包被条件，将包被的一抗anti-DT单克隆抗体(2B17-B)稀释至5μg/ml进行包被(2-8℃包被16-24小时，包被液配方：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加纯化水到1L，调pH至9.5-9.6)

(2)次日用PBST清洗掉未结合上的包被抗体，然后加入1％BSA进行封闭(37℃封闭1小时)，即制得包被了一抗的酶标板；

(3)使用时，依次加入系列稀释的白喉类毒素标准品、系列稀释的辣根过氧化物酶标记的anti-DT单克隆抗体(3K8-HRP)，37℃反应后加入辣根过氧化物酶显色体系的底物A/B液显色，最后用2M硫酸终止后读取特异性吸光值。

经过试验，结果显示，我们最终得出酶的最佳工作稀释倍数为4000倍；在0.00026-0.00425Lf/ml范围内，吸光值与检测浓度(Lf/ml)呈高度线性相关(R²＞0.98)。

实施例2、双抗体ELISA检测方法的验证

1、专属性的验证

将百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、百日咳丝状血凝素(Filamentousheamagglutinin,FHA)、百日咳黏附素(pertactin,PRN)及破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)稀释至适宜浓度，白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)作为阳性对照品加入，用实施例1制备的检测试剂盒检测，发现除白喉类毒素外的上述抗原均不能被检出，说明该检测方法特异性好。结果见表1。

表1.专属性的验证

*cutoff为空白对照OD均值的2.1倍；其中空白对照OD值低于0.05的按照0.05带入计算。

2、准确度的验证

将白喉类毒素稀释至高、中、低三个浓度，用实施例1制备的检测试剂盒检测，每个浓度做6次重复。统计高、中、低三个浓度的检测回收率*，发现回收率在90％-115％之间，说明该检测方法的准确度高。结果见表2。

表2.准确度的验证

*回收率的计算为：

3、精密度的验证

(1)精密度-重复性

将白喉类毒素稀释至高、中、低三个浓度，用实施例1制备的检测试剂盒检测，每个浓度做6次重复。统计不同浓度6次检测的变异程度，发现变异系数CV均低于5％，说明该检测方法的重复性好。结果见表3。

表3.精密度-重复性

(2)精密度-中间精密度

将白喉类毒素稀释至高、中、低三个浓度，由同一检测人员不同天进行检测；同时由三个检测人员在同一天检测；统计同一检测人员不同检测日期的变异程度及不同检测人员之间的变异程度，发现变异系数CV均低于10％，说明该检测方法的精密度好。结果见表4。

表4.精密度-中间精密度

(3)精密度-线性与范围验证

将白喉类毒素标准品稀释至线性检测范围内各浓度，重复测定5次，统计各次检测相关系数R2，发现相关系数R²均大于0.98，说明该检测方法的线性好。结果见表5。

表5.线性与范围验证

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉生物制品研究所有限责任公司

<120> 针对白喉类毒素的检测抗体对及其应用

<130> 1125

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ala Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Phe

20 25 30

Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Asp Tyr Met Gly

35 40 45

Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

50 55 60

Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Val Tyr Pro Leu

115 120 125

Ala Pro

130

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Val Ile Ser Cys Ser Leu Asn Leu Gln Gln Phe Met Ser Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr

20 25 30

Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu

35 40 45

Leu Phe Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr

50 55 60

Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala

100 105 110

Ala Pro Thr Gly Ser Ile Phe

115

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Trp

20 25 30

Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

His Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro

130

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Thr Pro

1 5 10 15

Gly Asp Arg Leu Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala

100 105 110

Ala Pro Thr Gly Ser Ile Phe

115