阅读说明：本技术 骨软骨修复支架及其制备方法 (Osteochondral repair scaffold and preparation method thereof ) 是由 潘洋 魏欣苗 陈雪霓 谭荣伟 佘振定 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种骨软骨修复支架,包括依次设置的软骨下骨层、钙化软骨层、软骨层和软骨膜层；其中,所述软骨膜层为位于所述软骨层远离所述钙化软骨层的一侧表面的致密膜层,所述致密膜层能够防止外部纤维细胞长入到软骨层。本发明还公开了一种骨软骨修复支架的制备方法。本发明中的骨软骨修复支架,在软骨层一侧表面的设置有致密的软骨膜层,该软骨膜层作为软骨层的屏障膜,可以防止外部纤维细胞长入软骨层,同时修复得到软骨组织不会超过周围正常组织,避免造成软骨增生。(The invention relates to a bone cartilage repair support, which comprises a subchondral bone layer, a calcified cartilage layer, a cartilage layer and a cartilage membrane layer which are sequentially arranged; the cartilage layer is a compact film layer located on the surface of one side, far away from the calcified cartilage layer, of the cartilage layer, and the compact film layer can prevent external fiber cells from growing into the cartilage layer. The invention also discloses a preparation method of the osteochondral repair scaffold. According to the osteochondral repair scaffold, the compact cartilage membrane layer is arranged on the surface of one side of the cartilage layer and serves as a barrier membrane of the cartilage layer, external fiber cells can be prevented from growing into the cartilage layer, meanwhile, cartilage tissues obtained through repair cannot exceed surrounding normal tissues, and cartilage hyperplasia is avoided.)

骨软骨修复支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，特别是涉及一种骨软骨修复支架及其制备方法。

背景技术

软骨损伤是一种骨关节炎，是中老年人群的常见、多发疾病，目前临床的一些治疗方法对于骨关节炎中后期所形成的大面积软骨缺损都无法提供较好的修复效果。组织工程骨软骨修复支架是最有希望的修复方法。骨软骨修复支架在被植入体内后，在体内被逐渐替代为正常组织，从而完成修复。而为了仿生天然骨软骨结构，骨软骨修复支架通常被设计为三层结构：软骨层、钙化软骨层和软骨下骨层。

传统的三层结构的骨软骨修复支架，在软骨损伤修复过程中会产生一些问题。例如，在植入体内后，其中的软骨层与其他组织和细胞相接触，外部的成纤维细胞会由软骨层的孔隙长入到软骨层内部甚至是长入到支架内部，从而影响正常的骨再生过程，影响愈合；同时修复得到软骨组织容易超过周围正常组织，从而造成软骨增生。

发明内容

基于此，有必要针对传统的三层结构的骨软骨修复支架存在的技术问题，提供一种骨软骨修复支架及其制备方法。

一种骨软骨修复支架，包括依次设置的软骨下骨层、钙化软骨层、软骨层和软骨膜层；其中，所述软骨膜层为位于所述软骨层一侧表面的致密膜层，所述致密膜层能够防止外部纤维细胞长入到软骨层。

在其中一个实施例中，所述软骨膜层为胶原膜层。

在其中一个实施例中，所述软骨下骨层、所述钙化软骨层和所述软骨层均为多孔结构，所述钙化软骨层具有一层防止软骨下骨层组织长入软骨层的屏障层，所述屏障层的孔径小于所述软骨下骨层和所述软骨层的孔径。

在其中一个实施例中，所述屏障层的孔径为100nm-5μm。

在其中一个实施例中，所述钙化软骨层还包括第一表层和第二表层，所述第一表层和第二表层分别设置在所述屏障层与软骨下骨层及软骨层相邻的部位，所述第一表层和第二表层的孔径均主要为50μm～1000μm。

