阅读说明：本技术 具有温和洗脱pH的亲和色谱配体 (Affinity chromatography ligands with mild elution pH ) 是由 宗益农 于 2017-03-31 设计创作，主要内容包括：本公开涉及色谱配体,例如包含至少两个结合单元和至少一个间隔结构域的色谱配体,其中,每个结合单元包含一个或两个免疫球蛋白结合结构域。(The present disclosure relates to chromatography ligands, for example comprising at least two binding units and at least one spacer domain, wherein each binding unit comprises one or two immunoglobulin binding domains.)

具有温和洗脱pH的亲和色谱配体

技术领域

本公开涉及色谱配体及其使用方法。

背景技术

葡萄球菌蛋白A(SPA)是最初在细菌金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的表面蛋白。由于其免疫球蛋白结合能力，葡萄球菌蛋白A(SPA)广泛用作生物技术和制药工业中单克隆抗体(即免疫球蛋白G或IgG)生产中的色谱配体。

葡萄球菌蛋白A(SPA)非常紧密地结合人IgG。由于高亲和力，从葡萄球菌蛋白A(SPA)配体洗脱结合的IgG需要苛刻的酸性条件，例如pH 3。然而，在强酸性条件下，IgG的结构部分地变性，这经常导致抗体的聚集和沉淀。已经表明了在约pH 3时，IgG结构和尺寸发生显著变化(Pete Gagnon等人，Conformational plasticity of IgG during protein Aaffinity chromatography，Journal of Chromatography A，1433(2016)98-105)。因此，变性可能对抗体产生有害。因此，需要开发能够在更高的pH下洗脱抗体的色谱配体，这将使抗体分子的结构损伤最小化。

发明内容

本公开涉及色谱配体及其使用方法。

在一个方面，本公开涉及具有至少两个结合单元和至少一个间隔结构域的多肽，其中每两个相邻的结合单元通过至少一个间隔结构域分开，并且每个结合单元包含一个或两个免疫球蛋白结合结构域。

在一些实施方式中，间隔结构域在pH约4.5至约7下不是无规卷曲或无序环。在一些实施方式中，每两个相邻的结合单元通过一个间隔结构域分开。免疫球蛋白结合结构域可以是葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫球蛋白结合结构域或其功能变体。在一些实施方式中，免疫球蛋白结合结构域是SPA的结构域A、SPA的结构域B、SPA的结构域C、SPA的结构域D、SPA的结构域E、结构域Z、结构域Z_D36H或其功能变体。

在一些实施方式中，免疫球蛋白结合结构域具有与结构域Z至少90％相同的序列，并且免疫球蛋白结合结构域可以结合免疫球蛋白的Fc区。

在一些实施方式中，免疫球蛋白结合结构域是链球菌蛋白G(SPG)免疫球蛋白结合结构域或其功能变体。

在一些实施方式中，至少一个免疫球蛋白结合结构域是SPA免疫球蛋白结合结构域，并且至少一个免疫球蛋白结合结构域是SPG免疫球蛋白结合结构域。

在一些实施方式中，间隔结构域包含α螺旋或螺旋束。间隔结构域可以是L9连接螺旋或其功能变体。间隔结构域也可以是胰高血糖素的结构域(SEQ ID NO：14)、钙调蛋白的连接螺旋(SEQ ID NO：15)、肌球蛋白-10的单个α-螺旋结构域(SAH)(SEQ ID NO：16)、Sumo结构域(SEQ ID NO：17)、EGF结构域(SEQ ID NO：18)、Rad23A的泛素相关(UBA)结构域(SEQID NO：19)、IgG样结构域、溶菌酶或其功能变体。

在一些实施方式中，间隔结构域的最大直径小于

在一些实施方式中，间隔结构域具有少于80个氨基酸的残基。

在一些实施方式中，多肽具有式II所定义的序列：

S_0-1(R_1-2S)_nR_0-2 (式II)

其中，

R代表免疫球蛋白结合结构域；

S代表间隔结构域；

n是整数，表示蛋白质中重复单元的数量，并且n可以等于1或大于1。

在一些实施方式中，多肽具有式III所定义的序列：

RSRSRSRS (式III)。

在一些实施方式中，多肽具有式IV所定义的序列：

RR-S-RR-S-RR-S (式IV)。

在一些实施方式中，多肽还包含用于固定的聚His标签和/或半胱氨酸残基。

在一个方面，本公开提供了包含编码如本文所述的任何多肽的多核苷酸的载体。

在另一方面，本公开还提供了包含如本文所述的任何多肽的色谱配体。

在一些实施方式中，色谱配体在4.7或更高的洗脱pH下具有超过60％的回收产率。

在一些实施方式中，色谱配体在4.7或更高的洗脱pH下具有超过80％的回收产率。

在一些实施方式中，将色谱配体固定在基质上。该基质可以是珠子的形式或膜的形式。

本公开还涉及纯化免疫球蛋白的方法。该方法包括使权利要求23所述的色谱配体与包含免疫球蛋白的溶液接触；用第一缓冲液洗涤色谱配体；用具有选定pH的第二缓冲液洗脱免疫球蛋白的步骤，其中选定pH大于4.0。在一些实施方式中，选定pH为4.7。在一些实施方式中，洗脱的免疫球蛋白的回收产率大于90％。

本公开还提供了纯化免疫球蛋白的方法。该方法包括使权利要求23所述的色谱配体与包含免疫球蛋白的溶液接触；用缓冲液洗涤色谱配体，其中缓冲液具有线性pH梯度；以及在选定pH下收集免疫球蛋白的步骤。在一些实施方式中，线性pH梯度为约pH 8.0至约pH3.0。在一些实施方式中，选定pH为约6.0至约4.0。在一些实施方式中，洗脱的免疫球蛋白的回收产率大于90％。

如本文所用，术语“结合单元”是指多肽中可与免疫球蛋白结合的区域。每个结合单元具有一个或两个免疫球蛋白结合结构域。

如本文所用，术语“两个相邻的结合单元”是指彼此接近的两个结合单元，并且它们由间隔结构域分开。

如本文所用，术语“免疫球蛋白结合结构域”是指可结合免疫球蛋白恒定区(例如IgG的Fc)的结构域。

如本文所用，术语“蛋白结构域”或“结构域”是指蛋白质的结构稳定单元或区域。与无规卷曲或无序环不同，结构域在非变性条件下具有稳定且可识别的三维结构。

如本文所用，术语“间隔结构域”是指将两个结构域分开的蛋白结构域(例如免疫球蛋白结合结构域)。间隔结构域不是无规卷曲或无序环。

如本文所用，术语“蛋白A免疫球蛋白结合结构域”或“SPA免疫球蛋白结合结构域”是指葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白结合结构域(例如结构域B、C、A、E、D)或其功能变体(例如结构域Z、结构域Z_D36H)。

