阅读说明：本技术 解脂亚罗酵母应用于芦笋采后病害防治及贮藏保鲜的用途 (Application of yarrowia lipolytica in preventing and treating postharvest diseases of asparagus and storing and refreshing asparagus ) 是由 张晓云 闫雪莉 张红印 胡婉营 赵利娜 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于采后病害生物防治领域,具体涉及一种解脂亚罗酵母应用在芦笋采后病害防治及贮藏保鲜的用途；步骤为：将解脂亚罗酵母进行活化、培养,离心得到菌体,用无菌生理盐水洗涤、离心,得到的菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为1×10<Sup>7</Sup>cells/mL的菌悬液,直接均匀喷洒在芦笋表面,自然风干；即可实现防治芦笋采后病害和贮藏保鲜；本发明可以有效控制芦笋采后根腐病和自然腐烂,从而降低芦笋采后病害所造成的损失；同时对采后芦笋主要品质指标可溶性糖、维生素C和叶绿素含量无不良影响,且安全环保,可以代替化学杀菌剂防治芦笋采后病害,减少化学杀菌剂对人体及环境的潜在危害。(The invention belongs to the field of postharvest disease biological control, and particularly relates to application of yarrowia lipolytica in postharvest disease control and storage and preservation of asparagus; the method comprises the following steps: activating yarrowia lipolytica, culturing, centrifuging to obtain thallus, washing with sterile normal saline, centrifuging, diluting with sterile normal saline to 1 × 10 concentration 7 Directly and uniformly spraying cell/mL bacterial suspension on the surface of the asparagus, and naturally drying; the disease control and storage and fresh keeping of the asparagus after picking can be realized; the method can effectively control the root rot and the natural rot of the picked asparagus, thereby reducing the loss caused by the disease of the picked asparagus; simultaneously, the method has no adverse effect on the main quality indexes of the picked asparagus, such as the content of soluble sugar, vitamin C and chlorophyll, is safe and environment-friendly, and can replace chemical bactericides to prevent and treat the asparagusThe postharvest diseases reduce the potential harm of chemical bactericides to human bodies and the environment.)

解脂亚罗酵母应用于芦笋采后病害防治及贮藏保鲜的用途

技术领域

本发明属于蔬菜采后病害生物防治领域，具体涉及一种解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)应用于芦笋采后病害防治及贮藏保鲜的用途。

背景技术

芦笋，学名石刁柏(Asparagus officinalis)，别名龙须菜，为百合科天门冬属宿根性多年生草本植物。绿芦笋含有叶绿素、氨基酸、多种维生素、碳水化合物及钙、磷等矿物质及多种活性成分,具有较高的营养价值,被认为是世界上营养平衡最佳的药食兼用植物之一,对高血压、高血脂、动脉血管硬化、心脏病、肝炎、肝硬化、肾炎、水肿、膀胱炎等多种疾病有疗效。长期食用能帮助消化,增强食欲,提高肌体免疫力,降低有害物质的毒性,抑制癌细胞的活力,阻止癌细胞的产生,具有良好的抗癌作用。

目前，中国已成为世界第一大芦笋生产和出口国，播种面积和出口量均超过世界总量的50％，年产值达数百亿元。然而，采后芦笋组织脆嫩，很容易受到机械损伤和生理伤害，进而受到各种病原菌如镰孢菌(Fusarium)、链格孢(Alternaria)及灰霉菌(Botrytis)等的侵染。采后芦笋受到病原菌侵染后，其生理及代谢活动会发生不同程度的劣变，极大地影响了芦笋的营养价值和食用品质，并造成巨大的经济损失。因此，必须采取合适的方法控制其采后病害。

目前，国内外对果蔬采后病害的控制方法主要分为物理控制法、化学控制法以及生物控制法。其中物理控制法的优点是安全无害，对人体和环境无不良影响。但大部分物理控制法对设备的要求比较高，在一定程度上增加了成本，而且条件控制不当极易对采后芦笋感官品质产生不良影响，如温度过低会造成芦笋的冻伤，温度过高会加速芦笋硬度增加，可食率降低，营养物质降解和风味变劣等。自1960年开始，使用化学杀菌剂成为控制果蔬采后病害最重要的手段。化学杀菌剂以其高效、低价、使用方便等优点，很长的一段时间内一直被大量使用，但该方法存在引起病原菌抗药性、危害人体健康并污染环境等缺点。而随着人们对环境、生态、健康的关注，针对化学杀菌刹使用的政策将越来越严格。因而，积极寻找可替代化学杀菌剂的、高效、安全的果蔬采后病害防治方法显得尤为重要。

