阅读说明：本技术 浅白隐球酵母菌保鲜剂 (Cryptococcus albidus antistaling agent ) 是由 王傲雪 吕游 刘佳音 陈秀玲 张瑶 张贺 冯明芳 郭兰 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种浅白隐球酵母菌保鲜剂,所述保鲜剂由浅白隐球酵母菌和抗坏血酸复合而成,其可用于油豆角采后保鲜。贮藏试验表明：相比于对照各处理的腐烂率、锈斑指数及失重率都有所降低,维生素C含量、叶绿素含量和可溶性蛋白含量下降幅度缓慢,对油豆角采后品质有积极的影响。in vitro和in vivo试验说明浅白隐球酵母菌可通过快速繁殖的方式与病原菌竞争营养和空间,竞争作用是酵母菌抑菌机制之一。浅白隐球酵母菌保鲜剂处理的油豆角在贮藏期间,超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化氢酶活性在前期均表现为升高,豆荚内的丙二醛含量的升高得到抑制,表明浅白隐球酵母菌对油豆角抗病性有诱导作用。(The invention discloses a cryptococcus albidus preservative which is compounded by cryptococcus albidus and ascorbic acid and can be used for preserving picked oil beans. The storage test shows that: compared with the control, the rotting rate, the rust spot index and the weight loss rate of each treatment are reduced, the vitamin C content, the chlorophyll content and the soluble protein content are reduced slowly, and the quality of the picked oil kidney beans is positively influenced. The in vitro and in vivo tests show that the cryptococcus albidus can compete with pathogenic bacteria for nutrition and space in a rapid propagation mode, and the competition effect is one of yeast bacteriostasis mechanisms. During the storage period of the green beans treated by the cryptococcus albidus preservative, the activities of superoxide dismutase, phenylalanine ammonia lyase and catalase are increased at the early stage, and the increase of the malondialdehyde in the bean pods is inhibited, which indicates that the cryptococcus albidus has an induction effect on the disease resistance of the green beans.)

浅白隐球酵母菌保鲜剂

技术领域

本发明涉及一种酵母菌保鲜剂。

背景技术

采后果蔬在贮藏和运输过程中，由于呼吸代谢活动、微生物作用及水分的流失常常会有萎蔫、霉变和腐烂的现象发生。其中由微生物侵染造成的腐烂并不少见，病原微生物通过在果蔬表面上的坏死组织和伤口入侵，利用入侵位点周围的营养和空间进行繁殖，使果蔬感染并且发病腐烂，造成果蔬品质下降甚至失去商品价值，带来的损失严重。

长期以来，不同抑制采后病害的方法逐渐被应用到果蔬贮藏保鲜过程中，其中被应用得最为普遍是成本低、操作简便的化学方法，但是其不足之处在于化学药剂的残留威胁人类健康，对环境造成不利影响，以及长期的使用会造成采后病害病原菌产生抗性。低温贮藏等方式也存在着能耗大、成本高和果蔬品质不稳定等问题。越来越多的采后病害防治方法被应用到果蔬保鲜中，旨在弥补其他方式的不足。伴随生物技术的发展，利用生物手段对采后病害进行控制，降低果蔬腐烂的方式逐渐出现在人们视野中，开发安全而又有效抑制采后病害的新型生物菌剂应用到果蔬保鲜中已受到广泛关注。

目前已有许多生防细菌和真菌被应用到病害防治中，其中，酵母菌因具有安全性高、抑菌谱广、生长迅速、遗传稳定性高、对营养要求低、对化学药物耐受性高，同时能与其他方法配合使用等特点而备受关注。

拮抗酵母菌作为可防治果蔬采后病害拮抗菌中的一种，其主要优点在于对环境的要求低、抗逆性强、繁殖迅速、不产生毒素、受化学物质影响较小、抑菌谱较广且拮抗效果显著，且通过复合施用、与其它抑菌方法结合或是通过基因工程的手段可以的提高其生防效力。有研究发现，拮抗酵母菌可以产生分解真菌毒素的物质或降低毒素在果实上的积累，因而成为生物防治采后病害研究的主要菌种。目前报道存在的酵母菌约有600多种，研究发现具有生防能力的有几十种，这些生防酵母菌的种类主要集中于隐球酵母属(Cryptococcus)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)和毕赤酵母属(Pichia)。