如本文所用，术语“蛋白G免疫球蛋白结合结构域”或“SPG免疫球蛋白结合结构域”是指葡萄球菌蛋白G的免疫球蛋白结合结构域或其功能变体。

如本文所用，术语“配体”是指与另一分子特异性相互作用或结合的物质或分子。

如本文所用，术语“亲和配体”是指对其它分子具有特异性非共价结合能力的分子。

如本文所用，术语“亲和色谱”是指使用亲和配体结合和纯化靶标分子的色谱。

如本文所用，术语“洗脱”是指从亲和配体释放结合的分子。

如本文所用，术语“Fc结合蛋白”或“Fc结合结构域”是指能够结合抗体的片段可结晶(FC)区域的多肽。在一些实施方式中，Fc结合蛋白或Fc结合结构域可以是例如蛋白A、蛋白G或其具有结合特性的任何片段或融合蛋白。

如本文所用，术语蛋白或蛋白结构域的“功能变体”或“变体”是指变体蛋白或变体蛋白结构域，其保留蛋白或蛋白结构域的基本相似的功能(例如与Fc结合，有效地将免疫球蛋白结合结构域分开)。在一些实施方式中，蛋白或蛋白结构域的功能变体的序列具有与该蛋白或蛋白结构域至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列。

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；另外，也可以使用本领域已知的合适方法和材料。另外，材料、方法和示例仅是说明性的，并非旨在是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献均通过引用整体并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。

根据下面

具体实施方式

和附图以及权利要求，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。

附图说明

该专利或申请文件至少含有一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。

图1显示了葡萄球菌蛋白A(SPA)IgG结合结构域B(SEQ ID NO：1)、结构域C(SEQ IDNO：2)、结构域A(SEQ ID NO：3)、结构域D(SEQ ID NO：4)、结构域E(SEQ ID NO：5)、结构域Z(SEQ ID NO：6)和结构域Z变体Z_D36H(SEQ ID NO：7)的序列比对。Z和Z_D36H中与结构域B相关的突变残基以框架显示。

图2是显示3Z-H、4Z-H、5Z-H和6Z-H IgG亲和配体的图。IgG结合结构域由椭圆形代表。由钻石形代表的间隔结构域将IgG结合结构域分开。可以以单个附着方式将亲和配体与固体基质偶联。

图3是显示经典IgG亲和配体4Z和5Z的图。在这些亲和配体中，4-5Z结构域串联连接而没有任何间隔结构域。

图4是显示来自嗜热脂肪芽孢杆菌核糖体蛋白L9的连接螺旋的中心螺旋区域的图。该螺旋区域可以用作间隔结构域，序列如下图所示(SEQ ID NO：8)。

图5是显示填充在1ml柱中的4Z-H和4Z琼脂糖树脂的pH梯度洗脱曲线的图。对应于4Z-H和4Z的洗脱峰中心的pH值分别为5.02和3.91。

图6是显示填充在1ml柱中的5Z-H、5Z和5Z_Ds6H琼脂糖树脂的pH梯度洗脱曲线的图。对应于5Z-H、5Z和5Z_Ds6H的洗脱峰中心的pH值分别为pH 4.91、pH 4.28和pH 3.86。

图7是显示填充在1ml柱中的5Z-H琼脂糖树脂的pH逐步洗脱曲线的图。

图8是显示GE Hitrap蛋白A HP柱的pH逐步洗脱曲线的图。

图9列出了序列SEQ ID NO：1-21。

具体实施方式

葡萄球菌蛋白A是最初在细菌金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的表面蛋白。它由细菌中的spa基因编码。SPA可以结合免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G或IgG)的Fc区，从而损害免疫细胞对细菌的吞噬作用。由于其免疫球蛋白结合能力，SPA可以用于亲和色谱以进行抗体纯化。事实上，蛋白A亲和色谱广泛用于生物技术和制药工业中的单克隆抗体生产。

SPA具有5个同源IgG结合结构域，其命名为E、D、A、B和C(图1提供的序列)。每个结构域具有相似的IgG结合能力。然而，由于其热稳定性不同，只有结构域B和C及其功能变体广泛用于单克隆抗体纯化工业。单个氨基酸突变G29A(即第29位的甘氨酸残基被丙氨酸取代)使得结构域B对用氢氧化钠(NaOH)处理具有抗性(Bjorn Nilsson等人，A syntheticIgG-binding domain based on staphylococcal protein A，Protein Engineeringvol.1no.2pp.107-113,1987)。该经修饰的结构域B通常称为结构域Z。结构域Z的序列显示于图1中。结构域C(其也对NaOH处理抗性)也常用于抗体纯化。结构域C和其功能片段或变体描述于例如US8329860中，其通过引用整体并入。

重组结构域B、结构域Z、结构域C或其功能变体可用作色谱配体。它们通常以多个串联重复构建。大多数可商购的SPA配体具有4或5个串联的重复结构域，并且每个配体可以在溶液中容纳约2个IgG分子。SPA的每个IgG结合结构域具有末端仅有少量非螺旋残基的紧密的3-螺旋结构。在天然SPA和商业SPA配体(例如来自GE Healthcare的MABSELECT^TM或MABSELECT SURE^TM)两者中，多聚体IgG结合结构域连续连接，而在结合结构域之间没有额外的连接序列(参见例如SEQ ID NO：9、11和12)。一些商业配体描述于例如US8329860B2中，其通过引用整体并入。

天然SPA与人IgG1、IgG2和IgG4非常紧密地结合，亲和力约为Kd＝10nM。具有4或5个B、C或Z串联结构域的工程化蛋白A表现出与IgG相似的结合亲和力。由于高亲和力，从SPA配体洗脱结合的IgG需要苛刻的酸性条件，例如pH 3。事实上，约pH 3的洗脱缓冲液广泛用于工业和研究领域两者的单克隆抗体生产中的IgG洗脱。然而，在强酸性条件下，IgG的结构部分变性。已经表明了在约pH 3时，IgG结构和尺寸发生显著变化(Pete Gagnon等人，Conformational plasticity of IgG during protein A affinity chromatography，Journal of Chromatography A，1433(2016)98-105)。变性可能对某些IgG分子有害。酸性变性的一个结果是蛋白沉淀，其导致IgG分子的损失。酸性变性的第二个结果是形成对人有毒的可溶性聚集体。有趣的是，IgG沉淀和聚集通常与蛋白A色谱相关。与蛋白A的相互作用和解离可能有助于IgG分子的结构损伤。在使用蛋白A色谱的现代治疗性单克隆抗体生产中观察到超过20％的抗体聚集并不罕见。然而，还显示了在约pH 4.7或更高时，IgG结构可以保持不变。pH对抗体结构的影响描述于例如Ramil F.Latypov等人的Elucidation ofacid-induced unfolding and aggregation of human immunoglobulin IgG1 andIgG2Fc,J Biol Chem.2012Jan 6；287(2):1381-96中，其通过引用整体并入。因此，更理想的是在pH 4.7或更高pH值时从蛋白A培养基中洗脱结合的IgG。

