具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种目的蛋白纯化方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：利用洗脱缓冲液对亲和层析柱进行洗脱处理，以便获得含有目的蛋白的洗脱液，所述亲和层析柱加载有待测样品，所述待测样品中含有待纯化目的蛋白，其中，所述洗脱缓冲液中含有醇类物质。

根据本发明实施例的方法，在洗脱缓冲液中加入醇类物质，洗脱过程中不易产生蛋白多聚体，可大幅提高目的蛋白的纯度。

根据本发明的具体实施例，在将含有目的蛋白的样品加载至亲和层析柱的固定相上之前，还需要对亲和层析柱进行平衡，以使目的蛋白能更好地结合到固定相上。

根据本发明的具体实施例，在将含有目的蛋白的样品加载至亲和层析柱的固定相上之后，使用洗脱缓冲液洗脱所述目的蛋白之前，需要对亲和层析柱进行淋洗，洗脱杂蛋白；收集的目的蛋白进一步进行蛋白中和，以便最终获得纯化后的目的蛋白。

根据本发明的实施例，所述醇类物质包括甘露醇、木糖醇和乙二醇至少之一。根据本发明实施例的方法，在洗脱缓冲剂中单独添加甘露醇、木糖醇和乙二醇均可显著抑制洗脱蛋白质多聚体的产生，可大幅提高目的蛋白的纯度。

根据本发明的实施例，所述醇类物质在所述洗脱缓冲液中的体积分数为1％-16％，优选地，所述醇类物质在所述洗脱缓冲液中的体积分数为10％。根据本发明实施例的方法，所述醇类物质在所述浓度范围内，对蛋白多聚体的产生有较好的抑制效果。

根据本发明的实施例，所述洗脱缓冲液包括选自柠檬酸缓冲液、乙酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液的至少一种。

根据本发明的实施例，所述洗脱缓冲液的pH为3-4。

根据本发明的实施例，所述洗脱缓冲液的pH为3.4。根据本发明实施例的方法，加入含有醇类物质的洗脱缓冲液在pH为3.4能进一步提高目的蛋白的回收率。

根据本发明的实施例，使用预装有中和液的容器收集所述洗脱液。本领域中对于目的蛋白的中和，通常是采用收集含有目的蛋白的洗脱液后，再在蛋白洗脱液中加入中和液的方法。根据本发明实施例的方法，使用预装有中和液的容器收集所述洗脱液，相对于本领域常规方法，能进一步提高目的蛋白纯度和回收率。

根据本发明的实施例，所述待测样品包括选自发酵液、细胞培养物和细胞系培养物的至少之一。根据本发明的具体实施例，所述待测样品在上样之前需要初步除杂，以去除其中的细胞及碎片颗粒，初步除杂方法不受限制，能够实现去除样品中的细胞及碎片颗粒即可，比如可以采用两步离心法。

根据本发明的实施例，所述亲和层析柱为Protein A亲和层析柱、Protein G亲和层析柱或Protein L亲和层析柱。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种通过Protein A亲和层析柱纯化目的蛋白的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用洗脱缓冲液对亲和层析柱进行洗脱处理，以便获得含有目的蛋白的洗脱液，所述亲和层析柱加载有待测样品，所述待测样品中含有待纯化目的蛋白，其中，所述洗脱缓冲液为100mM柠檬酸缓冲液，优选地，所述洗脱缓冲液中含有10体积％的醇类物质，所述洗脱缓冲液的pH为3.4，所述待测样品为细胞培养物。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1

实验组：洗脱缓冲液中添加10体积％甘露醇

目的蛋白纯化方法：

1、初步纯化：取含有目的蛋白的细胞培养物，采用两步离心法去除细胞及碎片颗粒，先用1000g离心10min，移取上清于6000g离心30min，收集上清用于后续步骤；

2、捕获层析：采用MabSelect^TMSuRe^TM亲和层析柱，使用5个柱体积平衡缓冲液进行平衡，将经步骤1初步纯化的样品加载到亲和层析柱上，使用5个柱体积的淋洗缓冲液进行淋洗，使用5个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，使用预放有中和液容器收集获得的目的蛋白洗脱物，中和后的目的蛋白溶液的pH为6.5～8.0。使用5个柱体积的再生液进行再生，使用3个柱体积的清洗液清洗层析柱，最后使用5个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，最后使用保存液将层析柱保存。

