阅读说明：本技术 基于茶多酚加合脱氧糖酮抑制Amadori重排产物降解的机制提高其产率的方法 (Method for improving yield of Amadori rearrangement product based on mechanism of inhibiting degradation of Amadori rearrangement product by tea polyphenol adducted deoxyfuranone ) 是由 张晓鸣 于莙禾 崔和平 詹欢 翟昀 于静洋 夏书芹 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于茶多酚加合脱氧糖酮抑制Amadori重排产物(ARP)降解的机制提高其产率的方法,其具体方法为：取氨基酸、糖和茶多酚加水溶解,调节混合溶液pH；将所得混合液置于反应瓶中,并在恒定水浴温度下加热得到反应液；将所得反应液在恒定温度下进行真空减压脱水反应,反应结束后使用冰浴冷却终止反应,得到固体反应物,用水复溶得到ARP溶液；本发明基于茶多酚通过捕获ARP的初级降解产物即脱氧糖酮化合物与真空减压脱水的协同作用,促进了ARP的形成并抑制其降解,从而使得ARP大量累积富集。本发明中所述方法操作简单、绿色、反应时间短,条件温和,所得ARP产率可达80％以上,具有较强的创新性和显著的进步性。(The invention discloses a method for improving the yield of an Amadori Rearrangement Product (ARP) based on a mechanism that tea polyphenol adducted deoxyfuranone inhibits the degradation of the Amadori rearrangement product, which comprises the following steps: dissolving amino acids, sugar and tea polyphenols in water, and adjusting pH of the mixed solution; placing the obtained mixed solution into a reaction bottle, and heating at a constant water bath temperature to obtain a reaction solution; carrying out vacuum reduced pressure dehydration reaction on the obtained reaction solution at a constant temperature, cooling by using an ice bath after the reaction is finished to terminate the reaction to obtain a solid reactant, and re-dissolving the solid reactant by using water to obtain an ARP solution; the invention promotes the formation of ARP and inhibits the degradation of the ARP based on the synergistic effect of capturing the primary degradation product of ARP, namely the deoxysugar ketone compound and vacuum decompression dehydration, thereby accumulating and enriching the ARP in a large quantity. The method disclosed by the invention is simple and green to operate, short in reaction time, mild in condition, high in ARP yield of more than 80%, strong in innovation and remarkable in progress.)

基于茶多酚加合脱氧糖酮抑制Amadori重排产物降解的机制 提高其产率的方法

技术领域

本发明属于食品化学和食品添加剂领域，尤其是涉及基于茶多酚加合脱氧糖酮抑制Amadori重排产物降解的机制提高其产率的方法。

背景技术

Amadori重排产物，Amadori rearrangement product(ARP)，作为早期美拉德反应过程中一种重要的中间产物已被广泛研究，它是由醛糖羰基和氨基之间进行加成并失去一分子水形成的席夫碱(Shiff base)再经环化形成相应的N-取代的醛糖基胺，再经Amadori重排转变成有反应活性的1-氨基-1-脱氧-2-酮糖。在食品加工或储存过程中，它们对风味和颜色的形成起着重要的作用。目前我国咸味调味品常用配料是完全美拉德反应产物(MRP)，虽然风味浓郁，但大多挥发性强，特别在烹饪、烘焙等高温加工条件下，难以维持稳定增香效果，香气损失与香味不持久问题突出，应用受到很大限制。而ARP常温下具有较稳定的理化性质、加热条件下保留较高的反应活性，极易完成后续美拉德反应，产生挥发性风味物质。因此，ARP可作为一种“活性风味前体”，通过制备此类适宜的风味前体，可对食品加工过程中的理想的感官属性实现可控形成。

然而，这种活性风味前体在水相中的产率通常不超过5％，使得这一风味前体很难商业化生产。目前，对于ARP产率的提高已有一定的研究，如在无水甲醇等有机溶剂中合成，这些化学方法不仅存在高生理毒性且污染环境，生产成本较高，仅适用于理论研究，无法满足大规模生产需要。此外，利用亚硫酸钠也具有提高ARP产率的效果，然而此类化学添加剂会在食品中残留亚硫酸盐。最近研究表明，亚硫酸盐可对染色体及DNA造成损伤，还能够引起人血淋巴细胞姊妹染色单体互换(SCE)和微核(MN)率的增加，可使淋巴细胞有丝***周期延迟及细胞***指数下降，且这些作用有显著的剂量-效应关系。因此，亚硫酸盐的添加不仅存在摄入过量的风险，还存在很大的食品安全问题。随着人们对食品中化学物质添加的抵触和排斥，对天然健康食品的迫切需求。研究如何采用天然、绿色、无合成物潜在毒副作用的新技术方法来提高ARP产率，突破其水相产率低的技术壁垒，对于实现ARP这种活性风味前体的大规模工业化生产具有重要意义。