提高洗脱pH的一种方式是找到影响IgG解离的残基。组氨酸扫描方法可以用于鉴定影响洗脱pH的残基。通过使用这些方法，已经确定将Asp36取代为His36和/或将Gln9取代为His9将显著增加约pH 4.5的洗脱。组氨酸扫描方法和取代描述于例如US8329860中，其通过引用整体并入。另一组突变(H18S、N28A)也可以导致较温和的洗脱条件，例如pH 3.5-4.5。这些突变描述于例如Timothy M.Pabst等人的Engineering of novelStaphylococcal Protein A ligands to enable milder elution pH and high dynamicbinding capacity,Journal of Chromatography A,1362(2014)180–185和US20130274451A1中；其各自通过引用整体并入。然而，具有较温和洗脱pH的那些SPA突变体(D36H、G9H、H18S、N28A)均比亲本蛋白的洗脱峰宽得多，表明洗脱曲线缓慢且纯化产率较低。Shinya Honda等人公开了另一个专利申请，其描述了在两个SPG IgG结构域之间添加非常长的连接子的方法(US 20160280744A1)。所述连接子是长度至少为80-240埃的无规卷曲。因此，根据所公开的数据，洗脱峰比亲本SPG蛋白更宽，表明非特异性结合。

实现更高pH洗脱的相同目标的另一方式是改变SPA的IgG结合结构域的结构。Sophia Hober等人发现在蛋白A上的一个环上改变一些残基会使IgG洗脱高于pH 3.5-pH4.0(Susanne Gülich等人，Protein engineering of an IgG-binding domain allowsmilder elution conditions during affinity chromatograph，Journal ofBiotechnology 76(2000)233–244)。Xia H.F.等人将6-甘氨酸连接子***到一个蛋白A环中使洗脱pH高于4.0(Hai-Feng Xia等人，Molecular Modification of Protein A toImprove the Elution pH and Alkali Resistance in Affinity Chromatography，Applied Biochemistry and Biotechnology April 2014,Volume 172,Issue 8,pp 4002–4012)。然而，SPA的那些结构变化都导致蛋白的热稳定性降低或蛋白的表达降低。

本公开部分基于观察到SPA的每个IgG结合结构域除了众所周知的主要FC结合位点之外可具有次级次要FC结合位点。在天然SPA和商业SPA变体中IgG结合结构域的串联连接的情况下，当邻近的IgG结合结构域结合至显性FC位点时，可发生来自一个IgG结合结构域的次级相互作用。由于协同作用，主要和次级相互作用有助于天然SPA和IgG之间的极高亲和力。这与多聚体SPA洗脱峰通常具有拖尾尾倾斜的事实一致，表明了复杂的多位点结合模型。如示例中所示，如果两个邻近的IgG结合结构域(例如SPA免疫球蛋白结合结构域，SPA免疫球蛋白结合结构域变体或SPG免疫球蛋白结合结构域)物理上分开，则可以消除潜在的次级结合相互作用。可以***结构稳定的结构域(其不干扰IgG结合结构域的功能)作为两个邻近的IgG结合结构域之间的间隔。间隔的免疫球蛋白结合结构域可以具有更好的免疫球蛋白结合和洗脱动力学，而不会牺牲它们的NaOH抗性。

免疫球蛋白结合结构域

本公开提供了包含免疫球蛋白结合结构域的色谱配体。术语“免疫球蛋白结合结构域”是指可结合免疫球蛋白恒定区的结构域。

色谱配体中的免疫球蛋白结合结构域可以是如本文所述的任何免疫球蛋白结合结构域。例如，免疫球蛋白结合结构域可以是衍生自葡萄球菌蛋白A的结构域B、C、A、E、D或其变体。免疫球蛋白结合结构域也可以是结构域Z或其变体。结构域Z是蛋白A的结构域B的功能变体。结构域Z具有3-螺旋束，其具有约58个氨基酸。在一些实施方式中，结构域Z可以具有一个或多个突变D36H、G9H、H18S、N23T、F30A或N28A。在一些实施方式中，可以将甘氨酸连接(例如六个甘氨酸残基)***到Z结构域(Z(6G))的第二环中。Z(6G)、N23T、F30A描述于例如Hai-Feng Xia等人的Molecular Modification of Protein A to Improve theElution pH and Alkali Resistance in Affinity Chromatography,AppliedBiochemistry and Biotechnology April 2014,Volume 172,Issue 8,pp 4002–4012中，其通过引用整体并入。

在一些实施方式中，免疫球蛋白结合结构域可以是链球菌蛋白G(SPG)中的免疫球蛋白结合结构域。蛋白G是在链球菌细菌中表达的免疫球蛋白结合蛋白。它类似于蛋白A，但它具有不同的结合特异性。在一些情况下，亲和配体基于SPG免疫球蛋白结合结构域(例如依赖于不同文献中的命名法的B1、C1、B2或C2)。B1/C1的氨基酸序列是SEQ ID NO：20且B2/C2的氨基酸序列是SEQ ID NO：21。这些亲和配体(没有间隔结构域)的洗脱pH可以在pH3.5-4.0的范围内。SPG免疫球蛋白结合结构域及其变体描述于例如US 20160280744中，其通过引用整体并入。

在一些实施方式中，免疫球蛋白结合结构域是IgG结合结构域。

如本文所用，变体免疫球蛋白结合结构域可以是具有与本公开所述的免疫球蛋白结合结构域至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列的肽(例如结构域B、C、A、E、D、Z、Z_D36H或蛋白G免疫球蛋白结合结构域)。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为最佳比较目的而比对序列(例如为了最佳比对而可以在第一和第二氨基酸两者中的一个或两个或核酸序列中引入空位且为了比较目的而可以忽略非同源序列)。为比较目的而比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少80％，并且在一些实施方式中是至少90％、95％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么该分子在那个位置是相同的(如本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数量的函数，考虑到空位的数量和每个空位的长度，需要引入这两个序列的最佳比对。为了本发明的目的，可以使用Blossum 62评分矩阵完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。

间隔结构域

如上所述，本公开部分基于观察到SPA的每个免疫球蛋白结合结构域除了众所周知的主要Fc结合位点之外可具有次级Fc结合位点。当邻近的免疫球蛋白结合结构域结合至显性Fc位点时发生次级相互作用。由于协同作用，主要和次级相互作用有助于天然SPA和IgG之间的极高亲和力。为了消除次级结合，可以通过间隔结构域将相邻的免疫球蛋白结合结构域分开。

