阅读说明：本技术 抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白c的抗体及其应用 (Antibody for resisting staphylococcus aureus manganese ion binding protein C and application thereof ) 是由 曾浩 葛爽 宋振 邹全明 刘圆圆 敬海明 赵莉群 张怡 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体及其应用,所述抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体识别的表位肽至少包括MntC<Sub>126-128aa</Sub>,氨基酸序列为LDN；该抗体通过培养表达载体的宿主细胞来生成单克隆抗体,生成的单克隆抗体被分泌到上清液中,通过层析技术将其纯化。本发明的抗体可以治疗由MRSA感染引起的脓毒血症,在预防和治疗金黄色葡萄球菌感染方面有重要意义。(The invention discloses an antibody for resisting staphylococcus aureus manganese ion binding protein C and application thereof, wherein epitope peptide recognized by the antibody for resisting staphylococcus aureus manganese ion binding protein C at least comprises MntC 126‑128aa The amino acid sequence is LDN; the antibody is produced by culturing host cells expressing the vector to produce a monoclonal antibody, which is secreted into the supernatant and purified by chromatographic techniques. The antibody can treat sepsis caused by MRSA infection, and has important significance in preventing and treating staphylococcus aureus infection.)

抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及医学及免疫学领域，具体涉及抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体，还涉及抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体的应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)，为革兰阳性菌，是一种流行广泛、造成医院、社区相关感染的主要人类病原菌，可引起人类的多种疾病。感染以急性和化脓性为主。全身感染可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，病死率可达20％。长期抗生素滥用使得细菌耐药问题日益加剧和突出。1961年耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)被首次发现，被称作“超级细菌”一直以来呈多重耐药性发展，目前MRSA已成为ICU病房、术后感染、烧伤等感染率最高的革兰阳性菌，已成为临床上治疗的难题，严重威胁人类健康。随着2002年耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant staphylococcus aureus,VRSA)的相继出现，万古霉素治疗MRSA的最后一道防线已被突破，目前临床上的感染面临“无药可救”的严峻形势。因此，寻找抗MRSA药物成为近年来治疗MRSA研究领域的重要方向。

金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C(MntC)是一种高度保守的细胞表面蛋白，也是金葡菌全身感染的重要毒力因子，通过促进从宿主环境中获取锰离子在金黄色葡萄球菌感染中其重要作用。锰离子转运蛋白活性的丧失或降低会使金黄色葡萄球菌对氧化应激敏感，从而使细菌容易受到免疫细胞的攻击而死亡，同时MntC具有黏附素活性，可能是金黄色葡萄球菌发病机理的一个特征。近年来，金黄色葡萄球菌疫苗经历了荚膜多糖疫苗、DNA疫苗和灭活疫苗几大阶段，但都未取得成功，基于抗体药物的被动免疫治疗MRSA感染，一方面它可以在第一时间迅速给感染者建立起特异的免疫保护，快速高效清除病原体，另一方面，它还可以帮助那些免疫力低下甚至免疫缺陷的MRSA易感人群获得即时、有效的免疫保护。

因此本发明基于上述背景，有必要开发一种抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体；本发明的目的之二在于提供编码所述抗体的核苷酸序列；本发明的目的之三在于提供抗体在制备特异性结合金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的试剂中的应用；本发明的目的之四在于提供所述抗体在制备治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体，所述抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体识别的表位肽至少包括MntC_126-128aa，氨基酸序列为LDN。

优选的，所述抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体识别的表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15所示。

优选的，所述抗体包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示或具有同等功能的CDR变体组成；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示或具有同等功能的CDR变体组成。

重链的CDR区的位置如下：

VH外显子内的CDR1区氨基酸26至33；

VH外显子内的CDR2区氨基酸51至58；

VH外显子内的CDR3区氨基酸97至108。

轻链的CDR区的位置如下：

Vλ外显子内的CDR1区氨基酸27至32；

Vλ外显子内的CDR2区氨基酸50至52；

Vλ外显子内的CDR3区氨基酸89至97。

优选的，所述抗体的恒定区包括人源IgM、IgA或IgA恒定区中的任意一种。

优选的，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或与SEQ ID NO.4至少85％的同源性且与金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列；所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与SEQ ID NO.8至少85％的同源性且与金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列。

