阅读说明：本技术 一种利用啤酒糟蛋白制备抗氧化多肽的方法 (Method for preparing antioxidant polypeptide by utilizing brewer's grain protein ) 是由 曲亮璠 郑雅元 曹琳琳 薛薇 许勤虎 沙印发 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用啤酒糟蛋白制备抗氧化多肽的方法,该方法包括以下步骤：1)啤酒糟纤维素酶酶解；2)啤酒糟蛋白酶酶解；3)啤酒糟蛋白的水解度测定；4)啤酒糟多肽产量的测定；5)啤酒糟多肽的分离纯化；6)啤酒糟中水不溶性膳食纤维的提取。本发明设计科学合理,能够将啤酒工业的副产品加以利用提取,减少废弃产物,提高资源利用率及经济效益；节约生产成本,且获得的多肽抗氧化能力强。(The invention relates to a method for preparing antioxidant polypeptide by utilizing brewer's grain protein, which comprises the following steps: 1) carrying out enzymolysis on beer grains by using cellulase; 2) carrying out enzymolysis on brewer's grain protease; 3) measuring the hydrolysis degree of the brewer's grain protein; 4) measuring the yield of the brewer's grain polypeptide; 5) separating and purifying the brewer's grain polypeptide; 6) extraction of water-insoluble dietary fiber from brewery mash. The invention has scientific and reasonable design, can utilize and extract the byproducts of the beer industry, reduces waste products, and improves the resource utilization rate and the economic benefit; the production cost is saved, and the obtained polypeptide has strong oxidation resistance.)

一种利用啤酒糟蛋白制备抗氧化多肽的方法

技术领域

本发明属于啤酒糟的资源化利用领域，涉及一种啤酒糟综合利用方法，特别涉及一种利用啤酒糟蛋白制备抗氧化多肽的方法。

背景技术

啤酒糟又称为麦糟、麦芽糟，是我国酿酒工业的副产物，产量巨大且价格低廉，是大麦、啤酒花等原料经过糖化、糊化等工艺后，通过压滤所残留的固体物质，其蛋白质含量明显高于其他酒糟种类(薯类、玉米、高粱、青稞等)，常被用于微生物发酵原料和制作反刍动物的粗饲料等，经济效益甚微。啤酒糟含水量高，产量大，在生产旺季由于生产厂家无适当的处理技术，常常将啤酒糟直接拉走或排掉，不仅造成资源的浪费，还容易对环境造成污染。啤酒糟富含大量的活性肽、低聚糖、膳食纤维等生物活性物质，这些物质具有抗肿瘤、降血糖、抗菌、抗氧化等作用，有很好的开发价值。据文献报道，啤酒糟中蛋白质含量为20％-30％，膳食纤维含量为50％左右，如何对其进行综合开发利用逐渐成为研究的热点。

目前，从啤酒糟中提取蛋白质的方法主要分为碱提取法、醇提取法、醇-碱提取法和酶提取法。醇提取法对啤酒糟蛋白的提取率较低，仅为5％-10％；而碱提取法虽然有利于麦糟蛋白的提取，但容易导致蛋白质结构的破坏，在处理过程中会产生赖丙氨酸(LAL)一类的异常物质。LAL会抑制原核细胞和真核细胞对赖氨酸的吸收，钝化金属酶，甚至导致其失活。此外，LAL还能引起部分动物肾细胞的病变，对人体也具有潜在风险。

酶解法可直接得到啤酒糟多肽，避免了先提取、再酶解的复杂工艺，且反应条件温和，反应过程不产生有毒有害和难处理的物质，多肽提取效率高。选择单酶酶解或酸、碱水解工艺都易产生苦、咸、涩等不良风味，影响产品品质，降低其使用性能。蛋白酶可分为内切酶和外切酶两种，外切酶专门作用于肽链末端的肽键，内切酶则作用于肽链内部特定区域。中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶属于内切酶，在它们的作用下蛋白质水解成短链多肽，其中某些因含有疏水氨基酸而成为苦味肽。外切酶因每次从多肽链的末端切断释放一个氨基酸，从而把苦肽彻底降解为氨基酸，从而消除苦味。风味蛋白酶是由米曲霉发酵产生的，经筛选复配而成的复合风味蛋白酶，包含了内切蛋白酶与外切肽酶两种活性，可明显去除苦味，达到脱苦的目的。

本发明采用具有两种作用位点的廉价蛋白酶：Alcalase碱性蛋白酶和风味蛋白酶，一方面使啤酒糟蛋白达到一定的水解度，另一方面边酶解边对其产物进行修饰，改良酶解产物啤酒糟多肽的风味，使其作为食品添加剂或者保健品原料。

