目的蛋白纯化方法
阅读说明：本技术 目的蛋白纯化方法 (Method for purifying target protein ) 是由 赵雪冰 王妮 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种目的蛋白纯化方法。该方法包括：利用洗脱缓冲液对亲和层析柱进行洗脱处理,以便获得含有目的蛋白的洗脱液,所述亲和层析柱加载有待测样品,所述待测样品中含有待纯化目的蛋白,其中,所述洗脱缓冲液中含有非离子表面活性剂。利用本发明提供的方法进行目的蛋白亲和层析,可以显著提高洗脱蛋白质的纯度,抑制洗脱过程中多聚体的产生,提高蛋白回收率。(The invention provides a target protein purification method. The method comprises the following steps: eluting the affinity chromatography column by using an elution buffer solution so as to obtain an eluent containing the target protein, wherein a sample to be detected is loaded on the affinity chromatography column, the sample to be detected contains the target protein to be purified, and the elution buffer solution contains a nonionic surfactant. The method provided by the invention is used for carrying out target protein affinity chromatography, can obviously improve the purity of eluted protein, inhibits the generation of polymers in the elution process, and improves the recovery rate of the protein.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种目的蛋白纯化方法。
背景技术
蛋白质亲和层析技术适用于理化性质差异较小而难分离的蛋白质，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，这种结合在一定条件下是可逆的，待亲和层析结束后，可被洗脱缓冲液洗脱，而其他对配基不具有特异性结合能力的蛋白在上样与洗涤过程中即通过柱体而流穿，不能结合于柱体上。蛋白质亲和层析技术通过目标蛋白质与配体间特异性亲和结合而达到分离纯化的目的，具有生物专一性的特点。
但有些类型的蛋白尤其是Fc融合蛋白在酸性溶液中进行蛋白亲和层析纯化时，容易形成聚集体甚至形成可见的沉淀，而造成纯化后获得蛋白的纯度和回收率低。
因此，利用蛋白亲和层析技术进行蛋白纯化的方法仍需要进一步开发和改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够抑制蛋白亲和层析洗脱过程中多聚体的产生，提高目的蛋白的纯度，提高目的蛋白回收率的方法。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种目的蛋白纯化方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用洗脱缓冲液对亲和层析柱进行洗脱处理，以便获得含有目的蛋白的洗脱液，所述亲和层析柱加载有待测样品，所述待测样品中含有待纯化目的蛋白，其中，所述洗脱缓冲液中含有非离子表面活性剂。发明人意外地发现，在洗脱缓冲液中加入非离子表面活性剂，洗脱过程中不易产生蛋白多聚体，可大幅提高目的蛋白的纯度。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述非离子表面活性剂包括吐温和曲拉通的至少之一。发明人发现，在洗脱缓冲液中单独添加吐温或者曲拉通均可显著抑制洗脱蛋白质多聚体的产生，提高目的蛋白的纯度。
根据本发明的实施例，所述非离子表面活性剂包括吐温80和吐温20的至少之一。发明人发现，在洗脱缓冲液中单独添加吐温80或者吐温20均可显著抑制洗脱蛋白质多聚体的产生，提高目的蛋白的纯度。
根据本发明的实施例，所述非离子表面活性剂在所述洗脱缓冲液中的体积分数为0.5％～2％，根据本发明实施例的方法，所述非离子表面活性剂在该浓度范围内，对蛋白多聚体的产生有较好的抑制效果。
根据本发明的实施例，所述洗脱缓冲液包括柠檬酸缓冲液、乙酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液的至少一种。
根据本发明的实施例，所述洗脱缓冲液的pH为3～4。
根据本发明的实施例，所述洗脱缓冲液的pH为3.4～3.6。发明人发现，加入非离子表面活性剂的洗脱缓冲液在pH为3.4～3.6时能保障较高的回收率。
根据本发明的实施例，使用预装有中和液的容器收集所述洗脱液。现有技术中多在收集含有目的蛋白的洗脱液之后加入中和液进行中和，发明人发现，相比较于现有技术，使用预装有中和液的容器收集所述洗脱液，能进一步提高目的蛋白纯度和回收率。