发明内容

本发明通过探究酵母菌对油豆角采后病害的抑制作用、对油豆角的保鲜作用及对采后病原菌的生防机理，提供了一种浅白隐球酵母菌保鲜剂。本发明首次探究酵母菌在油豆角的保鲜作用，浅白隐球酵母菌与保鲜助剂共同使用的保鲜效果较为明显，能够减少油豆角采后病害，为生防酵母菌更好地应用到园艺产品采后保鲜中提供了理论依据。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种浅白隐球酵母菌保鲜剂，由浅白隐球酵母菌和抗坏血酸复合而成，其中：浅白隐球酵母菌的浓度为1×10²～1×10⁸cfu/mL，优选浓度为1×10⁸cfu/mL。

上述浅白隐球酵母菌保鲜剂可用于油豆角采后保鲜。

本发明中，浅白隐球酵母为浅白隐球酵母菌(Cryptococcus albidus)WY-1(简称Ca64)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1976。

相比于现有技术，本发明具有如下优点：

1、贮藏试验表明：相比于对照各处理的腐烂率、锈斑指数及失重率都有所降低，维生素C含量、叶绿素含量和可溶性蛋白含量下降幅度缓慢，对油豆角采后品质有积极的影响。

2、in vivo试验表明：浅白隐球酵母菌在豆荚表面能很好的定殖，且短时间内可以迅速繁殖，之后菌群达到一个稳定水平。浅白隐球酵母菌+抗坏血酸对灰霉病的发生有抑制作用，防治效果较为明显。in vitro和in vivo试验说明浅白隐球酵母菌可通过快速繁殖的方式与病原菌竞争营养和空间，竞争作用是酵母菌抑菌机制之一。

3、浅白隐球酵母菌+抗坏血酸复合剂型处理的油豆角在贮藏期间，超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)活性在前期均表现为升高，豆荚内的丙二醛(MDA)含量的升高得到抑制，表明浅白隐球酵母菌对油豆角抗病性有诱导作用。

附图说明

图1为浅白隐球酵母菌与灰葡萄孢菌的拮抗作用，A为浅白隐球酵母菌，B为对照。

图2为浅白隐球酵母菌对灰葡萄孢菌菌丝的抑制率。

图3为浅白隐球酵母菌在豆荚表面的生长动态。

图4为浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角失重率的影响。

图5为浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角Vc含量的影响。

图6为浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角叶绿素含量的影响。

图7为浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角可溶性蛋白含量的影响。

图8为浅白隐球酵母菌保鲜剂处理油豆角丙二醛含量的变化。

图9为浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角SOD活性的影响。

图10为浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角PAL活性的影响。

图11为浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角CAT活性的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供的浅白隐球酵母菌保鲜剂由浅白隐球酵母菌和抗坏血酸复合而成，其中：

一、浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角采后病害的生防作用：

1、浅白隐球酵母菌悬液的制备

将浅白隐球酵母菌种子液接于50mL的YPD培养基中(接种量为2％)，28℃、200r/min摇瓶培养36h，得到浅白隐球酵母菌发酵液后于5000r/min下离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水(0.9％)调配成试验所需浓度的浅白隐球酵母菌悬液，备用。

2、病原菌的分离及菌悬液的制备

将从自然发病的油豆角上分离得到的灰葡萄孢菌多次转接纯化后，26℃培养10d，在培养皿中加入2mL无菌水，用无菌刀片将培养好的孢子和菌体轻轻刮下，用无菌水冲洗菌体，震荡充分后用四层纱布过滤掉菌丝得到病原孢子悬浮液，然后调配到试验所需浓度。

3、对病原菌的拮抗试验

(1)滤纸片法：在PDA平板上距离中点等距离处，一侧放置直径为5mm的灰葡萄孢菌菌饼，一侧放置直径为1mm的滤纸片，在滤纸片上滴加15μL的1×10⁸的浅白隐球酵母菌悬液。25℃培养7d，以接种灰葡萄孢菌和无菌水的平板为对照，观察灰葡萄孢菌的生长情况，每组处理3次重复。