发明内容

本申请针对现有技术的不足，本发明提供了基于茶多酚加合脱氧糖酮抑制Amadori重排产物降解的机制提高其产率的方法。本发明操作简便，条件温和，制备得到产物产率高。

本发明的技术方案如下：

基于茶多酚加合脱氧糖酮抑制Amadori重排产物降解并提高其产率的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取氨基酸、糖和茶多酚加水溶解，调节混合溶液pH；

(2)将步骤(1)中所得混合液置于反应瓶中，并在恒定水浴温度下加热得到反应液；

(3)将步骤(2)得到的反应液在恒定温度下进行真空减压脱水反应，反应结束后使用冰浴冷却终止反应，得到固体反应物，用水复溶得到ARP溶液。

步骤(1)中所述茶多酚包括表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、儿茶素(C)，没食子儿茶素(GC)、儿茶素没食子酸酯(CG)或没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)中的至少一种。

步骤(1)中所述氨基酸为丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、蛋氨酸中的一种或多种。

步骤(1)中所述糖为核糖、木糖、***糖、葡萄糖中的一种或多种。

步骤(1)中所述氨基酸、糖与茶多酚的用量配分别为：氨基酸10份，糖5-50份，茶多酚为0.1～5份，水200-1200份，按质量份数计算。

步骤(1)中所述混合溶液的pH值为6～9。

步骤(2)中所述恒定水浴温度为60～90℃，加热时间为30～100min。

步骤(3)中所述恒定反应温度为60～90℃，反应时间为5～60min；冰浴条件为：冰浴温度保持为0℃。

步骤(3)中所述ARP溶液中ARP产率可达80％以上。

本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明在羰氨反应中添加茶多酚提高ARP产率的机制原因主要由以下三个方面的协同作用：

①茶多酚抑制ARP降解的机制

茶多酚中主要成份儿茶素类化合物的A环上的活性位点C6和C8可捕获ARP的初级降解产物即脱氧糖酮化合物(Deoxyosones)，形成低反应活性的酚-糖加合物，从而阻断了ARP的下游反应路径，抑制了ARP的降解。如图14为糖/氨基酸体系中添加茶多酚EGCG热反应后的总离子色谱图。由图14可知，茶多酚与脱氧酮糖DP可形成双加合物di-DP-EGCG(a)、单加合物momo-DP-EGCG(d/e)，从而阻断了美拉德下游反应路径，抑制了ARP的降解，其捕获机制如图15，这是提高ARP产率的重要基础。

②真空减压脱水作用促进ARP前体物质席夫碱向ARP的转化

真空减压脱水过程可以通过促进ARP的前体物质席夫碱(Shiff base)的形成，从而提高ARP的转化速率。如图11所示，在无茶多酚EGCG添加的体系中，真空减压脱水所得ARP产率为42.1％，相对于常压水相所得ARP产率2.2％，产率提高了19倍，证实了真空减压脱水过程可以促进ARP的形成。

③两者的协同作用

在添加茶多酚后，真空减压脱水过程促进ARP前体席夫碱向ARP转化的同时，茶多酚的加入又抑制了ARP的降解，从而使得ARP在很短的时间内累积富集，这种协同作用使得ARP转化率得到显著提高。如图1，ARP产率可提高到94.8％，相对于真空减压所得ARP产率42.1％(图11)，产率提高了225.2％。该过程中ARP形成动力学模型如图16所示，途径A为无茶多酚添加时ARP在真空减压脱水过程中的动力学参数，途径B为添加茶多酚后ARP在真空减压脱水过程中动力学参数。同时，相比无茶多酚添加的体系其ARP形成的活化能Ea₂＝70.88kJ/mol＜Ea₂′＝60.35kJ/mol，这可能是由于茶多酚与ARP形成ARP-儿茶素(图15)类不稳定的中间物质从而降低了糖/氨基酸向ARP转换的活化能，如图14中检测到的ARP加合物ARP-EGCG(b/c)。因此，根据催化动力学原理可知，茶多酚在一定程度上催化了ARP的形成。通过动力学模拟，经计算可知ARP生成速率速率k₂′＞k₂，降解速率k₄′＜k₄，证明了茶多酚的加入促进了ARP的形成并同时抑制了其降解。