生物控制法因其能有效控制果蔬采后病害，且具有安全无毒、对环境无污染和不引起病原菌产生抗药性等优点，逐渐成为控制果蔬采后病害的研究热点，并有望在未来取代化学杀菌剂。但是，目前尚未有安全有效降低芦笋采后病害的生物防治方法，更未见有利用解脂亚罗酵母防治芦笋采后病害的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)控制芦笋采后病害的方法，该酵母能够有效控制芦笋采后根腐病和自然腐烂的发生，降低芦笋病情指数，从而达到芦笋贮藏保鲜、减少采后病害造成的损失，具有潜在的应用价值。

本发明采用的技术方案

本发明所提供的防治芦笋采后病害的解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)WSL-01已在专利“解脂亚罗酵母在葡萄采后病害防治中的应用及使用方法”(专利号：ZL201410231417.9)中公开；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.8492，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2013年11月21日。

解脂亚罗酵母应用于芦笋采后病害防治及贮藏保鲜的用途，所述解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)WSL-01用于控制芦笋采后根腐病及自然腐烂，用于芦笋的贮藏保鲜。

解脂亚罗酵母应用于芦笋采后病害防治及贮藏保鲜的用途，具体步骤如下：

首先将解脂亚罗酵母进行活化，然后用NYDB培养基培养解脂亚罗酵母，离心得到菌体，接着用无菌生理盐水洗涤、离心，重复洗涤、离心步骤数次后得到的菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为1×10⁷cells/mL的菌悬液；在芦笋表面用灭菌的打孔器进行打孔，然后在每孔分别注入适量体积的解脂亚罗酵母的菌悬液，一段时间后在每孔分别接种与酵母菌悬液等体积的层出镰孢菌孢子悬浮液，浓度为5×10⁴spores/mL；或者将菌悬液直接均匀喷洒在芦笋表面；自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，存放于室温条件下或培养箱中。

优选的，所述培养的条件为：温度28～30℃，转速180～200rpm，时间24～28h。

优选的，所述离心的条件为：转速7000g，时间10～15min。

优选的，所述打孔的孔径为3mm，深度2mm；所述一段时间为2h。

优选的，所述在孔中注入解脂亚罗酵母菌悬液和层出镰孢菌孢子悬浮液的体积均为20μL。

优选的，所述存放于培养箱中培养箱的温度设置为20～25℃，湿度90％。

优选的，所述的NYDB培养基(以1L计)为：酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。

本发明的优点：

(1)本发明所使用的解脂亚罗酵母WSL-01可以有效控制芦笋采后根腐病和自然腐烂，从而降低芦笋采后病害所造成的损失。

(2)本发明所使用的解脂亚罗酵母WSL-01对采后芦笋主要品质指标可溶性糖、维生素C和叶绿素含量无不良影响，且有减缓品质指标降低的效果。

(3)本发明所使用的解脂亚罗酵母WSL-01目前尚未有在芦笋采后病害防治上应用的报道，本发明使用解脂亚罗酵母WSL-01，既可以代替化学杀菌剂防治芦笋采后病害，减少化学杀菌剂对人体及环境的潜在危害，亦可减少使用物理杀菌贮藏所产生的经济和能源负担，具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为不同浓度解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋根腐病的控制作用；其中：(Ⅰ)为芦笋尖部的病情指数，(Ⅱ)为芦笋基部的病情指数；不同天数对应的柱状图从左至右依次为CK、A、B、C、D；

CK为无菌生理盐水处理组，即对照组；A、B、C、D分别代表不同的解脂亚罗酵母WSL-01菌悬液浓度(单位：cells/mL)，其中A：1×10⁶；B：1×10⁷；C：1×10⁸；D：1×10⁹；不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

图2为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋自然腐烂的控制作用；其中：CK为无菌生理盐水处理组，即对照组；Y为1×10⁷cells/mL酵母菌悬液处理组；不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

图3为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋可溶性糖含量的影响；其中：(Ⅰ)为芦笋尖部的可溶性糖含量，(Ⅱ)为芦笋基部的可溶性糖含量；CK为无菌生理盐水处理组，即对照组；Y为1×10⁷cells/mL酵母菌悬液处理组；不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

图4为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋维生素C含量的影响；其中：(Ⅰ)为芦笋尖部维生素C含量，(Ⅱ)为芦笋基部维生素C含量；CK为无菌生理盐水处理组，即对照组；Y为1×10⁷cells/mL酵母菌悬液处理组；不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

图5为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋叶绿素含量的影响；其中：(Ⅰ)为芦笋尖部叶绿素含量，(Ⅱ)为芦笋基部叶绿素含量；CK为无菌生理盐水处理组，即对照组；Y为1×10⁷cells/mL酵母菌悬液处理组；不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

