阅读说明：本技术 一种芳姜黄酮对照品的制备方法 (Preparation method of arylturmerone reference substance ) 是由 蔡锦镇 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种芳姜黄酮对照品的制备方法,以姜黄为原料,粉碎成平均粒径≤10μm的姜黄粉末,先利用正戊烷-乙醇混合液提取得到提取物Ⅰ,然后将提取物Ⅰ利用异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液萃取获得提取物Ⅱ,最后利用异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂对提取物Ⅱ进行硅胶柱层析分离,即可高产率获得高纯度的一种芳姜黄酮对照品,原料成本低,也不需要高效液相色谱进行进一步的分离纯化,适合工业化生产。(The invention provides a preparation method of an aromacrone reference substance, which takes turmeric as a raw material, the turmeric is crushed into turmeric powder with the average grain diameter less than or equal to 10 mu m, n-pentane-ethanol mixed liquor is firstly used for extracting to obtain an extract I, then the extract I is extracted by isopropyl ether-butyl acetate-ethyl acetate-water mixed liquor to obtain an extract II, and finally the isopropyl ether-butyl acetate mixed liquor is used as an eluent to carry out silica gel column chromatography separation on the extract II, so that the high-purity aromacrone reference substance can be obtained at high yield.)

一种芳姜黄酮对照品的制备方法

技术领域

本发明涉及天然产物提取分离技术领域，特别是涉及一种芳姜黄酮对照品的制备方法。

背景技术

姜黄是我国传统中药，根茎中主要含有挥发油和姜黄素类成分，此外还有树脂类、糖类、甾醇类、脂肪酸、多肽类等，据文献报道，在中药姜黄中发现数十种挥发油成分，包括：龙脑、樟脑、松油醇、姜黄烯、芳姜黄酮、姜黄酮、水芹烯等。

其中，芳姜黄酮属于萜烯类化合物，是姜黄的重要成分之一，在临床开发治疗白血病、恶性淋巴肿瘤、细菌炎症、真菌炎症、糖尿病、肥胖等代谢综合性疾病及节育等方面都有广阔前景。

对照品是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检仪器性能的标准物质，在药品检验中，是确定药品真伪优劣的对照，是控制药品质量必不可少的工具，因此，研究开发芳姜黄酮对照品的制备方法显得非常重要。

专利CN104478686B公开了姜黄挥发油中芳姜黄酮对照品的制备方法，是以姜黄挥发油为原料，先进行加压正相硅胶柱粗分离，然后进行加压正相硅胶柱细分离，最后经高效液相色谱分离获得纯度99.95%的芳姜黄酮对照品。但是，该制备方法的芳姜黄酮产率很低，另外，以姜黄挥发油为原料，一方面原料成本高，另一方面在姜黄挥发油的制备过程中可能已经损耗了一部分芳姜黄酮，故该专利的制备方法整体来说不适合工业化生产。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种芳姜黄酮对照品的制备方法，以姜黄为原料，成本低，产品产率和纯度高，适合工业化生产。

为实现上述目的，本发明是通过如下方案实现的：

一种芳姜黄酮对照品的制备方法，包括步骤：

（1）先将姜黄粉碎制成姜黄粉末，然后利用体积比1：2～3的正戊烷-乙醇混合液提取得到提取物Ⅰ；

（2）然后将提取物Ⅰ加入体积比1：8～10：5～8：6～9的异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液中，充分振荡均匀，萃取，取有机相，减压浓缩，得到提取物Ⅱ；

（3）接着利用体积比1：0.2～0.3的异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂，对提取物Ⅱ进行硅胶柱层析分离，所得洗脱液旋蒸，干燥，即得所述的一种芳姜黄酮对照品；

其中，步骤（1）中姜黄粉末的制备方法为：先将姜黄经机械粉碎制成粒径≤5mm的粗粉，然后将粗粉倒入5～8倍重量的去离子水中，超声波振荡30～40分钟，经胶磨机研磨处理0.5～1小时后迅速转移至真空冷冻干燥机中，温度降至-40～-50℃，然后抽真空至15～20Pa，接着温度升至20～30℃，继续在当前的真空度条件下处理7～8小时，得到中粉；最后利用超微粉碎机对中粉进行超微粉碎，得到平均粒径≤10μm的姜黄粉末。