因此，间隔结构域需要结构上稳定并且具有所定义的结构以将免疫球蛋白结合结构域分开。在一些情况下，间隔结构域可以是结构上稳定的蛋白结构域，其在水溶液中具有折叠的三维结构。间隔结构域可以物理上将相邻的免疫球蛋白结合结构域分开并用作间隔。在一些实施方式中，间隔结构域具有多于5、6、7、8、9、10、15、20、30或40个氨基酸残基。

由于无规卷曲和无序环在溶液中不具有所定义的结构，并且不能有效地将免疫球蛋白结合结构域分开，因此，在一些实施方式中，间隔结构域不是无规卷曲或无序环。在一些实施方式中，间隔结构域在本文所述的任何洗脱pH(例如约3至约7、约4至约7、约4.5至约7)下不是无规卷曲或无序环。

间隔结构域的一个重要方面是其结构稳定性。结构稳定性是指在适当的条件范围内的明确定义的三级结构，该条件包括用于色谱的pH、离子强度和水溶液中的缓冲组分。在一些实施方式中，结构稳定性还意指间隔结构域的核心在亲和配体结合抗体的条件下不在溶液中形成无规卷曲结构。间隔结构域的目的是有效地保持相邻的免疫球蛋白结构域之间的一些距离。

相反，在两个蛋白结构域之间添加柔性多肽连接子是重组表达融合蛋白或嵌合蛋白的常用方法。通常将连接子设计为柔性的，例如Gly和Ser残基的混合物。这些连接子通常不能防止侧翼结构域在溶液中彼此接触。

在一些实施方式中，间隔结构域是小蛋白结构域，其尺寸与免疫球蛋白结合结构域(例如Z结构域)大致相同。在一些实施方式中，S结构域的尺寸与SPA免疫球蛋白结合结构域相似或更大。根据晶体学和NMR研究，蛋白A免疫球蛋白结合结构域(包括结构域B、结构域C、结构域D、结构域E、结构域A、结构域Z或任何功能变体)的长度为约20-

因此，在一些实施方式中，间隔结构域的长度或直径(例如最大直径)可以为约

至约

约

至约

或约至约

在一些实施方式中，间隔结构域的长度或直径(例如最大直径)小于或

在一些实施方式中，间隔结构域是水溶性的。在这些情况下，暴露在间隔结构域表面上的氨基酸优选是亲水性的。

在一些实施方式中，间隔结构域可以在强酸性和强碱性条件下存活，因此在低pH和高pH条件下具有结构稳定性。在一些实施方式中，在极端条件下变性(例如强碱或强酸溶液)后，间隔结构域可以在中性条件下容易地重新折叠成适当的结构。

在一些实施方式中，间隔结构域包含α螺旋结构或由α螺旋结构组成(例如SEQ IDNO：8、15或16)。该α螺旋可以含有约8至32个氨基酸，其可形成约2至8个螺旋转角，长度范围为约

至约

在一些情况下，该α螺旋含有约12至24个氨基酸，其可形成约3至6个螺旋转角，长度范围为约

至约

在一些实施方式中，间隔结构域是单个α螺旋结构域。由于多种原因，单个α螺旋结构域是间隔结构域的良好选择。首先，单个α螺旋结构域是具有稳定结构的最小结构域。其次，在纯化过程期间酸或碱变性后，它们可以容易地重新折叠。第三，它们具有完美的N-C取向以整合到配体中。最后，可以根据需要容易地控制它们的尺寸/长度。

在一些实施方式中，间隔结构域可以是来自嗜热脂肪芽孢杆菌核糖体蛋白L9的中心连接螺旋(SEQ ID NO：8)。L9连接螺旋是稳定且可溶性的螺旋，其在许多物种中都是保守的。L9连接螺旋的结构描述于例如David W.Hoffman等人的Crystal structure ofprokaryotic ribosomal protein L9:a bi-lobed RNA-binding protein,the EMBOJournal vol.13no.1pp.205-212,1994中，其通过引用整体并入。

在一些实施方式中，该螺旋结构域还可以具有主要亲水性的表面。在一些情况下，暴露在螺旋结构域表面上的大于50％、60％、70％、80％、90％、95％或所有氨基酸是亲水性的。在一些实施方式中，避免了螺旋结构域表面上的疏水性区域或补丁。

在一些实施方式中，间隔结构域可以包含β折叠(β-折叠)或由β折叠(β-折叠)组成。β-折叠是蛋白中常规次级结构的常见基序。它由β链(也是β-链)制得，它们通过至少两个或三个主链氢键横向连接，形成通常扭曲的褶皱片。

在一些实施方式中，间隔结构域可以是胰高血糖素的螺旋区段(胰高血糖素的氨基酸7-26；SEQ ID NO：14)、钙调蛋白的连接螺旋(钙调蛋白的氨基酸68-90；SEQ ID NO：15)或来自肌球蛋白-10的单个α-螺旋结构域(SAH)(肌球蛋白-10的氨基酸813-909；SEQ IDNO：16)。

在一些实施方式中，间隔结构域是小蛋白，如Sumo结构域(α螺旋和β折叠；例如SEQID NO：17)、EGF结构域(β折叠；例如SEQ ID NO：18)或Rad23A的泛素相关(UBA)结构域(例如SEQ ID NO：19)。

在一些实施方式中，间隔结构域结构域可以是具有与在本公开所述的任何间隔结构域至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列的肽(例如SEQ ID NO：8、14-19)。

在一些实施方式中，间隔结构域是非IgG结合结构域。在一些情况下，间隔结构域对免疫球蛋白或IgG不具有亲和力。它不会影响邻近的免疫球蛋白结合结构域的结构稳定性，并且在NaOH原位清洁(CIP)后不会干扰免疫球蛋白结合结构域的重新折叠。

在一些实施方式中，间隔结构域在生理条件或变性条件下不与相邻的免疫球蛋白结合结构域相互作用(例如间隔结构域不会与相邻的免疫球蛋白结合结构域结合，并且不会阻断免疫球蛋白结合结构域与IgG之间的结合)。间隔结构域不会引起免疫球蛋白结合结构域的聚集或变性。

在一些实施方式中，间隔结构域是折叠的蛋白结构域，是具有三维结构的蛋白结构域，是一片α螺旋，是螺旋束，是β-结构蛋白，是混合的α-β结构蛋白，或是一种球状蛋白。在一些情况下，间隔结构域不具有免疫球蛋白结合亲和力，是水溶性的，不是溶液中的无规卷曲，不是溶液中的无序环，和/或不干扰免疫球蛋白结合结构域的功能。

色谱配体

在一个方面，色谱配体可以是肽，其具有至少两个结合单元和至少一个间隔结构域。结合单元是多肽的结构元件，并且它具有一个或两个免疫球蛋白结合结构域。该多肽可以具有多个结合单元。每两个相邻的结合单元通过至少一个间隔结构域分开。在一些实施方式中，多肽具有至少两个免疫球蛋白结合结构域和至少一个间隔结构域，其中，每两个相邻的免疫球蛋白结合结构域通过至少一个间隔结构域分开。在一些实施方式中，多肽是融合多肽。