第一表层和第二表层通过致孔剂主要形成大孔，但大孔孔壁同时会具有小的微孔构成，微孔孔径为100nm-5μm。

在其中一个实施例中，所述钙化软骨层的主要成分为聚乳酸。

在其中一个实施例中，所述软骨下骨层包括具有孔隙的金属外框和主要成分为非金属的软骨下骨层本体，所述软骨下骨层本***于所述金属外框内部。

在其中一个实施例中，所述金属外框包括多条相互间隔设置的金属条。

在其中一个实施例中，所述金属外框的材质为不锈钢、除不锈钢以外的钛合金和除不锈钢以外的镁合金中的一种或者几种的复合物。

在其中一个实施例中，所述软骨下骨层本体为胶原-无机盐复合多孔支架。

在其中一个实施例中，所述无机盐选自磷酸三钙、羟基磷灰石、天然煅烧骨颗粒和多聚磷酸钙中的一种，或以上无机盐中的任意几种的混合物。

在其中一个实施例中，所述无机盐为镁和/或镓元素掺杂的多聚磷酸钙。

一种以上所述骨软骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：

制备依次连接的软骨下骨层、钙化软骨层和软骨层；以及

在所述软骨层远离所述钙化软骨层一侧的表面形成致密的软骨膜层。

在其中一个实施例中，所述在所述软骨层一侧的表面形成致密的软骨膜层包括：

提供浓度为0.5％～1.5％(还可以选择0.8％、1％、1.2％、1.4％，胶原溶液的浓度百分数均以g/100ml计)的胶原溶液；

将所述胶原溶液进行交联，得到交联后的胶原溶液；以及

采用交联后的胶原溶液在所述软骨层一侧的表面形成致密的胶原膜层，所述致密的胶原膜层即为软骨膜层。

在其中一个实施例中，所述在所述软骨层远离所述钙化软骨层一侧的表面形成致密的软骨膜层包括：

提供浓度为0.5％～1.5％(还可以选择0.8％、1％、1.2％、1.4％，胶原溶液的浓度百分数均以g/100ml计)的胶原溶液；

采用所述胶原溶液在所述软骨层远离所述钙化软骨层一侧的表面干燥形成膜状结构；以及

将所述膜状结构在交联溶液中进行交联形成致密的软骨膜层。

在其中一个实施例中，所述制备依次连接的软骨下骨层、钙化软骨层和软骨层包括：

采用聚乳酸由热致相分离形成钙化软骨层；

在所述钙化软骨层一侧的表面形成软骨下骨层；以及

在所述钙化软骨层另一侧的表面形成软骨层。

在其中一个实施例中，所述采用聚乳酸由热致相分离形成钙化软骨层包括：

提供浓度为4％～10％的聚乳酸溶液；

提供粒径为50μm～1000μm的致孔剂；

堆积第一层致孔剂，加入聚乳酸溶液浸没所述第一层致孔剂，并在所述第一层致孔剂上方形成一层聚乳酸溶液层；

在所述聚乳酸溶液层堆积第二层致孔剂，然后加入所述聚乳酸溶液浸没所述第二层致孔剂，得到聚乳酸溶液前体；以及

将所述聚乳酸溶液前体在4℃～-196℃中热致相分离5min～2h，用置换溶剂将聚乳酸溶液的溶剂进行置换，在-60℃～-80℃温度下进行冻干，形成钙化软骨层。

在其中一个实施例中，所述在所述钙化软骨层一侧的表面形成软骨下骨层包括：

提供金属外框；

将所述金属外框置于所述钙化软骨层一侧的表面上；

将无机盐与交联的胶原溶液混合形成无机盐-交联胶原混合溶液；以及

将所述无机盐-交联胶原混合溶液倒入所述金属外框中，冻干，形成软骨下骨层本体。

在其中一个实施例中，所述在所述钙化软骨层一侧的表面形成软骨下骨层包括：

提供金属外框；

将所述金属外框置于所述钙化软骨层一侧的表面上；

提供胶原-无机盐的混合溶液；

将所述胶原-无机盐的混合溶液加入到所述金属外框中，进行冻干，形成海绵支架；

对所述海绵支架在交联液进行交联，冻干，得到软骨下骨层本体。

本发明中的骨软骨修复支架，在软骨层一侧表面的设置有致密的软骨膜层，该软骨膜层作为软骨层的屏障膜，可以防止外部纤维细胞长入软骨层，同时修复得到软骨组织不会超过周围正常组织，避免造成软骨增生。

附图说明

图1为本发明实施例中骨软骨修复支架截面结构示意图；

图2为本发明实施例中骨软骨修复支架中的钙化软骨层的截面结构示意图；

图3-图5为本发明实施例中骨软骨修复支架中的软骨下骨层的金属支架结构示意图，其中，上面一行为金属外框的俯视图，下面一行是与上面一行对应的主视图；

图6为本发明实施例2中的骨软骨修复支架中的钙化软骨层中的屏障层的电镜图；

图7为本发明实施例2中的骨软骨修复支架中的钙化软骨层中的表层的电镜图；

图8为本发明实验例2中，在实施例2中的骨软骨修复支架中软骨膜层上进行细胞培养后，软骨膜层远离软骨层一侧的表面的细胞培养结果图；

图9为本发明实验例2中，在实施例2中的骨软骨修复支架中软骨膜层上进行细胞培养后，软骨膜层靠近软骨层一侧的表面的细胞培养结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