优选的，姜黄在粉碎处理前先进行除杂、水洗、阴干处理，阴干时间进一步优选为2～3天。

优选的，机械粉碎选自鄂式粉碎、圆锥粉碎、辊式粉碎、锤式粉碎或反击式粉碎中的任一种或几种。

优选的，胶磨机研磨处理时物料温度控制在20～25℃。

优选的，利用超微粉碎机进行超微粉碎，进一步优选为气流粉碎机，其工作条件为：气流压力为1000kPa，进料速度为200r/min，分级频率为35Hz，粉碎时间为60～80分钟。

优选的，步骤（1）中，姜黄粉末与正戊烷-乙醇混合液的质量体积比为1g：6～9mL。

优选的，步骤（1）中提取的具体方法是：回流提取2～3小时，重复提取2～3次，过滤，合并滤液，减压除去溶剂，即得提取物Ⅰ；每次提取时，固液质量比为1：5～8。

优选的，步骤（2）中，提取物Ⅰ与异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液的质量体积比为1g：6～9mL。

优选的，步骤（3）中，采用100～200目硅胶柱层析分离，过柱流速为0.5～0.8mL/min。

本发明的有益效果是：

本发明以姜黄为原料，粉碎成平均粒径≤10μm的姜黄粉末，先利用正戊烷-乙醇混合液提取得到提取物Ⅰ，然后将提取物Ⅰ利用异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液萃取获得提取物Ⅱ，最后利用异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂对提取物Ⅱ进行硅胶柱层析分离，即可高产率获得高纯度的一种芳姜黄酮对照品，原料成本低，也不需要高效液相色谱进行进一步的分离纯化，适合工业化生产。

在制备姜黄粉末时，先将姜黄经机械粉碎制成粒径≤5mm的粗粉，然后将粗粉与水混合后利用胶磨机研磨处理，真空冷冻干燥得到中粉，最后利用超微粉碎机对中粉进行超微粉碎，得到平均粒径≤10μm的姜黄粉末。通过上述方法获得姜黄粉末平均粒径小，有利于后续充分提取，大大提高了提取产率。

本发明主要经过两次提取和一次硅胶柱层析分离以获得最终的芳姜黄酮对照品，其中，提取试剂和洗脱剂的选择非常关键。芳姜黄酮为萜烯类化合物，属于脂溶性成分，关于两次提取和一次硅胶柱层析分离所用提取试剂和洗脱剂的选择，申请人进行了一系列筛选摸索，第一次提取是利用特定配比的正戊烷-乙醇混合液提取获得提取物Ⅰ，该步骤的目的是提取姜黄粉末中的脂溶性成分；第二次提取是利用特定配比的异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液萃取获得提取物Ⅱ，其中包含芳姜黄酮以及与其极性相近的脂溶性成分；硅胶柱层析分离采用特定配比的异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂即可实现彻底分离，获得高纯度的芳姜黄酮对照品。

附图说明

图1为实施例1所得产物的碳谱；

图2为芳姜黄酮的结构图；

图3为芳姜黄酮的氢谱和碳谱数据。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的中药材姜黄，购自亳州市方海药业有限公司。

实施例1

一种芳姜黄酮对照品的制备方法，包括步骤：

（1）先将姜黄粉碎制成姜黄粉末，然后利用体积比1mL：2 mL的正戊烷-乙醇混合液提取得到提取物Ⅰ；

（2）然后将提取物Ⅰ加入体积比1 mL：8 mL：5 mL：6 mL的异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液中，充分振荡均匀，萃取，取有机相，减压浓缩，得到提取物Ⅱ；

（3）接着利用体积比1 mL：0.2 mL的异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂，对提取物Ⅱ进行硅胶柱层析分离，所得洗脱液旋蒸，干燥，即得所述的一种芳姜黄酮对照品；

其中，步骤（1）中姜黄粉末的制备方法为：先将姜黄经机械粉碎制成粒径≤5mm的粗粉，然后将粗粉倒入5倍重量的去离子水中，超声波振荡30分钟，经胶磨机研磨处理0.5小时后迅速转移至真空冷冻干燥机中，温度降至-40℃，然后抽真空至15Pa，接着温度升至20℃，继续在当前的真空度条件下处理7小时，得到中粉；最后利用超微粉碎机对中粉进行超微粉碎，得到平均粒径≤10μm的姜黄粉末。

姜黄在粉碎处理前先进行除杂、水洗、阴干处理，阴干时间为2天。机械粉碎采用鄂式粉碎。胶磨机研磨处理时物料温度控制在20～25℃。利用超微粉碎机进行超微粉碎，具体采用气流粉碎机，其工作条件为：气流压力为1000kPa，进料速度为200r/min，分级频率为35Hz，粉碎时间为60分钟。