(2)现有技术中，因ARP水相产率很低，多在有机相中制备合成，该技术方法存在生理毒性、环境污染、操作复杂，不仅无法获得食品级产品，对于工业化生产也较难实行。而本发明所述利用茶多酚提高ARP的产率的方法，食品级合成、操作简便、绿色无污染、成本低廉，易于工业化生产，且通过该技术获得的ARP完全可以直接应用于食品配料或调味制品中。

(3)本发明所利用的茶多酚是从茶叶中提取的具有较强抗氧化的全天然食品添加剂，并且具有抑菌作用和很强的生理活性，包括抗癌、抗突变、清除体内自由基等。茶多酚在应用过程中表现出抗氧化能力强、无异味、无合成物的潜在毒副作用等特点，对于开发功能性的半成品食品调味料(活性风味前体ARP)具有重要意义。因此，本发明利用茶多酚促进ARP形成并抑制其降解的技术，不仅显著提高了ARP的产率，同时也增加了其所应用食品的功能活性及货架期。

(4)本发明所述的利用茶多酚提高水相ARP产率技术，不仅克服了水相ARP产率低的障碍，且选用的天然助剂茶多酚，原料天然易得，相对于有机相法和基团保护法所利用的加工助剂，该法大大降低了生产的会计成本、安全成本以及环境成本。

(5)本发明所采用的制备工艺，操作简便，设备简易，并在温和温度下进行反应，制备时间短，产率高。其工艺技术满足绿色、科学、可持续的工业设计理念，而且具有较高的食用安全性。因此，该技术可直接应用于实际生产，具有较强的实际应用价值。

附图说明

图1为实施例1添加EGCG水相体系中丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP溶液色谱图；

图2为实施例1中纯化后的丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP经LC/MS/MS定性得到图(a)总离子色谱图，图(b)总离子质谱图；

图3为实施例1中制备的丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP核磁共振氢谱图；

图4为实施例1中制备的丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP核磁共振碳谱图；

图5为实施例2中添加EGCG水相体系中苯丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP溶液色谱图；

图6为实施例2中纯化后的苯丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP经LC/MS/MS定性得到图(a)总离子色谱图，图(b)总离子质谱图；

图7为实施例2中制备的苯丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP核磁共振氢谱图；

图8为实施例2中制备的苯丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP核磁共振碳谱图；

图9为实施例3中添加EGCG水相体系中丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP溶液色谱图；

图10为比较例1中无EGCG添加的常压水相体系中丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP溶液色谱图；

图11为比较例2中无EGCG添加真空减压水相体系中丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP溶液色谱图；

图12为比较例3中无水甲醇体系中丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP溶液色谱图；

图13为比较例4中无EGCG添加水相体系中苯丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP溶液色谱图；

图14为茶多酚EGCG(f)与ARP加合物：ARP-EGCG(b/c)及其降解产物DP的加合物：双加合物di-DP-EGCG(a)、单加合物momo-DP-EGCG(d/e)总离子色谱图；

图15茶多酚对ARP降解产物的捕获效应机制；

图16茶多酚促进ARP形成并抑制其降解的动力学机制。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

(1)取丙氨酸8.90kg、木糖32.00kg和EGCG 0.5kg，加500kg水溶解，调节混合溶液pH7.5；

(2)将混合液置于常压的热反应瓶中，在90℃水浴温度下加热60min得到反应液；

(3)将步骤(2)得到的反应液转移至烧瓶中，在90℃恒定温度下进行真空减压脱水反应10min后，冰浴冷却终止反应，得到固体反应物，用水复溶得到ARP溶液；

将所得ARP溶液通过高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)对其进行分析，采用Amide色谱柱(3.5μm,4.6mm×150mm,Waters,USA)对其进行分离鉴定，得到液相色谱图1，从图中可知丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP保留时间为17min。采用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对所转化的产物进行初步结构鉴定，得到总离子色谱质谱图2，经MS/MS鉴定其分子量为MW＝221，因此初步确认转化产物为目标物丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP，分子式为C₈H₁₅NO₆。经核磁共振进一步定性分析，得到核磁共振图谱如图3和图4所示。由核磁共振¹H谱(图3)和¹³C谱(图4)可以确定该产物为丙氨酸与木糖反应得到的ARP。经过计算得ARP产率可达94.8％。