如图1所示为本发明实施例中的一种骨软骨修复支架，包括依次设置的软骨下骨层1、钙化软骨层2、软骨层3和软骨膜层4；其中，其中软骨膜层4为位于软骨层3远离钙化软骨层2的一侧表面的致密膜层，所述致密膜层能够防止外部纤维细胞长入到软骨层。

本实施例中的骨软骨修复支架，在软骨层远离钙化软骨层2的一侧表面的设置有致密的软骨膜层，该软骨膜层作为软骨层的屏障膜，可以防止外部纤维细胞长入软骨层，同时修复得到软骨组织不会超过周围正常组织，避免造成软骨增生。其中软骨膜层4具有较高的致密度，这一致密度是使得细胞不能穿过所述软骨膜层。

在一实施例中，软骨膜层4为胶原膜层。进一步的，软骨膜层4为由交联后的胶原组成的致密膜层，软骨膜层4的厚度为0.1mm～1mm。在实际的操作过程中，采用浓度为0.5％～1.5％(还可以选择0.8％、1％、1.2％、1.4％，胶原溶液的浓度百分数均以g/100ml计，溶剂可选择本领域的常规溶剂，例如约0.05mol/L的醋酸溶液)的胶原来进行交联。

当然，软骨膜层还可以采用的其它材质和方法来形成。例如使用丙酮溶解10％的PLGA(质量体积比，如1gPLGA溶于10mL丙酮)，而后将溶液倒入烧杯中，形成1mm厚度高度，而后将已经制备好的软骨下骨/钙化软骨/软骨层支架，以软骨层3远离钙化软骨层2的一侧表面沉积入烧杯中的溶液中，而后风干，形成软骨膜层4。

在一实施例中，软骨下骨层1、钙化软骨层2和软骨层均3为多孔结构，钙化软骨层2具有一层防止软骨下骨层组织长入软骨层的屏障层，所述屏障层的孔径小于软骨下骨层1和软骨层3的孔径。

本实施例中的骨软骨修复支架，其中的软骨下骨层、钙化软骨层和软骨层均为多孔结构的设置有利于骨软骨修复支架的养分传输，保证了骨软骨修复支架修复过程的顺利进行。钙化软骨层具有一层防止软骨下骨层组织长入软骨层的屏障层，并且屏障层具有相对较小的孔径，其可以作为屏障防止软骨下骨层的骨组织长入软骨层的同时，又能通过相对较小的孔径进行养分的传输。

如图2所示，本实施例中的钙化软骨层2包括第一表层21、屏障层22和第二表层23，其中所述第一表层21和所述第二表层23的孔径为50μm～1000μm，所述屏障层22的孔径为100nm～5μm。

钙化软骨层2为三层结构，由图1和图2可知，在本实施例中，屏障层22的孔径相对与第一表层21和第二表层23的孔径要小很多。钙化软骨层2在作为屏障膜防止下方骨组织长入上方软骨层的同时，又能通过微孔进行养分的传输；钙化软骨层中的第一表层和第二表层中含有大孔，钙化软骨层中的第一表层和第二表层可以作为软骨下骨层和钙化软骨层、钙化软骨层和软骨层之间的过渡层，用以增强与软骨下骨和软骨层之间的连接强度。

在一实施例中，软骨下骨层1包括具有孔隙的金属外框和主要成分为非金属的软骨下骨层本体，所述软骨下骨层本***于所述金属外框内部。

传统的骨软骨修复支架中，其中的软骨下骨层存在较多的问题。有的软骨下骨层采用聚合物、高分子和无机盐的复合支架，虽然能够被完全降解，但是其力学强度低，加入无机盐后，脆性也会变高，同样限制了其在临床上的使用。有的为了增强软骨下骨层的强度，以金属料作为基质来制备软骨下骨层，即得到的软骨下骨层具备金属支架，金属支架的力学强度高，但是通常制备的金属支架整体为多孔结构，骨组织能够长入的区域有限，并且由于金属的弹性模量较高，使得最后修复后的软骨下骨层与正常骨组织存在较大差异。