步骤（1）中，姜黄粉末与正戊烷-乙醇混合液的质量体积比为1g：6mL。步骤（1）中提取的具体方法是：回流提取2小时，重复提取2次，过滤，合并滤液，减压除去溶剂，即得提取物Ⅰ；每次提取时，固液质量比为1g：5g。

步骤（2）中，提取物Ⅰ与异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液的质量体积比为1g：6mL。

步骤（3）中，采用100目硅胶柱层析分离，过柱流速为0.5mL/min。

对所得芳姜黄酮对照品进行结构确认：

EI-MS m/z：216（M⁺，6）, 201（M⁺-Me，7）,132（11）, 119（44）, 91（25）, 83（100）, 77（14）, 55（70）；

布鲁克核磁共振波谱仪ANCE 400，以氯仿为内标，碳谱见图1，与结构相应的氢谱、碳谱数据见图2和图3。

实施例2

一种芳姜黄酮对照品的制备方法，包括步骤：

（1）先将姜黄粉碎制成姜黄粉末，然后利用体积比1 mL：3 mL的正戊烷-乙醇混合液提取得到提取物Ⅰ；

（2）然后将提取物Ⅰ加入体积比1 mL： 10 mL： 8 mL： 9 mL的异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液中，充分振荡均匀，萃取，取有机相，减压浓缩，得到提取物Ⅱ；

（3）接着利用体积比1 mL： 0.3 mL的异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂，对提取物Ⅱ进行硅胶柱层析分离，所得洗脱液旋蒸，干燥，即得所述的一种芳姜黄酮对照品；

其中，步骤（1）中姜黄粉末的制备方法为：先将姜黄经机械粉碎制成粒径≤5mm的粗粉，然后将粗粉倒入8倍重量的去离子水中，超声波振荡40分钟，经胶磨机研磨处理1小时后迅速转移至真空冷冻干燥机中，温度降至-50℃，然后抽真空至20Pa，接着温度升至30℃，继续在当前的真空度条件下处理8小时，得到中粉；最后利用超微粉碎机对中粉进行超微粉碎，得到平均粒径≤10μm的姜黄粉末。

姜黄在粉碎处理前先进行除杂、水洗、阴干处理，阴干时间为3天。机械粉碎采用圆锥粉碎。胶磨机研磨处理时物料温度控制在25℃。利用超微粉碎机进行超微粉碎，具体采用气流粉碎机，其工作条件为：气流压力为1000kPa，进料速度为200r/min，分级频率为35Hz，粉碎时间为80分钟。

步骤（1）中，姜黄粉末与正戊烷-乙醇混合液的质量体积比为1g： 9mL。步骤（1）中提取的具体方法是：回流提取3小时，重复提取3次，过滤，合并滤液，减压除去溶剂，即得提取物Ⅰ；每次提取时，固液质量比为1g： 8g。

步骤（2）中，提取物Ⅰ与异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液的质量体积比为1g：9mL。

步骤（3）中，采用200目硅胶柱层析分离，过柱流速为0.8mL/min。

实施例3

一种芳姜黄酮对照品的制备方法，包括步骤：

（1）先将姜黄粉碎制成姜黄粉末，然后利用体积比1 mL：2 mL的正戊烷-乙醇混合液提取得到提取物Ⅰ；

（2）然后将提取物Ⅰ加入体积比1 mL： 10 mL：5 mL： 9 mL的异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液中，充分振荡均匀，萃取，取有机相，减压浓缩，得到提取物Ⅱ；

（3）接着利用体积比1 mL：0.2 mL的异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂，对提取物Ⅱ进行硅胶柱层析分离，所得洗脱液旋蒸，干燥，即得所述的一种芳姜黄酮对照品；

其中，步骤（1）中姜黄粉末的制备方法为：先将姜黄经机械粉碎制成粒径≤5mm的粗粉，然后将粗粉倒入8倍重量的去离子水中，超声波振荡30分钟，经胶磨机研磨处理1小时后迅速转移至真空冷冻干燥机中，温度降至-40℃，然后抽真空至20Pa，接着温度升至20℃，继续在当前的真空度条件下处理8小时，得到中粉；最后利用超微粉碎机对中粉进行超微粉碎，得到平均粒径≤10μm的姜黄粉末。