(2)涂布法：取100μL的1×10⁸cfu/mL的浅白隐球酵母菌悬液接于PDA固体培养基上，用涂布棒均匀涂开，待晾干后将一块直径为5mm大小的圆形灰霉菌菌饼接种于培养基上，25℃静置培养7d，以涂布无菌水和接种灰葡萄孢菌的PDA固体培养基为对照，观察灰葡萄孢菌的生长情况，每组处理3次重复。

4、浅白隐球酵母菌悬液对病原菌菌丝的抑制

在50mLPDB培养基中接入一块直径5mm的灰霉菌菌饼，然后将浅白隐球酵母菌悬液以2％(V:V)的接种量分别接入，25℃下200r/min摇瓶培养7d，将不接种酵母菌作为对照，记录灰霉菌菌丝生长情况，用纱布过滤得到菌丝后烘干称重，测定浅白隐球酵母菌对灰霉菌丝生长的抑制程度，每个处理3次重复。

二、浅白隐球酵母菌对油豆角病害的防治效果

挑选颜色大小一致、无机械损伤及病害的油豆角，在豆荚上用无菌刀片等距离划5mm(宽)12mm(深)的伤口，用浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角进行处理，其中酵母菌浓度为1×10⁸cfu/mL。

将处理后的油豆角自然晾干，12h后接种孢子浓度为1×10⁶cfu/mL的灰葡萄孢菌，然后套袋保持90％的湿度，室温下贮存，从第二天起对豆荚的发病情况进行记录观察，每三天统计一次。试验重复三次。

油豆角病情级数：0级，果实不发病；

1级，发病面积小于果实面积的10％；

2级，发病面积占果实面积的10％～30％；

3级，发病面积大于果实面积的30％。

病情指数＝100×Σ(每级发病果实数量×对应级数)/(调查总数×最高发病级数)

防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％

三、浅白隐球酵母菌在油豆角伤表面的生长动态

将油豆角用2％次氯酸钠溶液处理3min，无菌水冲洗后自然晾干。用1×10⁸cfu/mL的浅白隐球酵母菌悬液均匀喷施到豆荚表面，取出后晾干，套袋以保持一定的相对湿度，室温下贮藏，以接种1h后测定的酵母菌数为起始值(0h)，每12h对酵母菌数量进行一次测定，测定96h内菌量动态。豆荚表面酵母菌数量的测定方法为：将处理过的油豆角用500mL无菌水浸泡后，超声波清洗5min，然后涂布法和镜检测定清洗液中浅白隐球酵母菌数量。试验重复3次。

四、采后油豆角的贮藏试验

挑选大小一致，无病害和机械损伤的油豆角，购回后即处理进行采后果实贮藏试验。将油豆角用1×10⁸cfu/mL的浅白隐球酵母菌保鲜剂均匀喷施到豆荚表面，取出后自然晾干，利用保鲜膜和套袋的方式保持90％的相对湿度并贮藏于室温。以不处理的油豆角作为对照组，以12d为贮藏周期，每隔3d对不同处理组的油豆角的腐烂情况进行观察，并测定果实的各项品质指标(参照果蔬采后生理生化实验指导，稍作改动)，试验重复3次。

1、采用称重的方法侧定。从贮藏开始测定油豆角的失重情况，每隔3d测一次。

失重率＝(果实原始重量－测量时重量)/原始重量×100％。

2、腐烂率

将果实腐烂面积大小划分为4级：

0级，无腐烂；

1级，腐烂面积小于果实面积的20％；

2级，腐烂面积占果实面积的20％～50％；

3级，腐烂面积大于果实面积的50％～70％。

下式计算腐烂指数：

腐烂率＝Σ(腐烂级别×该级豆荚个数)/(最高腐烂级别×总豆荚个数)×100％

3、锈斑指数，按豆角表面锈斑的发生程度分为0～3级：

0级—无锈斑；

1级—锈斑较少，具有商品价值；

2级—锈斑较多，没有商品价值；

3级—锈斑严重，失去食用品质。

锈斑指数＝Σ(锈斑级别×级别样品数量)/(最高级别×样品总数量)×100

4、叶绿素含量

称取0.5g样品剪碎，加入1mL蒸馏水，加入少量碳酸钙研磨后加入无水乙醇和丙酮按1:2(V:V)组成的提取液10mL，避光浸提3h至残渣变白，按试剂盒说明书进行操作。