优选的，所述金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的全长氨基酸如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述抗体与金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C结合的平衡解离常数不高于1×10^-8；如：1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M或更小的KD与金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C解离。其中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，表示处于平衡状态时抗体和抗原的解离程度。KD越小说明解离越小，代表抗体与抗原间的亲和力越强。

本发明的抗体是以从MntC抗体效价高的志愿者外周单个核细胞中分选单个浆细胞，以其mRNA为模板扩增抗体重链、轻链可变区基因。通过重叠延伸PCR分别将抗体重链、轻链可变区基因与启动子，人恒定区及多聚A尾连接，构建成单克隆抗体线性表达载体。然后构建含有所述核酸分子的重组表达载体的宿主细胞。常见的有原核表达系统和真核表达系统，原核宿主细胞如细菌细胞；真核宿主细胞如植物细胞和哺乳动物细胞。特别优选的是人生产细胞系。

编码所述抗体的核苷酸序列。

因核苷酸序列与氨基酸序列是对应关系，所述抗体的具体氨基酸序列决定了此核酸分子的核苷酸序列，在抗体氨基酸序列确定的情况下，可根据氨基酸序列获得相应的、合适且合理的核苷酸序列。优选的，重链核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.17。

优选的，所述抗体在制备特异性结合金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的试剂中的应用。

优选的，所述抗体在制备治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

本文使用的术语“变体”指的是通过***、删除或替换一个或多个氨基酸，或通过化学衍生化氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列中的核苷酸，或序列的一个或两个远端来修饰这一序列所得到的序列，还包括天然等位突变，其中，修饰不会影响(特别是不会损失)这一序列的活性。

本发明中，术语“CDR区”意指抗体的互补决定区，即决定抗体对特定抗原的特异性的区域。重链和轻链两者上的CDR1至CDR3共同组成抗体的抗原结合部位。

本发明的有益效果在于：本发明提供了抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体，该抗体通过培养表达载体的宿主细胞来生成单克隆抗体，生成的单克隆抗体被分泌到上清液中，通过层析技术将其纯化。

本发明的抗体可以治疗由MRSA感染引起的脓毒血症，在预防和治疗金黄色葡萄球菌感染方面有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1是本发明中的单个浆细胞分选图。

图2是本发明中的MntC单克隆抗体M0686的SDS-PAGE检测结果。

图3是本发明中的MntC单克隆抗体M0686与MntC的结合活性检测。

图4是本发明利用生物膜干涉技术分析MntC与M0686相互作用结果。

图5是本发明中的MntC变性胶WB结果图。

图6是本发明中的M0686抑制MntC产生细胞因子的结果图(A：IL-5；B：IL-17A；C：IFN-γ)。

图7是本发明中的M0686对MRSA脓毒血症动物模型评价结果图。

图8是本发明中的组织学分析来评价抗体的有效性。

图9是本发明中的MntC Mapping多肽Elisa结果图(A：多肽与M0686单克隆抗体结合结果；B：MntC_129-143aa、MntC_132-143aa和MntC_135-143aa与M0686结合结果)。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义，以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C(MntC)的表达与纯化

将来自金黄色葡萄球菌菌株(ATCC登录号为BAA-1556)的基因组DNA通过PCR扩增MntC基因。DNA测序证明后，将其在大肠杆菌中表达，在含有氨苄西林的LB培养基内37℃培养过夜，离心收获细胞。利用Ni-NTA纯化获得MntC蛋白，MntC蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

实施例2、外周血单个核细胞(PBMC)的分离

招募健康的志愿者和严重感染金黄色葡萄球菌后痊愈的志愿者，采集静脉血样本于含有肝素的抗凝管中，利用密度离心法分离PBMC细胞，具体操作如下：取静脉血于22℃、400×g、离心15min；吸取上层透明血浆层，置于-80℃冻存；吸取上清后，与等量的RPMI1640(Gibco)充分混匀，沿倾斜的管壁缓慢加入到等量淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心20min，吸取云雾层的单个核细胞于无菌离心管中，加入5倍以上体积的RPMI1640，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，适量RPMI1640重悬细胞以1×10⁷/支冻存于液氮中备用。