姜黄在粉碎处理前先进行除杂、水洗、阴干处理，阴干时间为2天。机械粉碎采用辊式粉碎。胶磨机研磨处理时物料温度控制在25℃。利用超微粉碎机进行超微粉碎，具体采用气流粉碎机，其工作条件为：气流压力为1000kPa，进料速度为200r/min，分级频率为35Hz，粉碎时间为60分钟。

步骤（1）中，姜黄粉末与正戊烷-乙醇混合液的质量体积比为1g： 9mL。步骤（1）中提取的具体方法是：回流提取2小时，重复提取3次，过滤，合并滤液，减压除去溶剂，即得提取物Ⅰ；每次提取时，固液质量比为1g：5g。

步骤（2）中，提取物Ⅰ与异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液的质量体积比为1g：9mL。

步骤（3）中，采用100目硅胶柱层析分离，过柱流速为0.8mL/min。

实施例4

一种芳姜黄酮对照品的制备方法，包括步骤：

（1）先将姜黄粉碎制成姜黄粉末，然后利用体积比1 mL：3 mL的正戊烷-乙醇混合液提取得到提取物Ⅰ；

（2）然后将提取物Ⅰ加入体积比1 mL：8 mL： 8 mL：6 mL的异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液中，充分振荡均匀，萃取，取有机相，减压浓缩，得到提取物Ⅱ；

（3）接着利用体积比1 mL： 0.3 mL的异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂，对提取物Ⅱ进行硅胶柱层析分离，所得洗脱液旋蒸，干燥，即得所述的一种芳姜黄酮对照品；

其中，步骤（1）中姜黄粉末的制备方法为：先将姜黄经机械粉碎制成粒径≤5mm的粗粉，然后将粗粉倒入5倍重量的去离子水中，超声波振荡40分钟，经胶磨机研磨处理0.5小时后迅速转移至真空冷冻干燥机中，温度降至-50℃，然后抽真空至15Pa，接着温度升至30℃，继续在当前的真空度条件下处理7小时，得到中粉；最后利用超微粉碎机对中粉进行超微粉碎，得到平均粒径≤10μm的姜黄粉末。

姜黄在粉碎处理前先进行除杂、水洗、阴干处理，阴干时间为3天。机械粉碎采用锤式粉碎。胶磨机研磨处理时物料温度控制在20℃。利用超微粉碎机进行超微粉碎，具体采用气流粉碎机，其工作条件为：气流压力为1000kPa，进料速度为200r/min，分级频率为35Hz，粉碎时间为80分钟。

步骤（1）中，姜黄粉末与正戊烷-乙醇混合液的质量体积比为1g：6mL。步骤（1）中提取的具体方法是：回流提取3小时，重复提取2次，过滤，合并滤液，减压除去溶剂，即得提取物Ⅰ；每次提取时，固液质量比为1g： 8g。

步骤（2）中，提取物Ⅰ与异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液的质量体积比为1g：6mL。

步骤（3）中，采用200目硅胶柱层析分离，过柱流速为0.5mL/min。

实施例5

一种芳姜黄酮对照品的制备方法，包括步骤：

（1）先将姜黄粉碎制成姜黄粉末，然后利用体积比1 mL：2.5 mL的正戊烷-乙醇混合液提取得到提取物Ⅰ；

（2）然后将提取物Ⅰ加入体积比1 mL：9 mL：7 mL：8 mL的异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液中，充分振荡均匀，萃取，取有机相，减压浓缩，得到提取物Ⅱ；

（3）接着利用体积比1 mL：0.25 mL的异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂，对提取物Ⅱ进行硅胶柱层析分离，所得洗脱液旋蒸，干燥，即得所述的一种芳姜黄酮对照品；

其中，步骤（1）中姜黄粉末的制备方法为：先将姜黄经机械粉碎制成粒径≤5mm的粗粉，然后将粗粉倒入7倍重量的去离子水中，超声波振荡35分钟，经胶磨机研磨处理1小时后迅速转移至真空冷冻干燥机中，温度降至-45℃，然后抽真空至18Pa，接着温度升至25℃，继续在当前的真空度条件下处理7小时，得到中粉；最后利用超微粉碎机对中粉进行超微粉碎，得到平均粒径≤10μm的姜黄粉末。

姜黄在粉碎处理前先进行除杂、水洗、阴干处理，阴干时间为3天。机械粉碎采用反击式粉碎。胶磨机研磨处理时物料温度控制在22℃。利用超微粉碎机进行超微粉碎，具体采用气流粉碎机，其工作条件为：气流压力为1000kPa，进料速度为200r/min，分级频率为35Hz，粉碎时间为70分钟。