各步骤所用缓冲溶液如下：

平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.2；

淋洗缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.2；

洗脱缓冲液：100mM柠檬酸缓冲液，10体积％甘露醇，pH 3.4；

中和液：1M Tris-HCl，pH 8.5；

再生液：100mM HAc；

清洗液：0.1M NaOH；

保存液：20体积％乙醇。

对照组：对照组所用的洗脱缓冲液为：100mM柠檬酸缓冲液，pH3.4，其他洗脱条件与实验组目的蛋白纯化方法中的相同。

中和后检测目的蛋白纯度(通过SEC-HPLC检测)，实施例1纯化得到的目的蛋白的纯度为92.76％，回收率为86.22％。而对照组目的蛋白的纯度为49.55％，回收率为71.97％。由此可见，在洗脱缓冲液中添加甘露醇可以显著提高目的蛋白的纯度及回收率。

实施例2：洗脱缓冲液pH值为3.5

目的蛋白纯化方法，洗脱缓冲液pH值与实施例1实验组中存在差异外，其他纯化条件与实施例1实验组中相同，实施例2中洗脱缓冲液pH值为3.5。

中和后检测目的蛋白纯度，实施例2纯化的目的蛋白纯度为90.88％。相比于实施例1实验组中所使用的pH为3.4的洗脱缓冲液，本实施例中使用pH为3.5的洗脱缓冲液，目的蛋白的纯度与实施例1的实验组相似，说明pH为3.5的洗脱缓冲液对目的蛋白的纯化效果好。

实施例3：未使用预放有中和液容器收集获得的含有目的蛋白的洗脱液

目的蛋白纯化方法与实施例1相同，不同之处在于未使用预放有中和液容器收集获得的含有目的蛋白的洗脱液，具体步骤如下所述：

1、初步纯化：取含有目的蛋白的细胞培养物，采用两步离心法去除细胞及碎片颗粒，先用1000g离心10min，移取上清于6000g离心30min，收集上清用于后续步骤；

2、捕获层析：采用MabSelect^TMSuRe^TM亲和层析柱，使用5个柱体积平衡缓冲液进行平衡，将经步骤1初步纯化的样品加载到亲和层析柱上，使用5个柱体积的淋洗缓冲液进行淋洗，使用5个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集获得的目的蛋白洗脱物，然后在目的蛋白洗脱液中加入中和液进行中和，中和后的目的蛋白溶液的pH为6.5～8.0，使用5个柱体积的再生液进行再生，使用3个柱体积的清洗液清洗层析柱，最后使用5个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，最后使用保存液将层析柱保存。

各步骤所用缓冲溶液如下：

平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.2；

淋洗缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.2；

洗脱缓冲液：100mM柠檬酸缓冲液，10体积％甘露醇，pH 3.4；

中和液：1M Tris-HCl，pH 8.5；

再生液：100mM HAc；

清洗液：0.1M NaOH；

保存液：20体积％乙醇。

中和后检测目的蛋白纯度，实施例3纯化得到的目的蛋白的纯度为78.61％，回收率为85.58％。与实施例1实验组(使用预放有中和液容器收集获得的含有目的蛋白的洗脱液)的纯化效果相比，目的蛋白的纯度和回收率有所降低，表明通过使用预放有中和液容器收集获得的目的蛋白洗脱物的方式进行中和，能进一步提升目的蛋白纯度和回收率。

对比例1

目的蛋白纯化方法，除醇类物质种类与实施例1实验组中存在差异外，其他纯化条件与实施例1实验组中相同，对比例1中醇类物质为正丙醇。

结果发现，在亲和层析过程中目的蛋白无法正常洗脱。由此可见，并非所有醇类物质均可提高目的蛋白的纯度及回收率，本发明实施例中的10体积％的甘露醇可以显著提高目的蛋白的纯度和回收率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。