实施例3、流式细胞仪分选单个浆细胞

以MntC保护性抗原蛋白(HPLC纯度﹥95％)为抗原对血清进行ELISA检测确定样本的抗体滴度，选择抗体滴度高的样本，通过流式细胞仪分选单个浆细胞，通过CD3/CD14/CD16/CD235a-CD19+CD20+/-CD38hi CD27hi设门分选，将不同时间点的浆细胞群分离出来，结果如图1所示。通过血清学实验与B淋巴细胞表型的分析，可以保证我们能从>3％的浆细胞群中获得大量的单个浆细胞，并从中分离抗MntC的全人源单克隆抗体的基因序列，重链核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，分选到细胞数量较多状态良好。

实施例4、抗MntC抗体的克隆和全人源抗体的表达

使用SuperscriptV逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)和随机引物合成cDNA的第一链。使用Ig引物组(重链的恒定区引物序列：5’-gcggccctgggctgcctggtcaag-3’(SEQID NO.2)；轻链的恒定区引物序列：5’-aggagagtgtcacagagcaggacag-3’(SEQ ID NO.3))通过PCR扩增人Ig V_H和V_K/L，将扩增的V_H和V_K/L产物克隆到TOPO TA载体中，并进行测序。再将上述扩增产物通过PCR进行再扩增，产物用质量分数为1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

抗体基因序列测定与生物信息学分析：将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体基因PCR产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒进行纯化，并分别从正向与反向进行序列测定，用IMGT在线服务器(http：//imgt.cines.fr/)来分析抗体基因家族、突变率、亚型及CDR区，新的抗体基因录入抗体基因库中。

将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因的PCR产物利用TA克隆的方法连接到pcDNA3.3载体上，构建全人源抗MntC抗体的表达载体，然后将表达载体转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄西林的平板上37℃培养过夜，挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，28个循环；72℃延伸5min，取5μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果显示，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链和轻链基因的转化子。

实施例5、全人源抗MntC抗体的表达和纯化

将实施例4中所得阳性转化子中的载体质粒转化DH5α进行大量扩增，快速提取重组质粒后，将Ig V_H、V_K/L与转染试剂PolyFect共转染HEK293细胞，转染后5-6小时补充HEK293基础培养基(OPM)，并在37℃、5％CO₂培养箱中培养96小时，3000×g离心30分钟收集转染上清，利用蛋白A亲和层析法进行纯化；通过SDS-PAGE检验抗体的表达及纯化情况。SDS-PAGE检测结果如图2所示，结果显示转染细胞成功表达了抗体，命名为全人源MntC单克隆抗体M0686，简称M0686抗体或M0686单克隆抗体，且该抗体的相对分子量约160-180KD，重链约55KD，轻链约25KD；重链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；轻链氨基酸序列如SEQID NO.8所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示。

实施例6、表达抗体结合活性的测定

以重组表达的MntC蛋白为抗原包被ELISA板，每孔100μL，4℃过夜包被，用封闭液37℃封闭2个小时。加入100μL Overlapping PCR转染表达抗体(一抗)原液。阳性对照为阳性血浆样本原液(1：50倍稀释)和M0686抗体(1：1000倍稀释)每孔100μL3个复孔。阴性对照为阴性血浆样本原液(1：50倍稀释)和阴性对照无关抗体IgG1 0.5μg/mL，每孔100μL3个复孔，空白加100μL封闭液3个复孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板一次(3个循环)，每孔加100μL用PBST按1:5000进行稀释的Goat-Anti-IgG-Fab-HRP(二抗)，37℃孵育40分钟。PBST缓冲液洗板一次(6个循环)，避光，每孔加TMB 100μL，37℃放置8min，立即用50μL的2M H₂SO₄终止，双波长450nm检测OD值。计算阴性对照无关抗体IgG1的均值，算出阈值(均值的3倍)，大于阈值为阳性抗体。