步骤（1）中，姜黄粉末与正戊烷-乙醇混合液的质量体积比为1g：8mL。步骤（1）中提取的具体方法是：回流提取2小时，重复提取3次，过滤，合并滤液，减压除去溶剂，即得提取物Ⅰ；每次提取时，固液质量比为1g：6g。

步骤（2）中，提取物Ⅰ与异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液的质量体积比为1g：8mL。

步骤（3）中，采用200目硅胶柱层析分离，过柱流速为0.6mL/min。

对比例1

一种芳姜黄酮对照品的制备方法，包括步骤：

（1）先将姜黄粉碎制成姜黄粉末，然后利用体积比1 mL：2 mL的正戊烷-乙醇混合液提取得到提取物Ⅰ；

（2）然后将提取物Ⅰ加入体积比1 mL：8 mL：5 mL：6 mL的异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液中，充分振荡均匀，萃取，取有机相，减压浓缩，得到提取物Ⅱ；

（3）接着利用体积比1 mL：0.2 mL的异丙醚-乙酸丁酯混合液作为洗脱剂，对提取物Ⅱ进行硅胶柱层析分离，所得洗脱液旋蒸，干燥，即得所述的一种芳姜黄酮对照品；

其中，步骤（1）中姜黄粉末的制备方法为：将姜黄经机械粉碎制成粒径≤5mm的姜黄粉末。姜黄在粉碎处理前先进行除杂、水洗、阴干处理，阴干时间为2天。机械粉碎采用鄂式粉碎。

步骤（1）中，姜黄粉末与正戊烷-乙醇混合液的质量体积比为1g：6mL。步骤（1）中提取的具体方法是：回流提取2小时，重复提取2次，过滤，合并滤液，减压除去溶剂，即得提取物Ⅰ；每次提取时，固液质量比为1g：5g。

步骤（2）中，提取物Ⅰ与异丙醚-乙酸丁酯-乙酸乙酯-水混合液的质量体积比为1g：6mL。

步骤（3）中，采用100目硅胶柱层析分离，过柱流速为0.5mL/min。

对比例2～11

分别调整提取溶剂或洗脱剂配比组成，其余同实施例1，具体见表1。

表1.对比例2～11中提取溶剂或洗脱剂的配比调整

注：“--”表示与实施例1相同。

对比例12

用正己烷替换正戊烷，利用相同配比的正己烷-乙醇混合液替换正戊烷-乙醇混合液，其余同实施例1。

对比例13

用乙酸乙酯替换乙酸丁酯，利用1 mL：13mL：6 mL的异丙醚-乙酸乙酯-水混合液进行步骤（2）的提取，其余同实施例1。

对比例14

用乙酸乙酯替换乙酸丁酯，利用相同配比的异丙醚-乙酸乙酯混合液替换异丙醚-乙酸丁酯混合液，其余同实施例1。

试验例

统计实施例1～5和对比例1～14的芳姜黄酮对照品提取产率（所得芳姜黄酮对照品的质量/姜黄的质量），并利用高效液相面积归一化法计算纯度，结果见表2。

表2.提取产率和纯度结果

	提取产率（mg/kg）	纯度（%）
			实施例1	3880	≥99.99
实施例2	3885	≥99.99
			实施例3	3900	≥99.99
实施例4	3899	≥99.99
			实施例5	3911	≥99.99
对比例1	2031	≥99.99
			对比例2	3277	90.33
对比例3	3018	90.12
			对比例4	3459	92.88
对比例5	3332	92.17
			对比例6	3488	92.25
对比例7	3318	92.58
			对比例8	3469	92.17
对比例9	3385	92.12
			对比例10	3715	95.38
对比例11	3589	94.85
			对比例12	3011	83.67
对比例13	3233	85.22
			对比例14	3187	87.91

由表2可知，实施例1～5的制备方法具有较高的提取产率，所得产品纯度很高。对比例1直接采用机械粉碎制成粒径≤5mm姜黄粉末，提取产率明显降低，这是因为姜黄粉末粒径偏大，使得后续提取不够充分；对比例2～11分别调整提取溶剂或洗脱剂配比组成，对比例12～14替换其中个别试剂，所得产品的纯度明显降低，说明本申请的提取溶剂、洗脱剂的特定配比的组合方可获得良好的提取效果。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。