5、抗坏血酸含量

适量称取油豆角样品，分别加少量1％草酸用研钵磨成浆，纱布过滤，将滤液转到50mL容量瓶后用2％草酸定容。取1.0mL标准抗坏血酸溶液(0.1mg/mL)，加入9.0mL草酸溶液(1％浓度)，用微量滴定管以0.1％的2，6-二氯酚靛酚滴定呈淡红色，15s内不褪色即为终点。由所用染料的体积计算出T值(平均值)，即1mL染料相当于多少mg的Vc。准确吸取10.0mL已制备的样品滤液各两份于两个50mL锥形瓶内，滴定方法同前。

抗坏血酸含量：m＝VT/m₀×100

式中m：100g样品中含Vc的质量(mg)；

V：滴定时所用去染料体积(mL)；

T：每毫升染料能氧化Vc质量数(mg/mL)；

m₀：10mL样液含样品之质量数(g)。

6、可溶性蛋白

称取样本0.5g，按重量(g)：体积(mL)＝1:9加入生理盐水研磨，冰水浴匀浆，2500r/min离心10min，取上清，1:4加入生理盐水稀释，按试剂盒说明书进行测定。

7、丙二醛含量

称取样本0.5g，按重量(g)：体积(mL)＝1:9加入生理盐水，冰水浴制备成10％的组织匀浆，采用试剂盒测定MDA含量。

8、超氧化物歧化酶(SOD)活性

按重量(g)：体积(mL)＝1:4加入生理盐水，制备成20％的组织匀浆，3500r/min离心10min，取上清按试剂盒说明书进行测定。

9、过氧化氢酶(CAT)活性

称取油豆角样本0.5g，加入生理盐水，重量(g)：体积(mL)＝1:9，冰水浴制备成10％的匀浆，2500r/min离心10min，取上清，再按1：4加入生理盐水稀释，按试剂盒说明书进行操作。

10、苯丙氨酸解氨酶(PAL)

按重量(g)：体积(mL)＝1:9加入提取液，冰水浴匀浆，10000r/min，离心10min，按试剂盒说明书进行操作。

五、结果与分析

1、浅白隐球酵母菌对油豆角采后病害的生防作用

(1)对峙试验

平板对峙试验滤纸片法结果表明，浅白隐球酵母菌对灰葡萄孢菌无明显地抑菌圈产生，但与对照相比灰霉菌菌丝的生长没有覆盖过滤纸片，说明浅白隐球酵母菌的抑菌机理并不是直接产生强有效的杀菌物质来对病原菌进行抑制。而涂布法抑制试验中，涂布接种过浅白隐球酵母菌的平板中，灰葡萄孢菌的生长得到明显地抑制，仅可见极少量的菌丝，但浅白隐球酵母菌生长良好，说明浅白隐球酵母菌可以有效地利用营养和空间进行繁殖。滤纸片法及涂布法平板对峙结果如图1所示。

(2)浅白隐球酵母菌对油豆角采后病原菌菌丝生长的影响

浅白隐球酵母菌与灰葡萄孢菌在25℃共生培养七天后，菌丝抑制效果见图2。菌丝烘干称重后发现，浅白隐球酵母菌对灰葡萄孢菌丝抑制率达到94.74％。

(3)不同处理对油豆角采后病害果实的防治效果

浅白隐球酵母菌对病原菌在豆荚上的生长产生了抑制，病情指数为24.77，防治效果达到65.66％。这主要是由于浅白隐球酵母菌在果实表面有很好的附着能力，并且浅白隐球酵母菌繁殖速度快于病原菌，能够抢先占据果实表面的营养及繁殖空间，在果实伤口处形成一层干燥的菌膜，以此来限制病原菌的生长和繁殖。

(4)浅白隐球酵母菌在豆荚上的生长动态

图3为浅白隐球酵母菌群落在在豆荚上的动态变化，结果表明浅白隐球酵母菌能够在油豆角表面定殖，且有增长的过程，在36～48h达最大值，在48h之后菌量略有所下降，但菌落数量在调查时间内较为稳定。