本实施例中的软骨下骨层1包括具有孔隙的金属外框和主要成分为非金属的软骨下骨层本体，其中金属外框具有保护内部力学强度较低的软骨下骨层本体的作用；在使得软骨下骨层1保持高强度的同时，由于金属支架仅仅作为一个外框，所占软骨下骨层1的比例较低，减少了修复完成后骨软骨组织与周围正常骨组织的差异。

在一实施例中，所述金属外框包括多条相互间隔设置的金属条。如图3-图5所示为本发明实施例中的三种不同结构的金属外框的结构示意图，并不作为对本发明的限制，例如金属外框的底面可根据需要设置为三角形、正方形或者根据患者软骨缺损部位的具体形状而定制的形状。在一个具体的实施例中，其中的金属外框为圆柱形结构，在图3-图5中上面一行为金属外框的俯视图，下面一行是与上面一行对应的主视图。如图3所示的金属外框由多条平行设置的金属条组成。如图4所示的金属外框由多条垂直相交的金属条构建的呈网格设置的外框。如图5所示的金属外框由多条倾斜相交的金属条构建的呈网格设置的外框。优选的，所述金属条相隔的间距为0.5mm-5mm，所述金属条的直径为0.5mm-1mm。金属外框的材质可以为不锈钢、除不锈钢以外的钛合金或除不锈钢以外的镁合金。当然也可以为由上述金属组成的复合结构，例如多条金属条可以分别为不同的金属材质。

优选的，对于其中的金属外框的结构可以根据实际的需要进行结构设计。例如可以采用软件进行金属外框的设计，然后采用3D打印的技术打印得到所述金属外框。

在一实施例中，所述软骨下骨层本体为胶原-无机盐复合多孔支架。优选的，软骨下骨层本体由交联后的胶原和无机盐颗粒混合而成形成的多孔支架。其中胶原与无机盐的质量比为10:90～90:10。所得到的胶原-无机盐复合多孔支架的孔径为50μm～500μm。

在本发明实施例中，其中的胶原可以为I型胶原、II型胶原、III型胶原或IM型胶原，或它们的混合物。

本发明实施例中，进行交联胶原有两种方式，一种是将交联剂直接加入到胶原溶液中(0.2％-1％)，混匀1-24h后，而后预冻冻干，再使用清洗液浸泡支架，去除多余未交联的交联剂；另一种是将胶原溶液(0.2％-1％)先与无机盐颗粒混合后冻干或者直接将胶原溶液干燥(冻干、常温风干、真空干燥)，然后将冻干或干燥后的样品放入交联溶液中浸泡1-24h后，使用纯水清洗去除多余未交联的交联剂。

本发明实施例中，交联剂为甲醛、戊二醛、EDC(1-乙基-(3-3-二甲基氦丙基)－碳化二亚胺)-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)中一种或者几种的混合物。不同层可以采用不同的交联剂进行胶原的交联。

在一些实施例中，ED的添加质量为胶原干态重量的0.3％～0.5％(m/m)，优选0.4％(m/m)。

本发明实施例中，无机盐选自磷酸三钙、羟基磷灰石、天然煅烧骨颗粒和聚磷酸钙中的一种，或以上无机盐中的任意几种的混合物。进一步的，所述无机盐为镁和/或镓元素掺杂的多聚磷酸钙。无机盐颗粒的粒径为100nm-2mm。

本发明实施例中还公开一种骨软骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：

S10：制备依次连接的软骨下骨层、钙化软骨层和软骨层；

S20：在所述软骨层远离所述钙化软骨层一侧的表面形成致密的软骨膜层。

步骤S10中，对于依次连接的软骨下骨层、钙化软骨层和软骨层的制备，可以采用不同的制备方法，以及不同的顺序进行制备。

在本发明的一实施例中，首先采用聚乳酸(PLLA)由热致相分离形成钙化软骨层。然后在钙化软骨层的两侧的表面分别形成软骨下骨层和软骨层。

在本实施例中，在热致相分离形成钙化软骨层中，采用的聚乳酸(PLLA)溶液的浓度为4％～10％(g/100ml，还可以选择5％、6％、7％、8％或9％)，溶解PLLA的溶剂为四氢呋喃。采用的致孔剂的粒径为50μm～1000μm，还可以选择诸如100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm或900μm。