色谱配体可以具有2、3、4、5、6、7、8或多于8个结合单元。每个结合单元可以具有一个或两个免疫球蛋白结合结构域。三个或三个以上连续连接的免疫球蛋白结合结构域通常是不利的。这是因为基于结构研究，每个IgG重链具有一个主要SPA结合位点，并且还可以存在IgG重链上的次级或次要结合位点。由于大的免疫球蛋白分子如IgG的空间位阻，连续连接的三个或三个以上的串联SPA结构域更可能与免疫球蛋白(例如IgG)的次级或次要位点相互作用。这种相互作用将导致更高的结合亲和力，并且在一些情况下，这是不理想的(使得更难以洗脱免疫球蛋白)。

在一些实施方式中，色谱配体可以具有多个免疫球蛋白结合结构域，其通过间隔结构域在空间上被分开。

在一些实施方式中，色谱配体可以具有额外的残基或组分，例如半胱氨酸残基或聚His标记，其可用于例如将色谱配体连接至支持基质、固体表面或珠子上。半胱氨酸残基可以用于固定。聚His标签可以用于纯化色谱配体。半胱氨酸残基和聚His标签描述于例如Kimple、Michelle E.和John Sondek的"Overview of affinity tags for proteinpurification."Current Protocols in Protein Science(2004):9-9；Magdeldin、Sameh和Annette Moser的"Affinity chromatography:Principles and applications."S.Magdeldin,InTech,Croatia(2012):1-28中；其各自通过引用整体并入。

在一些实施方式中，色谱配体具有由下式所定义的结构：

XS_0-1(R_1-2S)_nR_0-2Y (式I)

S_0-1(R_1-2S)_nR_0-2 (式II)

RSRSRSRS (式III)

RRSRRSRRS (式IV)

RSRSRSRSRS (式V)

其中，

·R代表免疫球蛋白结合结构域(例如SPA免疫球蛋白结合结构域，或SPG免疫球蛋白结合结构域)；

·S代表间隔结构域；

·n是整数，表示蛋白中重复单元的数量。重复单元是多肽的结构元件并具有结构(R_1-2S)。配体可以具有多个重复单元。n可以等于1或大于1。在一些实施方式中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方式中，n小于15、小于10、小于5。

·X代表额外残基或组分，例如半胱氨酸残基或聚His标签；

·Y代表额外残基或组分，例如半胱氨酸残基或聚His标签；

·下标编号代表一系列可能的单元，例如0-1表示0或1个单位。

由于其结构刚性，间隔结构域物理上将溶液中的两个相邻的免疫球蛋白结合结构域分开。如本文所用，术语“相邻的免疫球蛋白结合结构域”是指彼此接近的两个免疫球蛋白结合结构域，并且它们由间隔结构域分开。

在一些实施方式中，亲和配体是嵌合融合蛋白，其包含IgG结合结构域(作为免疫球蛋白结合结构域)和非IgG结合结构域(作为间隔结构域)。在一些实施方式中，融合蛋白含有来自蛋白A的多个拷贝的IgG结合结构域。在一些实施方式中，融合蛋白含有多个拷贝的非IgG结合结构域。

在一些实施方式中，融合蛋白含有两个或更多个拷贝的相同免疫球蛋白结合结构域或其功能变体，例如多个Z结构域。在一些实施方式中，融合蛋白含有来自SPA和SPG的各种IgG结合结构域，例如“Z-S-B1-S”，其中，Z代表SPA免疫球蛋白结合结构域，B1代表SPG免疫球蛋白结合结构域，并且S代表间隔结构域。

在一些实施方式中，每个免疫球蛋白结合结构域紧接着是间隔结构域S，例如“RS-RS-RS-RS”。在一些实施方式中，每两个免疫球蛋白结合结构域接着是间隔结构域S，例如“RR-S-RR-S-RR-S”。

在一些实施方式中，亲和配体具有显著改善的洗脱曲线，该洗脱曲线具有显著升高的洗脱pH和更窄的洗脱峰。如上所讨论，结构刚性的间隔结构域物理上有效地将免疫球蛋白结合结构域分开。因此，在一些情况下，由于免疫球蛋白结合结构域之间存在间隔结构域，由天然蛋白A和经典多聚体重组SPA变体中的邻近的免疫球蛋白结合结构域提供的次级结合减少。因此，如本公开中所述，在亲和配体中的相邻的免疫球蛋白结合结构域之间***刚性间隔结构域降低洗脱的酸度要求。

因此，亲和配体可以具有更高的结合免疫球蛋白(例如IgG)的洗脱pH。在一些实施方式中，洗脱pH在pH 4.0至pH 6.0的范围内，回收产率超过70％、80％、90％、95％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，洗脱pH在pH 4.5至pH 6.0的范围内，回收产率超过70％、80％、90％、95％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，对免疫球蛋白的洗脱pH在pH 4.5至pH 5.5的范围内，回收产率超过90％、95％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，洗脱pH在pH 4.7至pH 5.0的范围内，回收产率超过90％、95％、95％、96％、97％、98％或99％。如本文所用，回收产率是指在某些条件((例如洗脱pH在pH4.5至pH 5.5的范围内)下可以从可从色谱中洗脱的免疫球蛋白总量中洗脱的免疫球蛋白(例如IgG)的百分比。在一些实施方式中，可以从色谱中洗脱的免疫球蛋白的总量由可以在pH 2-3洗脱的免疫球蛋白的总量所确定。

在一些实施方式中，亲和配体允许结合的抗体在高于pH 4.0、高于pH 4.1、高于pH4.2、高于pH 4.3、高于pH 4.4、高于pH 4.5、高于pH 4.6、高于pH 4.7、高于pH 4.8、高于pH4.9、高于pH 5.0、高于pH 5.1、高于pH 5.2、高于pH 5.3、高于pH 5.4、高于pH 5.5、高于pH5.6、高于pH 5.7、高于pH 5.8、高于pH 5.9、高于pH 6.0、高于pH 6.1、高于pH 6.2、高于pH6.3、高于pH 6.4或高于pH 6.5时被洗脱。在一些实施方式中，最大洗脱pH为6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。

回收产率可以高于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，回收产率为85-99％、90％-99％或95-99％。