2、采后油豆角的贮藏试验

(1)对油豆角贮藏品质的影响

a、对油豆角贮藏期间腐烂和锈斑的影响

浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理过的油豆角相比于对照的腐烂和锈斑的情况有所减轻，浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理过的油豆角腐烂率和锈斑指数分别为25.35％和20.44％，明显低于对照(P<0.05)，分别为对照的49.58％和54.12％。

b、对油豆角贮藏期间水分的影响

贮藏期间果实的蒸腾作用和呼吸作用，均会使自身的水分大量的损耗，是油豆角贮藏期间重量降低的主要原因。由图4可知，贮藏6d天时浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理的失重率为6.04％，是对照的53.8％。贮藏第9d时，浅白隐球酵母菌+抗坏血酸失重率为16.9％，是对照的66％，均显著低于对照(P<0.05)，且可降低油豆角水分的散失。

c、对油豆角维生素C含量的影响

由图5可知，浅白隐球酵母菌+抗坏血酸中维生素C的含量随贮藏天数的增加而逐渐降低。贮藏的前三天维生素C含量有所下降，但与对照间差异不大，从第3d到第6d对照处理的维生素含量下降较快，延缓了油豆角在贮藏期维生素C的流失。贮藏9d后的结果表明，维生素C含量与对照有显著差异。

d、对油豆角叶绿素含量的影响

油豆角贮藏期间叶绿素含量变化如图6所示，整个贮藏期内呈现降低的趋势，且从贮藏第3d以后，下降速率加快。3～6天浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理的叶绿素含量的降低率均小于对照，说明浅白隐球酵母菌+抗坏血酸能不同程度的缓解豆荚黄化，其中浅白隐球酵母菌+抗坏血酸比初始含量减少了30.5％，在贮藏期间保持着较高水平，与对照差异显著(p<0.05)。

e、对油豆角可溶性蛋白含量的影响

图7表明，贮藏期间浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理过的油豆角可溶性蛋白含量的变化。贮藏前期可溶性蛋白含量略有下降，随着贮藏时间的延长，贮藏中期呈现增长的趋势其含量迅速上升，在贮藏末期迅速下降。贮藏第9d下降幅度为21.8％。贮藏过程中可溶性蛋白含量的增加，可能与贮藏过程中防御酶含量的变化有关，而贮藏末期可溶性蛋白含量迅速降低，是由于随着果实组织的衰老，与各防御酶的降解有关，可溶性蛋白的迅速降低预示着油豆角品质发生了质的改变，贮藏价值逐渐失去。

(2)对油豆角贮藏期间MDA含量的影响

MDA是细胞膜化或脂质化的产物。植物在受到胁迫或是在衰老过程中，体内自由基的产生和清除机制遭到破坏，自由基的产生会对细胞膜产生伤害，使其逐级降解为MDA，因此MDA含量可反应植物衰老程度。图8为贮藏期浅白隐球酵母菌保鲜剂处理MDA含量的变化，贮藏前期MDA含量的变化差别不大，贮藏第9d天，MDA含量低于对照。

(3)对油豆角贮藏期间SOD活性的影响

从图9可以看出，随着贮藏时间的延长，SOD酶活性随呈现先升高后降低的趋势。贮藏前期浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理的SOD酶活性有所提高，贮藏第6天浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理的SOD酶活性高于对照，说明浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理对贮藏期间SOD酶活性起到一定的促进作用。而对照组的SOD活性在贮藏末期略有所升高，则与贮藏末期病原菌的侵染有关。

(4)对油豆角贮藏期间PAL活性的影响

图10为浅白隐球酵母菌保鲜剂对油豆角贮藏期PAL活性的影响。从图中可以得知，浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理可在贮藏前期使油豆角的PAL活性值增大，这主要与浅白隐球酵母菌诱导果实抗性有关。浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理在贮藏末期仍保持较高的PAL活性，与对照差异显著(P<0.05)。

(5)对油豆角贮藏期间CAT活性的影响

贮藏期间浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理对油豆角CAT活性产生了影响。贮藏前6天，CAT活性不断上升，在第6天达到峰值，而对照在第9天时达到峰值，说明浅白隐球酵母菌+抗坏血酸处理可不同程度在贮藏前期对油豆角CAT活性产生促进作用。