从硫酸软骨素发酵液中提纯硫酸软骨素的方法
阅读说明：本技术 从硫酸软骨素发酵液中提纯硫酸软骨素的方法 (Method for purifying chondroitin sulfate from chondroitin sulfate fermentation liquor ) 是由 张国银 何永进 于 2019-05-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从硫酸软骨素发酵液中提纯硫酸软骨素的方法,它包括发酵液灭活、固液分离、滤液浓缩洗涤、树脂吸附、树脂洗脱、洗脱液浓缩洗涤和洗脱浓相干燥步骤。它是将硫酸软骨素发酵液经过灭活、固液分离和滤液浓缩洗涤步骤,制得滤液浓相；将滤液浓相上阴离子交换树脂吸附,再用氢氧化钠或者氯化钠溶液洗脱,将洗脱液进行浓缩过滤和洗涤,制得洗脱浓相,将洗脱浓相进行干燥制得本发明的硫酸软骨素产品。该方法操作简便、低污染、回收率高,适合大批量工业化生产。(The invention discloses a method for purifying chondroitin sulfate from chondroitin sulfate fermentation liquor, which comprises the steps of fermentation liquor inactivation, solid-liquid separation, filtrate concentration and washing, resin adsorption, resin elution, eluent concentration and washing, and elution concentrated phase drying. Carrying out inactivation, solid-liquid separation and filtrate concentration and washing on chondroitin sulfate fermentation liquor to obtain a filtrate concentrated phase; adsorbing the filtrate concentrated phase with anion exchange resin, eluting with sodium hydroxide or sodium chloride solution, concentrating, filtering and washing the eluent to obtain an eluted concentrated phase, and drying the eluted concentrated phase to obtain the chondroitin sulfate product. The method has the advantages of simple operation, low pollution, high recovery rate, and suitability for large-scale industrial production.)
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，尤其是一种从硫酸软骨素发酵液中提纯硫酸软骨素的方法。
背景技术
硫酸软骨素(CS)，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺以β-1，4糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的多糖，在C-4、C-6位的羟基上发生硫酸酯化而成。作为重要的生物高分子，在保健品和药品中得到广泛应用，主要用于镇痛抗炎、促进骨骼细胞增生和软骨细胞再生的功效。
目前市场上的硫酸软骨素主要是以提取法从猪、牛、羊、鸡、鲨鱼等动物骨头中提取，生产过程中使用大量酸碱、提取路线复杂且质量不易控制，同时在某些特殊人群(如动物保护组织、宗教因素)中无法应用，随着动物骨源日益匮乏，市场上急需一种非动物源的产品来替代现有的硫酸软骨素产品。随着微生物菌种筛选和发酵技术的兴起，通过微生物发酵产生硫酸软骨素的课题被广泛研究，但是由于发酵产量偏低，提取工艺困难，尚未有绿色环保、可大规模化的提取工艺来生产硫酸软骨素。
因此，需要探索一种低污染、操作简便、高收率的方法从发酵液中提纯硫酸软骨素，从而实现发酵法生产硫酸软骨素的产业化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从硫酸软骨素发酵液中提纯硫酸软骨素的方法，该方法操作简便、低污染、回收率高。
本发明的技术方案是这样实现的：一种从硫酸软骨素发酵液中提纯硫酸软骨素的方法，它包括如下步骤：
S1、发酵液灭活：在硫酸软骨素发酵液中加酸调节pH至2.0-4.5或者加碱调节pH至8.5-11.0，加热至60-90℃下维持3-7小时，制得灭活的硫酸软骨素发酵液；
S2、固液分离：将灭活的硫酸软骨素发酵液采用过滤设备进行固液分离，制得发酵滤液；
S3、滤液浓缩洗涤：将发酵滤液使用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至发酵滤液体积的1/8-1/4，再用发酵滤液体积1-3倍体积的水进行洗涤，制得滤液浓相；
S4、树脂吸附：将滤液浓相使用阴离子交换树脂吸附，阴离子交换树脂吸附量为20-80g/L(硫酸软骨素克数/树脂体积)；
S5、树脂洗脱：用氢氧化钠或者氯化钠溶液对吸附有硫酸软骨素的阴离子交换树脂进行洗脱，收集洗脱液；
S6、洗脱液浓缩洗涤：将洗脱液使用纳滤膜或者超滤膜进行浓缩，浓缩至发酵滤液体积的1/12-1/4，再用发酵滤液体积1-3倍体积的水进行洗涤，制得洗脱浓相；