在一些实施方式中，将结构稳定的间隔结构域添加至亲和配体不会显著降低表达产率或减小亲和配体的溶解度。

可以在蛋白表达系统(如毕赤酵母、大肠杆菌)或本领域已知的任何其它适当的表达系统中表达本文所述的亲和配体。在一些实施方式中，可以通过使用色谱技术(如离子交换色谱、亲和力色谱、尺寸排阻色谱和凝胶过滤色谱)纯化所表达的亲和配体。在一些实施方式中，将经纯化的蛋白缓冲液交换至不含胺和不含还原剂的缓冲液，其具有约中性pH。在一些实施方式中，可以将经纯化的蛋白浓缩或稀释至适当的浓度，其适于偶联至固体支持物。

此外，大多数商业SPA配体含有4或5个IgG结合结构域。如果IgG结构域之间的间隔区或连接子区太大(即太多氨基酸或尺寸太长)，整个配体将变得太大，因此对于合成/表达变得太复杂或在NaOH清洁后难以重新折叠。因此，在一些实施方式中，间隔结构域具有少于90、80、60、50、40或30个氨基酸残基。在一些实施方式中，间隔区域的长度或直径(例如当其正确折叠时的最大直径)可以小于

或

色谱基质

本公开还提供了一种用于抗体亲和分离的色谱基质。该基质可以包括与固体支持物共价偶联的亲和配体。亲和配体可以是本文所述的任何亲和配体。

基质的固体支持物可以由任何种类的合适材料制成，其包括多糖(例如琼脂糖、纤维素、淀粉、葡聚糖)、有机聚合物(例如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯)或无机聚集体(例如二氧化硅)。色谱基质可以是珠子(例如基本上球形的颗粒)、膜或整体凝胶的形式。在一些实施方式中，本文所述的亲和配体可以单个附着方式(例如具有一个附着点)共价偶联至基质支持物。在一些其它情况下，亲和配体可以共价偶联至具有多个附着点的支持物上。

在一些实施方式中，与亲和配体偶联的色谱基质可以以一次性使用形式使用，这意味着在使用后将基质丢弃而无需CIP和验证程序。

在一些实施方式中，色谱配体具有优异的NaOH抗性，这是多轮CIP(原位清洁)所需的。因此，在一些实施方式中，与亲和配体偶联的色谱基质可以用CIP(即用0.1-0.5M NaOH清洁)处理进行多次循环。CIP处理可以清洁亲和配体。

色谱过程

色谱基质可以用于纯化免疫球蛋白，例如IgG。色谱过程涉及亲和色谱技术，其是本领域已知的。因此，本公开还提供了色谱过程，其中，通过与色谱基质结合从溶液中分离靶标免疫球蛋白。如本领域技术人员将容易理解的，表示为洗脱液的溶液需要通过亲和基质以释放或洗脱基质上结合的蛋白。在蛋白A色谱(例如HiTrap蛋白A HP)的情况下，通常通过pH为约3.0的强酸性溶液洗脱基质上结合的抗体(例如IgG)。这种强酸性条件通常引起抗体变性和聚集。相反，本公开中所述的亲和配体可以具有更高的已结合免疫球蛋白的洗脱pH。因此，在一些实施方式中，基质上结合的抗体(例如IgG)通过具有如本公开中所述的适当洗脱pH的溶液洗脱(例如pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH 4.6、pH4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4或pH 6.5或pH 4.0至pH 6.0的范围内)。

在一些实施方式中，本文所述的色谱配体允许结合的抗体(例如IgG)在相对温和的条件下洗脱，例如高于pH 4.0、高于pH 4.1、高于pH 4.2、高于pH 4.3、高于pH 4.4、高于pH 4.5、高于pH 4.6、高于pH 4.7、高于pH 4.8、高于pH 4.9、高于pH 5.0、高于pH 5.1、高于pH 5.2、高于pH 5.3、高于pH 5.4、高于pH 5.5、高于pH 5.6、高于pH 5.7、高于pH 5.8、高于pH 5.9或高于pH 6.0。

在一些实施方式中，抗体首先与亲和基质结合。使用具有约pH 8.0至约pH 3.0的大致线性pH梯度的溶液洗脱结合的抗体。因此，在一些实施方式中，当洗脱pH在本公开所述的任何适当的pH范围内时，收集基质上结合的抗体(例如IgG)(例如在pH 4.0至pH 6.0的范围内；或高于pH 4.0、高于pH 4.1、高于pH 4.2、高于pH 4.3、高于pH 4.4、高于pH 4.5、高于pH 4.6、高于pH 4.7、高于pH 4.8、高于pH 4.9、高于pH 5.0、高于pH 5.1、高于pH 5.2、高于pH 5.3、高于pH 5.4、高于pH 5.5、高于pH 5.6、高于pH 5.7、高于pH 5.8、高于pH 5.9、高于pH 6.0、高于pH 6.1、高于pH 6.2、高于pH 6.3、高于pH 6.4或高于pH 6.5，最大洗脱为pH6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4或pH 6.5)。

在一些其它实施方式中，可以使用逐步洗脱。例如，第一缓冲液用于洗涤色谱基质，且第二缓冲液用于洗脱免疫球蛋白。第二缓冲液可以具有如本公开所述的适当pH(例如pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH 4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH 6.0)。在一些情况下，可以使用第三缓冲液以确定可以从色谱中洗脱的抗体的总量，其可以用于验证总洗脱或产率。第三缓冲液的pH应低于第二缓冲液的pH(例如pH 2.0、pH 2.1、pH 2.2、pH2.3、pH 2.4、pH 2.5、pH 2.6、pH 2.7、pH 2.8、pH 2.9、pH 3.0或低于pH 2.0)。

本公开还提供了纯化免疫球蛋白的方法。该方法包括使本文所述的色谱配体与包含免疫球蛋白的溶液接触；用第一缓冲液洗涤色谱配体；用具有选定pH的第二缓冲液洗脱免疫球蛋白的步骤。选定pH可以是本公开所述的任何pH。在一些实施方式中，选定pH大于4.0(例如pH 4.5、pH 4.7)。

本公开还提供了纯化免疫球蛋白的方法。该方法包括使本文所述的色谱配体与包含免疫球蛋白的溶液接触；用缓冲液洗涤色谱配体(其中缓冲液具有随时间变化的线性pH梯度)；以及在选定pH下收集免疫球蛋白的步骤。线性pH梯度可以为约pH 8.0至约pH 3.0。在一些实施方式中，选定pH为约6.0至约4.0(例如约6.0至约4.5或约6.0至约4.7)。

在一些实施方式中，各种所述条件下的回收产率可以大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

实施例

在以下实施例中进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求所述的本发明的范围。

实施例1：蛋白设计与工程化

设计了基于上述式I的示例性配体。简而言之，将4Z-H(即ZHZHZHZH)和5Z-H(即ZHZHZHZHZH)(其中Z代表SPA结构域Z，并且H代表螺旋结构域(作为间隔结构域))设计为IgG结合和洗脱测试的新型亲和配体。4Z-H和5Z-H的代表图示于图2。