通过借助以下实施实例更加详细的诠释本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。

解脂亚罗酵母WSL-01培养程序为：(1)固体活化：将所用酵母菌株接种于NYDA培养基中，在28℃培养48h；(2)液体培养：在250mL的三角瓶中装入50mL的NYDB种子培养基，用接种环接入一环活化好的酵母，在28℃，180rpm条件下培养24h；(3)离心分离再悬浮：将上述酵母培养混合物在7000g条件下，离心15min，并用无菌生理盐水洗涤2次，以去除培养基质，最后用无菌生理盐水重新再悬浮，最终调节至所需的酵母细胞浓度。

本发明所用到的病原菌—层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)系本实验室自主筛选得到，在PDA培养基上25℃培养7d，刮取菌丝于无菌生理盐水中，再用无菌八层纱布进行过滤，得到孢子悬浮液，最终调至5×10⁴spores/mL。

实施例1：

用于防治芦笋采后病害解脂亚罗酵母WSL-01浓度的筛选；

一、试验方案；

供试的芦笋粗细均匀，色泽一致，表面无机械损伤及病虫伤害。先用清水冲洗干净芦笋表面的泥土，接着将其浸泡在3％次氯酸钠溶液中消毒5分钟，用无菌水将其冲洗干净，室温晾干。分别在芦笋的尖部和基部分别打一个孔径为3mm，深2mm的伤口；在不同的伤口处分别加入20μL以下处理液：(1)1×10⁶cells/mL的解脂亚罗酵母WSL-01悬液；(2)1×10⁷cells/mL的解脂亚罗酵母WSL-01悬液；(3)1×10⁸cells/mL的解脂亚罗酵母WSL-01悬液；(4)1×10⁹cells/mL的解脂亚罗酵母WSL-01悬液；(5)无菌生理盐水；

静置2h后，在每个伤口处分别再接种20μL的5×10⁴spores/mL的病原菌孢子悬浮液；自然晾干后，将芦笋于塑料筐中用保鲜膜密封，置于20℃恒温恒湿培养箱(湿度90％)中贮藏；每个处理重复三次，每次重复16根芦笋。整个试验重复2次。

病情指数的计算公式如下：

病情指数＝∑(各级病株数×相对级数代表值)/(总株数×最高级数代表值)

二、试验结果；

图1为不同浓度解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋根腐病的控制作用；其中：(Ⅰ)为芦笋尖部的病情指数，(Ⅱ)为芦笋基部的病情指数；不同天数对应的柱状图从左至右依次为CK、A、B、C和D；CK为无菌生理盐水处理组，即对照组；A、B、C、D分别代表不同的解脂亚罗酵母WSL-01菌悬液浓度(单位：cells/mL)，其中A：1×10⁶；B：1×10⁷；C：1×10⁸；D：1×10⁹；

由图1中的(Ⅰ)图可知，在贮藏4d和5d时，由1×10⁶cells/mL、1×10⁷cells/mL和1×10⁹cells/mL酵母菌悬液处理的芦笋尖部的病情指数显著低于对照组和1×10⁸cells/mL酵母菌悬液处理组(p<0.05)；而由(Ⅱ)图可知，由1×10⁷cells/mL的酵母菌悬液处理的芦笋基部的病情指数始终显著低于其他处理组(p<0.05)。因此，1×10⁷cells/mL酵母菌悬液对芦笋采后根腐病具有显著的控制作用，故可采用此浓度用于后续试验。

实施例2：

解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋采后自然腐烂的控制作用；

一、试验方案；

供试的芦笋粗细均匀，色泽一致，表面无机械损伤及病虫伤害。在未清洗和消毒的芦笋表面均匀喷洒1×10⁷cells/mL的解脂亚罗酵母WSL-01悬液，喷洒无菌生理盐水的芦笋作为对照组。自然晾干后，将芦笋于塑料筐中用保鲜膜密封，置于20℃恒温恒湿培养箱(湿度90％)中贮藏。每个处理重复三次，每次重复16根芦笋。整个试验重复2次。

病情指数的计算公式如下：

病情指数＝∑(各级病株数×相对级数代表值)/(总株数×最高级数代表值)

二、试验结果；

图2为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋自然腐烂的控制作用；由图2所示，经解脂亚罗酵母WSL-01处理过的芦笋的病情指数始终显著(p<0.05)低于用无菌生理盐水处理过的芦笋，由此表明，解脂亚罗酵母WSL-01对采后芦笋的腐烂有一定的控制作用。

实施例3：

解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋采后可溶性糖、维生素C和叶绿素含量的影响；

一、试验方案；

供试的芦笋粗细均匀，色泽一致，表面无机械损伤及病虫伤害。在未清洗和消毒的芦笋表面分别均匀喷洒以下处理液：(1)1×10⁷cells/mL的解脂亚罗酵母菌悬液；(2)对照组为无菌生理盐水。自然晾干后，将处理好的芦笋于塑料筐中用保鲜膜密封，置于20℃恒温恒湿培养箱(湿度90％)中贮藏。每个处理重复三次，每次重复16根芦笋。整个试验重复2次。