S7、洗脱浓相干燥：将洗脱浓相采用烘箱干燥、冷冻干燥或者喷雾干燥，制得硫酸软骨素产品。
优选的，步骤S1中，所述的酸为盐酸或者硫酸，所述的碱为氨水或者氢氧化钠。
优选的，步骤S2中，所述的过滤设备为陶瓷膜过滤器、碟片离心机或者板框压滤机；采用陶瓷膜过滤器，使用50-500nm的陶瓷膜，操作压力0.1-0.3MPa，温度60-90℃；采用碟片离心机进行固液分离，在15-30℃下进行；采用板框进行固液分离，在15-30℃下进行，操作压力0.1-0.4MPa。
优选的，步骤S3中，使用分子量截留在10000-50000Da的超滤膜进行过滤；最好使用卷式超滤膜芯，膜芯材质是聚丙烯腈、聚醚砜或者聚偏氟乙烯，操作压力0.2-1.0MPa，温度10-40℃。
优选的，步骤S4中，所述的阴离子交换树脂是三菱树脂DIAION SA12A和DIAIONSA21A、罗门哈斯IRA400和IRA900中的一种；
优选的，步骤S6中，采用纳滤膜浓缩时，使用截留分子量是150-300Da的纳滤膜，最好选择膜芯材料是聚砜、聚酰胺，操作压力1.0-2.0MP，温度15-35℃；采用超滤膜浓缩时，使用截留分子量在5000-10000Da的超滤膜，最好选择膜芯材料是聚醚砜、聚偏氟乙烯，操作压力0.5-1.5MPa，温度是15-35℃。
本发明和现有技术相比的优点为：
(1)提取过程不涉及有机溶剂，且工艺自动化程度高、可工业化性强。
(2)该工艺提取出的硫酸软骨素含量和纯度高，在质量方面比目前市场上动物骨头中提取的产品有优势。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚，下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1：取硫酸软骨素发酵液50L，用氨水调节pH至9.0左右，升温至85℃维持5小时，乘热使用50nm陶瓷膜微滤，操作压力0.2-0.3Mpa；滤液降温至25℃，使用20000-50000Da的超滤膜浓缩至10L后，用70L纯化水洗涤得滤液浓相；将滤液浓相按50g/L树脂吸附量，1.5BV/hr流速上树脂DIAION SA21A，吸附完成后，用0.2-1.0M的氯化钠溶液洗脱；收集树脂洗脱液用150-300Da的纳滤膜浓缩至5L后，加入50L纯化水洗涤得洗脱浓相；将洗脱浓相用小型喷雾干燥塔干燥后得到硫酸软骨素27.28g，水分3.2％，CE(毛细管电泳，下同)检测硫酸软骨素含量93.8％，纯度94.87％。
实施例2：取硫酸软骨素发酵液50L，用氢氧化钠调节pH至10.5左右，升温至75℃维持3.5小时，降温至20℃后使用碟片离心机分离，收集上清液；上清液使用20000Da的超滤膜浓缩至12.5L后，用100L纯化水洗涤得滤液浓相；将滤液浓相按75g/L树脂吸附量，1.5BV/hr流速上树脂IRA900，吸附完成后，用0.5-1.5M的氯化钠溶液洗脱；收集树脂洗脱液用5000Da的超滤膜浓缩至5L后，加入75L纯化水洗涤得洗脱浓相；将洗脱浓相用冷冻干燥后得到硫酸软骨素24.22g，水分2.5％，CE(毛细管电泳，下同)检测硫酸软骨素含量95.6％，纯度96.47％。
实施例3：取硫酸软骨素发酵液50L，用氢氧化钠调节pH至11.0左右，升温至65℃维持3.0小时，降温至20℃后使用板框压滤机过滤，收集板框滤液；滤液使用10000Da的超滤膜浓缩至6.5L后，用125L纯化水洗涤得滤液浓相；将滤液浓相按45g/L树脂吸附量，1.0BV/hr流速上树脂IRA400，吸附完成后，用0.5-1.5M的氢氧化钠溶液洗脱；收集树脂洗脱液用10000Da的超滤膜浓缩至6L后，加入60L纯化水洗涤得洗脱浓相；将洗脱浓相用冷冻干燥后得到硫酸软骨素23.50g，水分1.5％，CE(毛细管电泳，下同)检测硫酸软骨素含量96.1％，纯度98.55％。
实施例4：取硫酸软骨素发酵液50L，用盐酸调节pH至2.7左右，升温至75℃维持6小时，降温至20℃后使用板框压滤机过滤，收集板框滤液；滤液使用20000Da的超滤膜浓缩至8L后，用75L纯化水洗涤得滤液浓相；将滤液浓相按55g/L树脂吸附量，1.0BV/hr流速上树脂DIAION SA12A，吸附完成后，用0.2-0.8M的氢氧化钠溶液洗脱；收集树脂洗脱液用5000Da的超滤膜浓缩至6.5L后，加入60L纯化水洗涤得洗脱浓相；将洗脱浓相用真空烘箱后得到硫酸软骨素25.31g，水分4.5％，CE(毛细管电泳，下同)检测硫酸软骨素含量94.0％，纯度96.11％。
实施例5：取硫酸软骨素发酵液50L，用硫酸调节pH至4.3左右，升温至60℃维持7小时，乘热使用200nm陶瓷膜微滤，操作压力0.2-0.3Mpa；滤液降温至20℃；滤液使用10000Da的超滤膜浓缩至8.5L后，用90L纯化水洗涤得滤液浓相；将滤液浓相按50g/L树脂吸附量，0.8BV/hr流速上树脂IRA900，吸附完成后，用0.15-0.65M的氢氧化钠溶液洗脱；收集树脂洗脱液用10000Da的超滤膜浓缩至7.5L后，加入120L纯化水洗涤得洗脱浓相；将洗脱浓相用小型喷雾干燥塔干燥后得到硫酸软骨素24.45g，水分2.5％，CE(毛细管电泳，下同)检测硫酸软骨素含量96.77％，纯度98.15％。
实施案例6：取硫酸软骨素发酵液50L，用盐酸调节pH至3.0左右，升温至85℃维持5小时，降温至15℃后使用碟片离心机分离，收集上清液；上清液使用20000Da的超滤膜浓缩至9.0L后，用110L纯化水洗涤得滤液浓相；将滤液浓相按45g/L树脂吸附量，0.8BV/hr流速上树脂IRA400，吸附完成后，用0.2-0.6M的氢氧化钠溶液洗脱；收集树脂洗脱液用5000Da的超滤膜浓缩至6L后，加入85L纯化水洗涤得洗脱浓相；将洗脱浓相用冷冻干燥后得到硫酸软骨素29.22g，水分3.5％，CE(毛细管电泳，下同)检测硫酸软骨素含量96.6％，纯度97.07％。