根据本发明的实施例，所述待测样品包括选自发酵液或细胞培养物的至少之一。
根据本发明的实施例，所述亲和层析柱为Protein A亲和层析柱、Protein G亲和层析柱或Protein L亲和层析柱。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种通过Protein A亲和层析柱纯化目的蛋白的方法。根据本发明实施例，所述方法包括：利用洗脱缓冲液对亲和层析柱进行洗脱处理，以便获得含有目的蛋白的洗脱液，所述亲和层析柱加载有待测样品，所述待测样品中含有待纯化目的蛋白，其中，所述洗脱缓冲液为100mM柠檬酸缓冲液，所述洗脱缓冲液含有0.5体积％～2体积％的非离子表面活性剂，所述洗脱缓冲液的pH为3.4～3.6，所述待测样品为细胞培养物。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种目的蛋白纯化方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用洗脱缓冲液对亲和层析柱进行洗脱处理，以便获得含有目的蛋白的洗脱液，所述亲和层析柱加载有待测样品，所述待测样品中含有待纯化目的蛋白，其中，所述洗脱缓冲液中含有非离子表面活性剂。
根据本发明实施例的方法，在洗脱缓冲液中加入非离子表面活性剂，洗脱过程中不易产生蛋白多聚体，可大幅提高目的蛋白的纯度。
根据本发明的具体实施例，在将含有目的蛋白的样品加载至亲和层析柱的固定相上之前，还需要对亲和层析柱进行平衡，以使目的蛋白能更好地结合到固定相上。
根据本发明的具体实施例，在将含有目的蛋白的样品加载至亲和层析柱的固定相上之后，使用洗脱缓冲液洗脱所述目的蛋白之前，需要对亲和层析柱进行淋洗，洗脱杂蛋白；收集的目的蛋白进一步进行蛋白中和，以便最终获得纯化后的目的蛋白。
根据本发明的实施例，所述非离子表面活性剂包括吐温80和吐温20至少之一。根据本发明实施例的方法，在洗脱缓冲剂中单独添加吐温80或者吐温20均可显著抑制洗脱蛋白质多聚体的产生，提高目的蛋白的纯度。
根据本发明的实施例，所述非离子表面活性剂在所述洗脱缓冲液中的体积分数为0.5％～2％。
根据本发明的实施例，所述洗脱缓冲液包括柠檬酸缓冲液、乙酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液的至少一种。
根据本发明的实施例，所述洗脱缓冲液的pH为3～4。
根据本发明的实施例，所述洗脱缓冲液的pH为3.4～3.6。根据本发明实施例的方法，加入非离子表面活性剂的洗脱缓冲液在pH为3.4～3.6时能保障较高的回收率。
根据本发明的实施例，使用预装有中和液的容器收集所述洗脱液。本领域中对于目的蛋白的中和，通常是采用收集包含目的蛋白的洗脱液后，再在蛋白洗脱液中加入中和液的方法。根据本发明实施例的方法，使用预装有中和液的容器收集所述洗脱液，相对于本领域常规方法，能进一步提高目的蛋白纯度和回收率。
根据本发明的实施例，所述样品包括选自发酵液、细胞培养物和细胞系培养物的至少之一。根据本发明的具体实施例，所述待测样品在上样之前需要初步除杂，以去除其中的细胞及碎片颗粒，初步除杂方法不受限制，能够实现去除样品中的细胞及碎片颗粒即可，比如可以采用两步离心法。
根据本发明的实施例，所述亲和层析柱为Protein A亲和层析柱、Protein G亲和层析柱或Protein L亲和层析柱。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种通过Protein A亲和层析柱纯化目的蛋白的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用洗脱缓冲液对亲和层析柱进行洗脱处理，以便获得含有目的蛋白的洗脱液，所述亲和层析柱加载有待测样品，所述待测样品中含有待纯化目的蛋白，其中，所述洗脱缓冲液为100mM柠檬酸缓冲液，所述洗脱缓冲液含有0.5体积％～2体积％的非离子表面活性剂，所述洗脱缓冲液的pH为3.4～3.6，所述待测样品为细胞培养物。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
实验组：吐温80的体积分数为1％
目的蛋白纯化方法：
1、初步纯化：取含有目的蛋白的细胞培养物，采用两步离心法去除细胞及碎片颗粒，先用1000g离心10min，移取上清于6000g离心30min，收集上清用于后续步骤；
2、捕获层析：采用MabSelectTM SuReTM亲和层析柱，使用5个柱体积平衡缓冲液进行平衡，将经步骤1初步纯化的样品加载到亲和层析柱上，使用5个柱体积的淋洗缓冲液进行淋洗，使用5个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集获得的目的蛋白洗脱物，然后在目的蛋白洗脱液中加入中和液进行中和，中和后的目的蛋白溶液的pH为6.5～8.0。使用5个柱体积的再生液进行再生，使用3个柱体积的清洗液清洗层析柱，最后使用5个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，最后使用保存液将层析柱保存。
各步骤所用缓冲溶液如下：
平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.2；
淋洗缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.2；
洗脱缓冲液：100mM柠檬酸缓冲液，1体积％吐温80,pH 3.4；