实验显示，全人源单克隆抗体M0686能与MntC结合(图3)，EC50分别为0.02843μg/ml(表1)。

表1、M0686和MntC的EC50

Ag	EC50(ug/ml)
		Ab	MntC
M0686	0.02843

实施例7、生物膜干涉技术(BLI)测定抗原抗体亲和力

使用生物膜干涉技术来测量M0686与MntC的亲和力，将表达纯化得到的M0686单克隆抗体25nM固化到AHC传感器上，MntC两倍连续稀释物(3.13nM至50nM)以按照样品板排列加样，按照“基线检测-加载检测-淬火-淬火-洗板-基线检测-结合检测-解离检测”的程序设定进行操作。计算结合速率常数(kon)、解离速率常数(kdis)、平衡解离常数(KD)，结果如表2和图4所示。结果显示，M0686与SEB的KD为1.67×10^-9M。

表2、M0686与MntC的结合亲和力数据

Ag	KD(M)	Kon(1/Ms)	Kdis(1/s)
				MntC	1.67×10<sup>-9</sup>	6.93×10<sup>5</sup>	1.16×10<sup>-3</sup>

实施例8、M0686抗体表位类型的确定

蛋白样品制备：在2μg MntC蛋白样品中加入3μL还原型Loading Buffer(含β－巯基乙醇)，体积用超纯水调整至12μl，并在沸水浴中煮5min。同时安装电泳槽，并根据达科为试剂盒制备电泳胶，加入电泳缓冲液，拔掉梳子后上样。连接电极，开启电泳仪，调整电压为300V，电泳时间为1-2h，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。取出电泳胶而后用水冲洗。取出用电转缓冲液浸泡的滤纸，和一张用甲醇活化后的PVDF膜，用转膜仪进行转移，顺序依次为(3层滤纸块，PVDF膜，电泳胶，3层滤纸块)调整电压为23V，时间为23分钟。转膜后取PVDF膜，用PBST洗涤一次，而后将PVDF膜置于5％脱脂奶粉中封闭，37度2小时。取出PVDF膜，用PBST洗涤3次，每次5分钟，而后将M0686用PBST稀释至1ug/ml,37度孵育一小时。随后按照1：5000加入抗人IgG-AP，将PVDF膜放入上述溶液中，置于水平摇床上室温孵育40分钟。

PBST液，2L一袋PBS,1mL Tween20，加水补至2L，混匀后使用。

PVDF膜用PBST溶液洗3次，每次5min；将PVDF膜放入干净的平皿中，每块膜避光滴加约1mL的AP显色液，观察条带显色，至条带明显时，加入水终止反应。图5显示，M0686能够和变性后的MntC结合，由此判断M0686抗体的表位为线性表位。

实施例9、M0686抑制由MntC刺激产生的细胞因子

对20只6-8周龄雌性BALB/c小鼠四肢进行肌肉注射免疫，免疫剂量为MntC蛋白(浓度为1.6mg/ml)30μg/次/只，Alum佐剂50μl/次/只，于第0、14、21天进行三次免疫。免疫后第七天，手术分离小鼠脾细胞并制备单细胞悬液，取脾细胞研磨。加入红细胞裂解液，1000rpm，5min。而后加入RPMI1640培养基，1000rpm，5min，洗涤2次，而后加入带有血清的1640培养基，调整细胞浓度为5×10⁶，每孔100μl。将MntC(终浓度为50μg/ml)与等体积M0686的两倍连续稀释物(终浓度为10μg/ml)混合后在37度孵箱中孵育30min，100μl/孔加入细胞上层，阳型对照加入100μl MntC(50ug/ml)，阴性对照加入100μl 1640培养基，均为3个复孔，37℃培养72h，2500rpm，20min收取细胞培养上清，采用达科为试剂盒检测各孔IL-5、IL-17A、IFN-γ的浓度，结果如图6所示，结果显示，随着MntC浓度的增加，淋巴细胞IL-5、IL-17A、IFN-γ的浓度也越高。

然后按如下计算抑制率：

抑制率＝(阳性对照细胞因子浓度-抗体组细胞因子浓度)/(阳性对照细胞因子浓度-阴性对照细胞因子浓度)。

计算结果显示，在恒定浓度的MntC下，M0686的浓度越高，对淋巴细胞IL-5、IL-17A、IFN-γ产生的抑制率也越高，在M0686浓度为10μg/ml是抑制率达到80％-90％。