螺旋结构域H选自来自嗜热脂肪芽孢杆菌的核糖体蛋白L9中连接螺旋的中心区段。在许多生物中保守的L9连接螺旋显示是非常稳定的。如图4所示，连接螺旋的中心区段具有约18个残基(形成约4个螺旋转角并且具有与Z结构域大致相同的长度)并且主要是亲水性的。因此，该螺旋(即结构域H)适合用作4Z-H和5Z-H中的间隔结构域的目的。

设计三种不含有任何间隔结构域的额外配体作为对照。三种对照配体分别是4Z(ZZZZ)、5Z(ZZZZZ)和5Z_D36H(Z_D36HZ_D36HZ_D36HZ_D36HZ_D36H)。这些设计的配体中IgG结合结构域的串联重复序列的连接与天然SPA或商购SPA变体(例如GE Healthcare的MabSelect SuRe)完全相同。它们的代表图示于图3。结构域Z_D36H是结构域Z的变体，具有Asp36His的单个突变。根据专利US9382297B2，诱变剂Z_D36H显示出比Z结构域更高的洗脱pH。

上面提及的所有设计的配体也设计成具有C-末端聚His-标签以促进纯化并且具有半胱氨酸标签以促进基质偶联。每种配体的序列列于表1中。

表1

配体名称	序列号	Z结构域的数量	H结构域的数量
				5Z	SEQ ID NO：9	5	0
5Z-H	SEQ ID NO：10	5	5
				4Z	SEQ ID NO：12	4	0
4Z-H	SEQ ID NO：13	4	4
				5Z<sub>D36H</sub>	SEQ ID NO：11	5	0

实施例2：SPA配体的基因合成、蛋白表达和纯化

编码列于表1中的蛋白的合成基因获自商业基因合成公司。针对毕赤酵母表达系统将所有合成的基因进行密码子优化，并亚克隆到获自BioGrammatics(Carlsbad，CA)的毕赤酵母表达载体中。在酵母转化之前，验证所有序列都是正确的。根据BioGrammatics(Carlsbad，CA)推荐的标准方案进行毕赤酵母菌株的转化和选择。毕赤酵母细胞培养和蛋白表达描述于例如Maria Weidner等人的Expression of Recombinant Proteins in theMethylotrophic Yeast Pichia pastoris.J Vis Exp.2010；(36):1862和赛默飞世尔科技的毕赤酵母发酵工艺指南中；其各自通过引用整体并入。

表2

基因名称	表达系统	表达载体	表达方法
				4Z-H	毕赤酵母	pJAGalpha	分泌
5Z-H	毕赤酵母	pJAGalpha	分泌
				4Z	毕赤酵母	pJAGalpha	分泌
5Z	毕赤酵母	pJAGalpha	分泌
				5Z<sub>D36H</sub>	毕赤酵母	pJAGalpha	分泌

将表达的蛋白分泌到毕赤酵母培养基中。收获培养基并澄清用于下游纯化。通过两个步骤完成表达蛋白的纯化。在第一步骤中，通过使澄清的培养基通过含有Ni-NTA树脂的柱捕获靶标蛋白。用咪唑溶液梯度洗脱含有聚His标签的已结合蛋白。将含有靶标蛋白的洗脱级分进行缓冲液交换以进行阳离子交换色谱的第二步骤。检查蛋白溶液的pH并调节至pH 4.5，并且保持电导率为10ms/cm。然后使溶液通过SP柱，用盐的梯度溶液洗脱结合的蛋白。最后，将纯化的蛋白用不含游离胺的缓冲液(例如1X PBS)透析。并将蛋白浓度调节至约10mg/ml。

实施例3：SPA亲和树脂和柱制备

将直径为45-165μm的交联的4％琼脂糖珠子用于SPA配体固定。首先洗涤珠子基质并重悬于0.5MNaOH中。将1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDE)添加到溶液中至终浓度为30％体积/体积。将混合物溶液在22-24℃下剧烈搅拌16-18个小时。然后将活化的珠子用水和乙醇充分洗涤直至除去游离的BDE。将珠子用环氧树脂基团活化并在配体偶联之前在4℃下储存在水中。

将环氧树脂活化的琼脂糖珠子在烧结玻璃漏斗中吸干，并将1ml珠子用于配体偶联实验。首先，如下所示制作偶联缓冲液。在50ml锥形管中添加0.21g碳酸氢钠、3.6g硫酸钠、0.3gEDTA和20ml水并混合。检查锥形管中偶联缓冲液的pH并调节至pH 7.5。将约5ml配体蛋白溶液(浓度为约10mg/ml)添加到锥形管中。最终的总蛋白约为50mg，超过了可与珠子偶联蛋白的最大量。将五种蛋白配体4Z-H，5Z-H，4Z，5Z和5Z_D36H同等处理。最终，将活化的琼脂糖珠子(1ml)添加到溶液中。在室温(即22-25℃)下将混合物轻轻摇动过夜(例如16-18小时)。配体固定后，用水和Tris-NaCl缓冲液(Tris 100mM，pH 9.0，NaCl150mM)充分洗涤琼脂糖珠子。为了使任何未反应的环氧树脂基团失活，在室温下将1M乙醇胺添加到珠子溶液中4小时。

最终，将五种SPA配体偶联树脂4Z-H、5Z-H、4Z和5Z、5Z_D36H分别装入1ml柱筒中。实验中所用的1ml柱筒具有0.72cm的内径和2.50cm的内长度，类似于GE的1ml Hitrap HP柱。

实施例4：4Z-H和4Z的人IgG结合和洗脱测试

材料和方法

将来自生物细胞实验室公司的纯化的人多克隆IgG用于结合测试。将IgG溶解在1XPBS中并用0.2μm膜过滤。将IgG的浓度调节至10mg/ml。

如下制备用于IgG结合测试的缓冲液。

缓冲液A：75mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，EDTA 1mM。

缓冲液B：0.1M柠檬酸，pH 2.8。

制备1ml 4Z-H和4Z蛋白A树脂柱，并分别用缓冲液A平衡。将GE AKTA Explorer100用于运行柱。以0.5ml/min的流速(即2分钟停留时间)向每个柱中注入总共2.0ml的IgG溶液。在样品注入后，以3mg/min的流速用12ml缓冲液A洗涤每个柱。然后通过将缓冲液B从0至100％以3ml/min的流速运行15分钟，用pH梯度洗脱结合的IgG。记录每个柱运行的色谱。

结果

当缓冲液B从0至100％运行时，洗脱液pH以大致线性模型下降。三个不同柱的重叠洗脱曲线显示于图5中。测量每种洗脱液峰处的pH值并列于表3中。

表3

	4Z-H	4Z
			峰洗脱pH	5.02	3.91

4Z-H具有显著高于4Z的洗脱pH。由于4Z-H和4Z共享相同的IgG结合结构域，因此在两种配体中观察到的差异洗脱pH可以归因于4Z-H中间隔螺旋结构域的存在。基于图5，4Z-H的洗脱峰也比4Z的洗脱峰窄，表明螺旋H结构域除了洗脱pH外还可以改善洗脱曲线。