中和液：1M Tris-HCl，pH 8.5；
再生液：100mM HAc；
清洗液：0.1M NaOH；
保存液：20体积％乙醇。
对照组：对照组所用的洗脱缓冲液为：100mM柠檬酸缓冲液，pH3.4，其他洗脱条件与实验组目的蛋白纯化方法中的相同。
中和后检测目的蛋白纯度(通过SEC-HPLC检测)、浓度，实施例1实验组纯化得到的目的蛋白的纯度为82.23％，回收率为85.81％。而对照组目的蛋白的纯度为49.55％，回收率为71.97％。
实施例2：吐温80的体积分数为0.5％
目的蛋白纯化方法，除吐温80的浓度与实施例1实验组中存在差异外，其他纯化条件与实施例1实验组中相同，实施例2中吐温80的体积分数为0.5％。
中和后检测目的蛋白纯度、浓度，实施例2纯化的目的蛋白纯度为67.78％，回收率为83.27％。
实施例3：吐温80的体积分数为2％
目的蛋白纯化方法，除吐温80的浓度与实施例1实验组中存在差异外，其他纯化条件与实施例1实验组中相同，实施例3中吐温80的体积分数为2％。
中和后检测目的蛋白纯度、浓度，实施例2纯化的目的蛋白纯度为54.96％，回收率为85.26％。
由实施例1～3可知，参照表1，在洗脱缓冲液中加入吐温80后，能有效提高单体比例，减少了多聚体的产生，蛋白纯度得到显著提高，并有效提高了回收率。洗脱缓冲液中吐温80的体积分数分别为0.5％、1％和2％时，洗脱中和后目的蛋白纯度可达到67.78％、82.23％和54.96％，相比不添加吐温80时的蛋白洗脱纯度49.55％，分别提高了37％、66％和11％，并且能够保持较高的回收率；洗脱缓冲液中吐温80的体积分数分别为0.5％、1％和2％时，洗脱中和后目的蛋白的回收率分别为83.27％、85.81％和85.26％，相比不添加吐温80时的蛋白回收率71.97％，分别提高了16％、19％和18％。
表1：洗脱缓冲液中不同浓度吐温80对应的蛋白纯度
吐温80浓度
纯度(SEC-HPLC)
0
49.55％
0.5％
67.78％
1％
82.23％
2％
54.96％
实施例4：使用预放有中和液容器收集获得的含有目的蛋白的洗脱液
目的蛋白纯化方法：
1、初步纯化：取含有目的蛋白的细胞培养物，采用两步离心法去除细胞及碎片颗粒，先用1000g离心10min，移取上清于6000g离心30min，收集上清用于后续步骤；
2、捕获层析：采用MabSelectTM SuReTM亲和层析柱，使用5个柱体积平衡缓冲液进行平衡，将经步骤1初步纯化的样品加载到亲和层析柱上，使用5个柱体积的淋洗缓冲液进行淋洗，使用5个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，使用预放有中和液容器收集获得的目的蛋白洗脱物，中和后的目的蛋白溶液的pH为6.5～8.0。使用5个柱体积的再生液进行再生，使用3个柱体积的清洗液清洗层析柱，最后使用5个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，最后使用保存液将层析柱保存。
各步骤所用缓冲溶液如下：
平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.2；
淋洗缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.2；
洗脱缓冲液：100mM柠檬酸缓冲液，1体积％吐温80，pH 3.4；
中和液：1M Tris-HCl，pH 8.5；
再生液：100mM HAc；
清洗液：0.1M NaOH；
保存液：20体积％乙醇。
中和后检测目的蛋白纯度、浓度，实施例4纯化得到的目的蛋白的纯度为88.52％，回收率为89.14％。与实施例1的纯化效果相比，目的蛋白的纯度和回收率都有进一步的提升，表明通过使用预放有中和液容器收集获得的含有目的蛋白的洗脱液的方式进行中和，能进一步提升目的蛋白纯度和回收率。
实施例5：洗脱缓冲液的pH值为3.5
实施例5中，除洗脱缓冲液pH值与实施例4中存在差异外，其他纯化条件同实施例4，实施例5中洗脱缓冲液的pH值为3.5。
中和后检测目的蛋白纯度、浓度，实施例5纯化后得到的目的蛋白的纯度为90.2％，回收率为88.33％。由此可见，相对于实施例4中洗脱缓冲液的pH为3.4，本实施例中洗脱缓冲液的pH为3.5时，目的蛋白的纯度和回收率同样很高。
实施例6：调整洗脱缓冲液pH
实施例6中，除洗脱缓冲液存在差异外，其他实验条件同实施例1实验组。
实施例6中使用的洗脱缓冲液为：1)100mM柠檬酸缓冲液，pH 3.6；2)100mM柠檬酸缓冲液，pH 3.5；3)100mM柠檬酸缓冲液，pH 3.4。
结果参照表2，在亲和洗脱时洗脱缓冲液的pH为3.4～3.6能保障50％以上的回收率。
表2：不同pH的洗脱缓冲液对应的蛋白洗脱回收率
pH
洗脱回收率
3.6
51.87％
3.5
67.18％
3.4
71.97％
对比例1
对比例1中，除洗脱缓冲液中吐温80的浓度存在差异外，其他纯化条件同实施例1实验组，对比例1中吐温80的体积分数为0.2％，参照表3。
表3：洗脱缓冲液中0.2％吐温80对应的蛋白纯度
吐温80浓度
纯度(SEC-HPLC)
0.2％
49.32％
对比例1纯化后得到的目的蛋白的纯度为49.32％，回收率为67.11％，相比于实施例1～3中添加0.5％、1％和2％吐温80的结果，本对比例中得到的目的蛋白的纯度及回收率均明显降低。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。