实施例10、MRSA致死模型的建立及保护性评价

实验证明将9×10⁸CFUMRSA252尾静脉攻毒小鼠，致死率可达到90％左右。故以此菌量来确定MRSA脓毒血症模型的建立。

取30只小鼠，分为3组，每组10只，第一组注射1.6mg M0686,100μL；第二组注射1mgM0686，100μL；第三组注射高压过的PBS，100μL。24h后，将9×10⁸CFUMRSA252以尾静脉的方式注射所有小鼠，体积100μL，观察小鼠7d并记录小鼠的生存情况(图7)。实验表明，1.6mgM0686可以保护80％的小鼠，1mg小鼠可以保护40％的小鼠，结果表明，M0686可以在一定程度上保护MRSA感染导致的脓毒血症，可以在一定程度上预防和延缓疾病的进展。

实施例11、组织学鉴定抗体的有效性

取10只小鼠，每组5只，第一组注射1.6mg M0686,100μL,第二组注射高压过的PBS，100μL。24h后，将8×10⁹CFU的MRSA252以尾静脉方式注入小鼠体内，体积100μL。感染后24h人道的处死小鼠，并收集小鼠的肺和脾的组织，将组织固定在10％***中，包埋在石蜡中，切片，并用苏木精和伊红染色，以100和40倍的放大倍率观察切片，比较对照组和抗体组的肺泡是否完整，脾中是否有中性粒细胞浸润，结果如图8所示。

实施例12、抗原表位的确定

将MntC氨基酸序列截断，合成长度为18位氨基酸的多肽，相邻的两个多肽之间的6个氨基酸重叠，据此合成24条多肽。合成的MntC多肽用DMSO溶解，将24段多肽用碳酸盐包被液稀释，使其浓度为40μg/mL，每孔100μL，3个复孔包被ELISA板，37℃孵育2个小时，取出用PBST缓冲液洗板3次，而后用封闭液封闭过夜。阳性对照为重组MntC蛋白2μg/ml，阴性对照碳酸盐包被液，每孔100μL 3个复孔，37度孵育1小时。用PBST缓冲液洗板3次，将M0686用PBST稀释成2μg/ml，每孔100μl，37度孵育1小时，用PBST缓冲液洗板3次，每孔加100μL用PBST缓冲液按1:5000进行稀释Goat-Anti-IgG-Fab-HRP(二抗)，37℃孵育40h。PBST缓冲液洗板五次，避光，每孔加TMB 100μL，37℃放置5min，立即用50μL的2MH2SO4终止。双波长450/630nm检测OD值。计算阴性对照无关抗体IgG1的均值，算出阈值(均值的2.1倍)，大于阈值为阳性抗体。结果如图9中A所示。结果显示，MntC_126-143aa多肽能够和M0686单克隆抗体结合，序列如下：LDNGIKYVKTIQQTFIDN(SEQ ID NO.12)由此M0686单克隆抗体识别的抗原位点至少包括LDNGIKYVKTIQQTFIDN(SEQ ID NO.12)整段氨基酸序列全长或者部分片段及部分氨基酸。

将LDNGIKYVKTIQQTFIDN氨基酸继续截短表达，合成MntC_129-143aa(SEQ ID NO.13)、MntC_132-143aa(SEQ ID NO.14)、MntC_135-143aa(SEQ ID NO.15)三段氨基酸，序列如表3所示，采用ELISA进行表位定位，结果如图9中B所示。

表3、截短合成氨基酸序列

多肽	氨基酸序列
		MntC<sub>129-143aa</sub>	GIKYVKTIQQTFIDN(SEQ ID NO.13)
MntC<sub>132-143aa</sub>	YVKTIQQTFIDN(SEQ ID NO.14)
		MntC<sub>135-143aa</sub>	TIQQTFIDN(SEQ ID NO.15)

结果显示，截短合成后的氨基酸序列都未能与M0686结合，由此可知M0686单克隆抗体识别的位点至少包括MntC_126-128aa。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学

<120> 抗金黄色葡萄球菌锰离子结合蛋白C的抗体及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)