本实施例中的钙化软骨层包括第一表层、屏障层和第二表层。其中，屏障层的孔径与另外两个表层的孔径不同，本发明实施例中采用如下方法实现：首先，堆积第一层致孔剂，加入聚乳酸溶液浸没所述第一层致孔剂，并在所述第一层致孔剂上方形成一层聚乳酸溶液层；然后，在所述聚乳酸溶液层堆积第二层致孔剂，然后加入所述聚乳酸溶液浸没所述第二层致孔剂，得到聚乳酸溶液前体；最后，将所述聚乳酸溶液前体在-20℃中热致相分离2h，，采用纯水作为置换溶剂，置换四氢呋喃三次，在-20℃～196℃温度下进行冻干，形成钙化软骨层。进一步的，在完成冻干步骤之后，可以将得到的结构放入紫外或臭氧机中处理10min，从而增强钙化软骨层的亲水性。所得到的钙化软骨层中，第一表层和第二表层的孔径为50μm～1000μm的大孔径，屏障层的孔径为100nm～5μm的微孔径。上述制备方法操作简单方便，同时虽然所形成的钙化软骨层具有三个孔径不同的层，但是钙化软骨层的整体性较好，钙化软骨层稳定性好。

在本发明实施例中，在钙化软骨层一侧的表面(例如可以是第一表层的表面)形成软骨下骨层。软骨下骨层可以为包括金属外框和软骨下骨层本体两部分结构。这样的结构在保证软骨下骨层具有基本结构的同时，增加了金属外框，从而使得软骨下骨层具有较高的强度。

在一实施例中，软骨下骨层可以采用以下方法进行制备：

提供金属外框：金属外框可以采用不同的方式进行制备，例如可以采用不同的金属条根据需要的结构进行组装；也可以根据需要采用软件设计出金属外框并使用三维打印机打印得到所述金属外框。

提供用于形成软骨下骨层本体的材料：形成软骨下骨层本体的材料可以为将无机盐与交联的胶原溶液混合形成的无机盐-交联胶原混合溶液。

将所述金属外框置于所述钙化软骨层一侧的表面上。

将所述无机盐-交联胶原混合溶液倒入所述金属外框中，冻干，形成软骨下骨层本体，所述软骨下骨层本体与所述金属外框共同组成所述软骨下骨层。

在另一实施例中，形成软骨下骨层本体的材料还可以为胶原与无机盐的混合溶液，其中的胶原为未进行交联。将所述胶原-无机盐的混合溶液加入到所述金属外框中，进行冻干，形成海绵支架；然后将海绵支架在交联液进行交联，冻干，得到软骨下骨层本体，软骨下骨层本体与金属外框共同组成所述软骨下骨层。

在本发明实施例中，在钙化软骨层另一侧的表面(例如可以是第一表层的表面)形成软骨层。可以使用交联胶原溶液或者交联胶原溶液与无机盐颗粒复合溶液来形成软骨层。当然也可以使用未交联胶原溶液与无机盐颗粒复合溶液在钙化软骨层另一侧的表面形成未交联的软骨层，然后在交联液中进行交联。

本发明实施例中，形成骨下软骨层和软骨层的胶原溶液或未交联胶原溶液均会进入到钙化软骨层的第一表层或第二表层中的大孔径中，从而增强了骨下软骨层和软骨层与钙化软骨层之间的连接强度。

步骤S20中，在所述软骨层远离所述钙化软骨层一侧的表面形成致密的软骨膜层。进一步的，本发明实施例中红的软骨膜层为无无孔胶原膜层。

在本发明实施例中，致密的软骨膜层的制备过程如下：

提供浓度为0.5％～1.5％(g/100ml)的胶原溶液；

将所述胶原溶液进行交联，得到交联后的胶原溶液；以及

采用交联后的胶原溶液在所述软骨层远离所述钙化软骨层一侧的表面形成致密的软骨膜层。

在本发明实施例中，致密的软骨膜层的制备过程如下：

提供浓度为0.5％～1.5％(g/100ml)的胶原溶液；

采用所述胶原溶液在所述软骨层远离所述钙化软骨层一侧的表面干燥形成膜状结构；以及

将所述膜状结构在交联溶液中进行交联形成致密的软骨膜层。

为了对本发明实施例进行更加详细的说明，下面更为优选的实施例。

实施例1

(1)钙化软骨层的制备

制备浓度为4％(g/100ml)的PLLA溶液(PLLA粘均分子量为100000)，溶剂为四氢呋喃，倒入底部堆积一层果糖微球致孔剂(致孔剂粒径100μm-200μm)的模具中，浸没致孔剂，并在致孔剂上方形形成一层PLLA溶液层；而后再在PLLA溶液层的顶部在加入一层致孔剂(致孔剂粒径100μm-200μm)，再加入PLLA溶液填满致孔剂，而后在-20℃下热致相分离2h，而后使用纯水置换溶剂三次后，冻干得到钙化软骨层，将冻干后的钙化软骨层放入紫外/臭氧机中处理10min，增强其亲水性。