实施例5：5X-H、5X和5X 36H的人IgG结合和洗脱

材料和方法

将来自生物细胞实验室公司(Compton，CA)的纯化的人多克隆IgG用于结合测试。将IgG溶解在1X PBS中并用0.2μm膜过滤。将IgG的浓度调节至10mg/ml。

如下制备用于IgG结合测试的缓冲液。

缓冲液A：75mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，EDTA 1mM。

缓冲液B：0.1M柠檬酸，pH 2.8。

分别制备1ml的5Z-H、5Z和HiTrap蛋白A HP(来自GE)，并用缓冲液A平衡。GE AKTAExplorer 100用于运行柱。以0.5ml/min的流速(即2分钟停留时间)向每个柱中注入总共2.0ml的IgG溶液。在样品注入后，以3mg/min的流速以2mg/min的流速用12ml缓冲液A洗涤柱。然后通过将缓冲液B从0至100％以3ml/min的流速运行15分钟，用pH梯度洗脱结合的IgG。

结果

当缓冲液B从0至100％运行时，洗脱液pH以大致线性模型下降。三个不同柱的重叠洗脱曲线显示于图6中。测量每种洗脱液峰处的pH值并列于表4中。

表4

	5Z-H	5Z	5Z<sub>D36H</sub>
				峰洗脱pH	4.91	3.86	4.28

5Z-H具有显著高于5Z和5Z_D36H两者的洗脱pH。相反，含有与5Z-H相同的IgG结合结构域的5Z具有低得多的洗脱pH。有趣的是，Asp36至His突变确实将洗脱pH提高了约0.3个单位。然而，5Z_D36H的洗脱峰似乎比5Z-H更宽，表明了5Z_D36H的残留非特异性结合，这也在5Z中观察到。

实施例6：逐步洗脱5Z-H和HiTrap蛋白A HP

材料和方法

将来自生物细胞实验室公司(Compton，CA)的纯化的人多克隆IgG用于结合测试。将IgG溶解在1X PBS中并用0.2μm膜过滤。将IgG的浓度调节至10mg/ml。

如下制备用于IgG结合测试的缓冲液。

缓冲液A：1X PBS，pH 7.6(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mMKH2PO4)。

缓冲液B1：0.1M柠檬酸，pH 4.7

缓冲液B2：0.1M柠檬酸，pH 4.3。缓冲液B3：0.1M柠檬酸，pH 4.0。

缓冲液B4：0.1M柠檬酸，pH 4.7。

制备1ml 5Z-H和HiTrap蛋白A HP(来自GE Healthcare)柱并分别用缓冲液A平衡。将GE AKTA Explorer100用于运行柱。以0.5ml/min的流速(即2分钟停留时间)向每个柱中注入总共3.5ml的IgG溶液。在样品注入后，以2mg/min的流速用12ml缓冲液A1洗涤柱。然后结合的IgG在pH 4.75下用缓冲液B1洗脱12ml，在pH 4.25下用缓冲液B2洗脱12ml，在pH 4.0下用缓冲液B3洗脱12ml并最终在pH 2.8下用缓冲液B4洗脱12ml。保存每种洗脱缓冲液并测量蛋白浓度。

结果

5Z-H和Hitrap蛋白A HP的逐步洗脱色谱分别显示于图7和图8中。在图8中，首先在pH 4.75下洗脱约53％的抗体，剩余的抗体不洗脱直至洗脱pH达到2.8。相反，在图7中，在pH4.75下洗脱约99％的抗体。

表5列出了每种洗脱pH下洗脱的产率和百分比。对于5Z-H，结合的IgG在pH 4.75下洗脱超过97-99％，在pH 4.25下洗脱小于1％并在pH 2.8下洗脱接近零。对于HiTrap蛋白AHP，结合的IgG在pH 4.75下洗脱约53％，在pH 4.25下洗脱约3％，在pH 4.0下洗脱约2％并在pH 2.8下洗脱超过40％。

表5

5Z-H在温和条件下(例如pH 4.5或更高)的回收率接近100％。相反，没有间隔结构域的SPA配体(如天然SPA)需要强酸性条件进行洗脱，这可能导致显著量的抗体聚集。

实施例7：用于单克隆抗体的5Z-H和5Z的洗脱pH

材料和方法

将总共1mg商业单克隆抗体(其属于小鼠IgG2类)用于基于板的结合测定。在结合前，将单克隆抗体用1X PBS(pH 7.2)稀释至100μg/ml。通过其C-末端Cys残基将5Z-H和5Z蛋白固定在Pierce^TM马来酰亚胺活化板上。在固定之前，将5Z-H和5Z两者在1X PBS中稀释至100μg/ml。固定程序基于制造商的方案进行。固定5小时后，将板用1X PBS(pH 7.2)洗涤并用封闭缓冲液封闭过夜。在结合测试之前，用1X PBS(pH 7.2)平衡板。

对于结合测试，将100μl的抗体溶液添加到用5Z-H共价包被的每个孔中。在室温下轻轻摇动温育10分钟后，将板用300ul 1X PBS(pH 7.2)洗涤6次。在洗脱之前将所有溶液完全吸出。

制得四种不同pH的洗脱缓冲液(pH 4.7、pH 4.3、pH 4.0和pH 2.8的0.1M柠檬酸盐)用于逐步洗脱。从高pH到低pH，向每个孔中添加50μl每种洗脱缓冲液，在室温下温育5分钟并收集。对于每个洗脱pH，进行三次重复。作为对照，还用pH 2.8的缓冲液进行单步洗脱。洗脱后，用Pierce BCA蛋白测定试剂盒测量洗脱的IgG的蛋白浓度。所有重复的值为平均值。

结果

表6显示了5Z-H对单克隆抗体的结合和洗脱结果。仅在pH 4.7洗脱中检测到IgG，但在pH 4.3、pH 4.0或pH 2.8中未检测到IgG。在pH 4.7下洗脱的IgG的量非常接近在pH2.8下单步洗脱的IgG量。对于5Z的对照组，IgG在pH 4.7下洗脱约50.5％，在pH 4.3下洗脱6％，在pH 4.0下洗脱16％并在pH 2.8下洗脱27.5％。

表6

这是基于板的结合和洗脱实验，其是上述基于柱的色谱实验的替代方案。当固定在板上时，5Z-H配体允许在pH 4.7下完全结合的IgG分子的洗脱。作为对照，5Z是SPA的经典形式，在遇到pH低于4.0的缓冲液之前具有大量结合的IgG。

其它实施方式

应当理解，虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改均在以下权利要求的范围内。