实施例2

(1)取苯丙氨酸8.26kg、木糖15.00kg和EGCG 0.1kg，加500kg水溶解，调节混合溶液pH8.0；

(2)将混合液置于常压的热反应瓶中，在90℃水浴温度下加热60min得到反应液；

(3)将步骤(2)得到的反应液转移至烧瓶中，在90℃恒定温度下进行真空减压脱水反应20min后，冰浴冷却终止反应，得到固体反应物，用水复溶得到ARP溶液；

将所得ARP溶液通过高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)对其进行分析，采用Xselect CSH^TM C18色谱柱(3.5μm,4.6mm×150mm,Waters,USA)对其进行分离鉴定，得到液相色谱图5，从图中可知丙氨酸/木糖制备得到的ARP保留时间为8min。采用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对所转化的产物进行初步结构鉴定，得到总离子色谱质谱图6，经MS/MS鉴定其分子量为MW＝297，因此初步确认转化产物为目标物苯丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP，分子式为C₁₄H₁₉NO₆。经核磁共振进一步定性分析，得到核磁共振图谱如图7和图8所示。由核磁共振¹H谱(图7)和¹³C谱(图8)可以确定该产物为苯丙氨酸与木糖反应得到的ARP。经过计算得苯丙氨酸/木糖ARP产率可达80.3％。

实施例3

(1)取丙氨酸8.90kg、木糖32.00kg和EGCG 0.1kg，加500kg水溶解，调节混合溶液pH7.5；

(2)将混合液置于常压的热反应瓶中，在90℃水浴温度下加热60min得到反应液；

(3)将步骤(2)得到的反应液转移至烧瓶中，在90℃恒定温度下进行真空减压脱水反应10min后，冰浴冷却终止反应，得到固体反应物，用水复溶得到ARP溶液；

将所得ARP溶液通过高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)对其进行分析，采用Amide色谱柱(3.5μm,4.6mm×150mm,Waters,USA)对其进行分离鉴定，得到液相色谱图9，从图中可知丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP保留时间为17min。采用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对所转化的产物进行初步结构鉴定，得到总离子色谱质谱图2，经MS/MS鉴定其分子量为MW＝221，因此初步确认转化产物为目标物丙氨酸/木糖ARP，分子式为C₈H₁₅NO₆。经核磁共振进一步定性分析，得到核磁共振图谱如图3和图4所示。由核磁共振¹H谱(图3)和¹³C谱(图4)可以确定该产物为丙氨酸与木糖反应得到的ARP。经过计算得ARP产率可达85.6％。

实施例4

(1)取丝氨酸10kg、核糖50kg和儿茶素没食子酸酯(CG)0.3kg，加900kg水溶解，调节混合溶液pH6.0；

(2)将混合液置于常压的热反应瓶中，在60℃水浴温度下加热5min得到反应液；

(3)将步骤(2)得到的反应液转移至烧瓶中，在60℃恒定温度下进行真空减压脱水反应60min后，冰浴冷却终止反应，得到固体反应物，用水复溶得到ARP溶液；

将所得ARP溶液经高效液相色谱分析计算得ARP产率可达89.5％。

实施例5

(1)取蛋氨酸1kg、***糖0.6kg和儿茶素没食子酸酯(CG)0.05kg，加100kg水溶解，调节混合溶液pH7.0；

(2)将混合液置于常压的热反应瓶中，在70℃水浴温度下加热60min得到反应液；

(3)将步骤(2)得到的反应液转移至烧瓶中，在60℃恒定温度下进行真空减压脱水反应40min后，冰浴冷却终止反应，得到固体反应物，用水复溶得到混合溶液；

将所得ARP溶液经高效液相色谱分析计算得ARP产率可达83.5％。

比较例1

(1)取丙氨酸8.90kg、木糖32.00kg，加500kg水溶解，调节混合溶液pH7.5；

(2)将混合液置于常压的热反应瓶中，在90℃水浴温度下加热60min得到反应液；

反应液经高效液相色谱分析，结果如图10所示。由图10可知，该比较例经丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP保留时间为20min，其产率为2.2％。