钙化软骨层具有两个表层和位于两个表层之间的屏障层。在本实施例中，PLLA溶液浸没致孔剂部分形成的为两个表层，大孔孔径为100-200μm，微孔孔径为100nm-50μm；PLLA溶液层形成的为屏障层，孔径为100nm-50μm。

(2)软骨下骨层的制备

金属外框的制备

使用软件设计软骨下骨金属外框并使用三维打印机进行打印，本实施例中的金属外框的材质为钛合金，金属外框的外观直径为6mm，高度为10mm，金属外框中的金属条如图3平行设置，其中相邻金属条的间距为1mm，金属条直径为0.5mm。

软骨下骨层本体的制备

向浓度为0.7％(g/100ml)的胶原溶液中，加入0.4％的戊二醛(戊二醛为交联剂，其加入量为占胶原固体的质量百分含量)，搅拌6h至均匀状态，得到交联后的胶原溶液；

将交联后的胶原溶液与天然煅烧牛骨颗粒(牛骨除去表层脂肪、筋膜后，经过粉碎形成牛骨颗粒，使用1mol/L氢氧化钠处理3次，每次8h，而后使用丙酮浸泡3次，每次8h，而后放入烧结炉中，10h升温至1000℃并维持1000℃4h，而后自然降温，尺寸通过标准筛过筛为1mm-2mm)混合(其中牛骨颗粒质量与胶原质量比为80：20)，摇匀得到交联胶原-牛骨颗粒混合溶液，将交联胶原-牛骨颗粒混合溶液倒入到装有金属外框和钙化软骨层的模具中，放入-60℃预冻，而后冻干，在金属外框中形成软骨下骨层本体。形成钙化软骨层/软骨下骨层支架。

软骨下骨层本体与钙化软骨层通过钙化软骨层一侧的表层的大孔进行连接。

(3)软骨层的制备

制备0.7％(g/100ml)胶原溶液，并向其中加入0.4％的戊二醛，搅拌6h，得到交联后的胶原溶液；将交联后的胶原溶液倒入到装有钙化软骨层/软骨下骨层支架的模具中的钙化软骨层上，形成高度为2mm的交联后的胶原溶液层；将其在-60℃预冻，而后冻干，形成软骨层/钙化软骨层/软骨下骨层支架。

其中，软骨层通过钙化软骨层的表层的大孔与钙化软骨层进行连接。

(4)软骨膜层的制备

制备1％胶原溶液，加入0.6％的戊二醛，搅拌6h，得到交联后的胶原溶液；将交联后的胶原溶液倒入装有软骨层/钙化软骨层/软骨下骨层支架的模具中，在软骨层一侧的表面形成高度为0.5mm的交联后的胶原溶液层，真空干燥形成软骨膜层。最终得到骨软骨修复支架。

实施例2

(1)钙化软骨层的制备

本实施例中，钙化软骨层的制备与实施例1基本相同，不同之处在于本实施中，在-80℃的温度下进行热致相分离1h。

所得到的钙化软骨层具有两个表层和位于两个表层之间的屏障层。在本实施例中，PLLA溶液浸没致孔剂部分形成的为两个表层，大孔孔径为100-500μm，微孔孔径为500nm-5μm；PLLA溶液层形成的为屏障层，孔径为500nm-5μm。

(2)软骨下骨层的制备

金属外框的制备

使用软件设计软骨下骨金属外框并使用三维打印机打印，本实施例中的金属外框的材质为镁合金，金属外框的外观直径为10mm，高度为5mm，金属外框为相互垂直的镁合金条编织而成，相互平行的镁合金金属条的间距为2mm，单根镁合金金属条的直径为0.6mm。