具体测量方法如下：

1、可溶性糖：采用蒽酮比色法，称取2g芦笋组织，剪碎，置于25mL刻度试管中，加10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水浴中提取30min，将提取液定容至100mL。吸取上清液1mL于试管中，加1mL蒸馏水，0.5mL蒽酮乙酸乙酯和5mL浓硫酸，充分震荡混匀后立即放入沸水浴保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测定吸光度。

可溶性糖含量计算如下：

其中C为根据标曲查到的糖含量(μg)，V是提取液体积(ml)，a是吸取样品液体积(ml)，N是稀释倍数，W是样品重量(g)。

2、维生素C：2,6-二氯靛酚钠法，取5g绿芦笋组织样品置于研钵中，加入少量2％草酸溶液，在冰浴避光条件下研磨，研磨呈浆状后，转入50mL离心管中，用草酸溶液冲洗研钵，倒入离心管中，4℃、8000g下离心15min，吸取上清液于100mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过滤溶液备用(0.45μm滤膜)。取10mL滤液置于100mL的锥形瓶中，用经标定的2,6-二氯靛酚溶液滴定滤液，至出现微红色且15s不褪色。记下用量，同时以10mL 2％的草酸溶液做空白，按照同样的方法进行滴定，重复三次。根据2,6-二氯靛酚的用量，计算绿芦笋中抗坏血酸的含量，以每100g样品(鲜重)中含有的抗坏血酸的质量表示，即mg/100g。

抗坏血酸含量计算如下：

其中V是样品提取液总体积(ml)，V1是样品滴定消耗的染料体积(ml)，V2是空白滴定消耗的染料体积(ml)，V3是滴定时所取样品溶液体积(ml)，P是1ml染料溶液相当于抗坏血酸的质量，单位mg/ml，M是样品质量(g).

3、叶绿素：称取剪碎的新鲜样品3g，共三份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2-3ml 95％乙醇，研磨成匀浆，再加95％乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3-5分钟；取滤纸一张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒将提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量95％乙醇冲洗研钵，钵棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中；用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止，最后用乙醇定容至25ml，摇匀；将叶绿体色素提取液倒入比色杯内，以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光值。

叶绿素含量计算如下：

Ca＝13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉

Cb＝24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅

其中C为色素含量(mg/L)；V为提取液体积(ml)，N为稀释倍数，m为样品质量(g),1000是表示1L＝1000ml

二、试验结果；

按照上述步骤试验，统计的试验结果如下：

图3为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋可溶性糖含量的影响；由图3可知，采后绿芦笋在20℃贮藏5d后，两种处理的芦笋的尖部和基部的可溶性糖含量均降低。图3中的(Ⅰ)图可知，贮藏5d后，经解脂亚罗酵母WSL-01处理的芦笋的尖部的可溶性糖含量显著高于对照组(p<0.05)；而由(Ⅱ)图可知，经酵母处理的芦笋的基部的可溶性糖含量与对照组之间无显著性差异；该结果表明解脂亚罗酵母WSL-01对采后芦笋可溶性糖含量无不良影响，且可以减缓采后绿笋尖部可溶性糖含量的降低。

图4为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋维生素C含量的影响；由图4可知，采后绿芦笋在20℃贮藏5d后，两种处理的芦笋的尖部和基部的维生素C含量也均降低。由图4中的(Ⅰ)图可知，贮藏5d时，经解脂亚罗酵母WSL-01处理的芦笋的尖部的维生素C含量与对照组无显著差异；而由(Ⅱ)图可知，经酵母处理的芦笋的基部的维生素C含量显著高于对照组(p<0.05)。这表明解脂亚罗酵母对采后芦笋尖部维生素C含量无不良影响，且可以减缓基部维生素C含量的降低。

图5为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋叶绿素含量的影响；其中(Ⅰ)图为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋尖部叶绿素含量的影响；(Ⅱ)为解脂亚罗酵母WSL-01对芦笋基部叶绿素含量的影响；图5可知，采后绿芦笋在20℃贮藏5d后，两种处理的芦笋尖部的叶绿素含量均降低，对照组芦笋基部叶绿素含量也降低，但拮抗酵母处理的芦笋的基部的叶绿素含量没有显著变化。贮藏5d后，拮抗酵母处理的芦笋的尖部和基部的叶绿素含量均显著高于对照组。因此，该拮抗酵母处理不仅对芦笋尖部和基部叶绿素含量无不良影响，反而可以显著缓减其叶绿素含量的下降。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。