比较例2

(1)取丙氨酸8.90kg、木糖32.00kg，加500kg水溶解，调节混合溶液pH7.5；

(2)将混合液置于常压的热反应瓶中，在90℃水浴温度下加热60min得到反应液；

(3)将步骤(2)得到的反应液转移至烧瓶中，在90℃恒定温度下进行真空减压脱水反应10min后，冰浴冷却终止反应，得到固体反应物，用水复溶得到ARP溶液。

将所得的ARP溶液经高效液相色谱分析，结果如图11所示。由图11可知，在无EGCG添加的丙氨酸/木糖体系，丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP保留时间为17min，ARP的产率为42.1％，远高于比较例1中常压水相反应中产率2.2％，说明了在无茶多酚存在时，即无脱氧酮糖捕获效应的条件下，单纯的真空减压脱水作用对ARP形成的具有一定的促进作用，该结果证实了本发明所公开的技术中减压真空脱水的重要性。实施例1中所得到的ARP产率(94.8％)与比较例1比，提高了43倍；与比较例2相比，提高了225.2％，证实了本发明中茶多酚在ARP水相制备过程中的重要性，体现了该发明的技术进步性。

比较例3

取丙氨酸8.90kg、木糖32.00kg，加500kg无水甲醇溶解，在60℃水浴温度下回流加热6小时后，取反应液通过高效液相色谱分析，分析方法如实施例1，得到有机相中制备的丙氨酸/木糖ARP色谱图，结果如图12所示。该比较例下丙氨酸/木糖反应制备得到的ARP保留时间为18min，ARP的产率为35.8％。由色谱图12可知，在有机试剂无水甲醇中制备的ARP杂峰较多，证明该反应体系的副产物较多。实施例1中添加EGCG的丙氨酸/木糖体系水相制备的ARP产率(94.8％)与该比较例相比，产率提高了264.8％。证实了本发明中的技术方法相对于传统有机试剂法可以显著提高ARP产率，体现了该发明的技术进步性。

比较例4

(1)取苯丙氨酸8.26kg、木糖15.00kg，加500kg水溶解，调节混合溶液pH8.0；

(2)将混合液置于常压的热反应瓶中，在90℃水浴温度下加热60min得到反应液；

(3)将步骤(2)得到的反应液转移至烧型瓶中，在90℃恒定温度下进行真空减压脱水反应20min后，冰浴冷却终止反应，得到固体反应物，用水复溶得到ARP溶液。

ARP溶液经高效液相色谱分析结果如图13所示。由图13可知，在无EGCG添加的苯丙氨酸/木糖体系，苯丙氨酸/木糖ARP保留时间为9min，ARP的产率为35.6％。实施例2中添加EGCG的苯丙氨酸/木糖体系ARP产率(82.3％)与该比较例相比，产率提高了231.2％。证实了本发明中茶多酚在ARP水相制备过程中的重要性，体现了该发明的技术进步性。

上述实施例和比较例中的实验用水为蒸馏水，糖和氨基酸均为食品级，高效液相色谱分析实验所用化学试剂为色谱纯，其余化学试剂均为分析纯。高效液相色谱检测条件为：流动相为乙腈与水，流速为0.6mL/min，采用梯度洗脱，柱温为35℃。质谱分析的条件如下：采用ESI+模式，检测器电压1.8kV，毛细管电压3.5kV，锥孔电压20V，提取电压7V。电子源温度和脱溶剂气温度分别为100℃和400℃，气流量700L/h，锥孔气体流量50L/h。在m/z 20～1000的质合比范围内对样品进行扫描，扫描时间为1s，扫描时间延迟0.1s。将分离得到的纯品中间体溶解在D₂O中，采用核磁共振仪对中间体进行分析，测试温度为298K。将分离得到的纯品中间体溶解在D₂O中，采用核磁共振仪对中间体进行分析，测试温度为298K。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的范围之内。