软骨下骨层本体的制备

制备浓度为0.5％的胶原溶液，向其中加入多聚磷酸钠溶液(40～1000个磷酸酯单元通过高能磷酸酐键连接)，调节pH值为9-10，混匀；而后往溶液中加入氯化钙和氯化镁的混合溶液(多聚磷酸钠与氯化钙/氯化镁质量比为1：2.26，氯化钙和氯化镁的混合溶液中氯化钙和氯化镁的摩尔量比为95:5)，形成含有多聚磷酸钙的悬浮液；将悬浮液加入装有金属外框和钙化软骨层的模具中，-24℃预冻，而后进行冻干，形成未交联的软骨下骨层，且未交联的软骨下骨层与钙化软骨层连接在一起。

将EDC/NHS溶于纯水中(EDC和NHS浓度分别为50mmol/L和25mmol/L，体积为混悬液体积的2倍)，使用MES(2-(N-***林)乙磺酸)调节pH＝5.5，形成交联液(其中，EDC质量分数为胶原干态重量的0.4％)。

将未交联的软骨下骨层在交联液中浸泡24h，而后使用0.1mol/L的Na₂HPO₄溶液浸泡洗涤2次，每次2h，而后使用纯水清洗3次，每次2h，除去多余的交联液；然后冻干，形成交联后的软骨下骨层本体，即在金属外框中形成软骨下骨层本体。得到钙化软骨层/软骨下骨层支架。

(3)软骨层的制备

制备0.5％胶原溶液，并向其中加入聚磷酸钙纳米粉末(纳米颗粒粒径为50nm-500nm)，搅拌均匀后得到混合溶液；将混合溶液倒入装有钙化软骨/软骨下骨层支架的模具中，在钙化软骨层上，形成高度为2mm的交联后的混合溶液层，在-60℃预冻，而后冻干，形成未交联的软骨层，未交联的软骨层通过钙化软骨层的表层的大孔孔隙与钙化软骨层连接在一起；然后将未交联的软骨层浸泡进入EDC/NHS交联液(EDC和NHS浓度分别为50mmol/L和25mmol/L，使用MES调节pH＝5.5，体积为混悬液体积的2倍)中8h，而后使用0.1mol/L的Na₂HPO₄浸泡洗涤2次，每次2h，而后使用纯水清洗3次，每次2h，除去多余的交联液后冷冻干燥，形成软骨层。得到软骨层/钙化软骨层/软骨下骨层支架。

(4)软骨膜层的制备

制备0.8％胶原溶液，将其倒入装有软骨层/钙化软骨层/软骨下骨层支架的模具中，真空干燥在软骨层一侧的表面形成膜状结构，而后将膜状结构浸入EDC/NHS交联液(EDC和NHS浓度分别为80mM和40mM，使用MES调节pH＝5.5，体积为混悬液体积的2倍)中浸泡8h，而后使用0.1mol/L Na₂HPO₄浸泡洗涤2次，每次2h，除去多余的交联液后冷冻干燥，软骨层一侧的表面形成软骨膜层。最终得到骨软骨修复支架。

实验例1

使用电镜(日立，型号TM3030，喷金120s，检测电压15kV)对实施例2中的骨软骨修复支架中的钙化软骨层中的屏障层、钙化软骨的表层的微孔进行观察，结过如图6所示。

使用电镜对实施例2中的骨软骨修复支架中的钙化软骨层中的表层进行观察，结过如图7所示。

实验例2

在实施例2的软骨膜层上，培养L929小鼠成纤维细胞，培养3天后，使用鬼笔环肽-罗丹明用于染细胞骨架，DAPI染细胞核。具体步骤为：使用PBS清洗3次后，使用***溶液固定24h。然后使用PBS溶液清洗固定液3次后，使用0.1％Triton处理10min，1％BSA(牛血清蛋白溶液)封闭30min后，使用5ug/mL的鬼笔环肽-罗丹明室温染色30-60min，PBS清洗2次，每次10min。而后使用DAPI染色10min，PBS清洗2次后，吸取多余液体，加荧光封片液封片，而后使用共聚焦显微镜进行观察(型号Leica SP8)。

其中，图8所示的为软骨膜表面的荧光染色图，红色的为L929小鼠成纤维细胞，细胞可能较好的长在软骨膜层表面；图9所示的为软骨膜截面的荧光染色图，由此可以看出小鼠的成纤维细胞不能穿过软骨膜层，因而，可以发现，软骨膜层能够作为屏障膜很好的防止外部细胞长入软骨层，影响软骨修复。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。