<400> 1

Gly Pro Leu Gly Ser Ser Ser Asp Lys Ser Asn Gly Lys Leu Lys Val

1 5 10 15

Val Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Ala Lys Asn Val Gly Gly

20 25 30

Asp Asn Val Asp Ile His Ser Ile Val Pro Val Gly Gln Asp Pro His

35 40 45

Glu Tyr Glu Val Lys Pro Lys Asp Ile Lys Lys Leu Thr Asp Ala Asp

50 55 60

Val Ile Leu Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly Asn Gly Trp Phe

65 70 75 80

Glu Lys Ala Leu Glu Gln Ala Gly Lys Ser Leu Lys Asp Lys Lys Val

85 90 95

Ile Ala Val Ser Lys Asp Val Lys Pro Ile Tyr Leu Asn Gly Glu Glu

100 105 110

Gly Asn Lys Asp Lys Gln Asp Pro His Ala Trp Leu Ser Leu Asp Asn

115 120 125

Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Gln Thr Phe Ile Asp Asn Asp

130 135 140

Lys Lys His Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Gln Gly Asn Lys Tyr Ile Ala

145 150 155 160

Gln Leu Glu Lys Leu Asn Asn Asp Ser Lys Asp Lys Phe Asn Asp Ile

165 170 175

Pro Lys Glu Gln Arg Ala Met Ile Thr Ser Glu Gly Ala Phe Lys Tyr

180 185 190

Phe Ser Lys Gln Tyr Gly Ile Thr Pro Gly Tyr Ile Trp Glu Ile Asn

195 200 205

Thr Glu Lys Gln Gly Thr Pro Glu Gln Met Arg Gln Ala Ile Glu Phe

210 215 220

Val Lys Lys His Lys Leu Lys His Leu Leu Val Glu Thr Ser Val Asp

225 230 235 240

Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys Asp Ile Phe

245 250 255

Gly Glu Val Tyr Thr Asp Ser Ile Gly Lys Glu Gly Thr Lys Gly Asp

260 265 270

Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Glu Thr Val His Gly Ser

275 280 285

Met Lys

290

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggccctgg gctgcctggt caag 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggagagtgt cacagagcag gacag 25

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ile Ile Arg Ser Asp Gly Ser Asn Tyr Lys His Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Gly Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Ala Gly Asp Leu Leu Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr Gly

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ile Arg Ser Asp Gly Ser Asn Tyr

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Arg Gln Ala Gly Asp Leu Leu Tyr Leu Asp Leu

1 5 10

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Val Gly Thr Asp

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Ser Val Gly Thr Asp

1 5

<210> 10

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Thr Ser

1

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Leu Asp Asn Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Gln Thr Phe Ile

1 5 10 15

Asp Asn

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Gln Thr Phe Ile Asp Asn

1 5 10 15

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Tyr Val Lys Thr Ile Gln Gln Thr Phe Ile Asp Asn

1 5 10

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Thr Ile Gln Gln Thr Phe Ile Asp Asn

1 5

<210> 16

<211> 476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcggccgtt attctgggtt ccccaggttc cactggtgac gaggttcagc tggtggagtc 60

tgggggaggc gtggtccagc cagggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt 120

caccttcgac aactatggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gcctggagtg 180

ggtggcaatt attcggtctg atggcagtaa ttataaacat gcagactccg tgaagggccg 240

attcagcatc tccagagaca attccaggga cacactgttt ctgcaaatga ccggcctgcg 300

agtcgaagac acagctattt attactgtgc gagacaggct ggagacctcc tttaccttga 360

cctctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccaagg gcccatcggt 420

cttccccctg gcaccctcct ccaggagcac ctctggggga caagcggccc aaaaga 476

<210> 17

<211> 382

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgggttccc aggttccact ggtgacgata ttgtgatgac ccagtctcca ccctccctgt 60

ctgcatctgt cggcgacaga atcaccatca gttgccggac aagtcaaagt gttggcaccg 120

atttaaattg gtatcagcag aaagcaggaa aagcccctga actcctcgtc tattctacat 180

ccagtttgca gagtggggtc ccatcaaggt tccgtggaag tggatctggg acagaattca 240

ctctcaccat cagcagcctg caacctgaag attttgcaac gtactactgt cagcagagtt 300

acactacccc gctcactttc ggcggaggga ccaaggtgga catcaaacga actgtggctg 360

caccatctgt cttcatcttc ca 382