通过对公开专利文献的检索，并未发现与本专利申请相同的公开专利文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用啤酒糟蛋白制备抗氧化多肽的方法，能够将啤酒工业的副产品加以利用提取，减少废弃产物，提高资源利用率及经济效益；节约生产成本，且获得的多肽抗氧化能力强。

本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的：

一种利用啤酒糟蛋白制备抗氧化多肽的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

1)啤酒糟纤维素酶酶解：将湿啤酒糟置于干燥箱中，并在60℃条件下鼓风烘干，再经粉碎机粉碎，过80目的筛；将过筛后的啤酒糟干粉与水以料液比1：10溶解于水中，并用稀盐酸调节溶液pH值为5～6，向该溶液中加入质量分数为2.0％～2.5％的纤维素酶，在50～55℃条件下酶解4～5h，将纤维素酶酶解后的啤酒糟料液于85℃水浴灭酶15min，冷却至室温备用；

2)啤酒糟蛋白酶酶解：选取风味蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶对步骤1)中的备用物料进行酶解，将两种蛋白酶以1：1的比例进行复合，添加量均为5.0％，用氢氧化钠调节pH值至7.5～8.0，调整料液为1：11，并在50-55℃酶解4～5h，将风味蛋白酶与Alcalase碱性蛋白酶酶解后的啤酒糟料液于85℃水浴灭酶15min，冷却至室温备用；

3)啤酒糟蛋白的水解度测定：将步骤2)中灭酶后的啤酒糟在3000r/min条件下离心10min，并收集酶解液；啤酒糟蛋白的水解度即为蛋白质水解过程中被裂解的肽键数占原料蛋白质总肽键数的百分数，即水解度＝水解液中氨基态氮含量/原料液中总氮含量×100％，采用甲醛滴定法测定啤酒糟蛋白的氨基酸态氮含量，记为X1，即可算出水解度；

4)啤酒糟多肽产量的测定：

a)酸溶蛋白质的测定：吸取酶解液10mL，加入质量分数为15％的三氯乙酸(TCA)溶液10mL，混合均匀，静置10min；将溶液定量转移后在3000r/min下离心10min后，保留上清液，去除沉淀并计算上清液中酸溶蛋白质含量，记为X2；

b)多肽产量计算：

X＝X₂-X₁

其中：X为啤酒糟酶解液中多肽产量，单位为g/100mL；

X1为酶解液中氨基酸态氮含量，单位为g/100mL；

X2为酶解液中酸溶蛋白质含量，单位为g/100mL；

5)啤酒糟多肽的分离纯化：用截留分子量为3kDa、10kDa的超滤膜对啤酒糟水解液进行超滤，压力为2～8bar，温度为30℃，分别获得分子量小于3kDa和分子量小于10kDa的两种组份，加入活性炭1.5～2.0g/100ml，脱色15～20min，过滤活性炭，即得到抗氧化肽溶液；

6)啤酒糟中水不溶性膳食纤维的提取：将酶解后的料液进行分离，所得残渣经多次水洗干燥后即得不溶性膳食纤维。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明中使用的原材料啤酒糟是啤酒工业的主要副产物，啤酒糟资源的综合利用，对保护生态环境、提高资源利用率和经济效益都具有重要促进作用。

2、经过纤维素酶处理后，采用两种蛋白酶复合，直接水解啤酒糟原料得到多肽，减少了仅使用单一商业化蛋白酶的高成本，并提升啤酒生产过程中副产物的价值。

3、通过膜分离获得3kDa和10kDa以下的酶解多肽产物，测得滤液3kDa以下多肽含量为18.91mg/ml；10kDa以下多肽含量为22.17mg/ml，且抗氧化能力良好。

4、通过下游提取技术分别对多肽制备过程中形成的副产物啤酒糟纤维进行精制，减少生产过程中的废弃产物，增加其经济效益。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图；

图2为本发明硫酸亚铁溶液的标准曲线图；

图3为本发明没食子酸溶液的标准曲线图；

图4为本发明奎诺二甲基丙烯酸酯溶液的标准曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种利用啤酒糟蛋白制备抗氧化多肽的方法，其创新之处在于：该方法包括如下步骤：

1)啤酒糟纤维素酶酶解：将湿啤酒糟置于干燥箱中，并在60℃条件下鼓风烘干，再经粉碎机粉碎，过80目的筛；将过筛后的啤酒糟干粉与水以料液比1：10溶解于水中，并用稀盐酸调节溶液pH值为5～6，向该溶液中加入质量分数为2.0％～2.5％的纤维素酶，在50～55℃条件下酶解4～5h，将纤维素酶酶解后的啤酒糟料液于85℃水浴灭酶15min，冷却至室温备用；

2)啤酒糟蛋白酶酶解：选取风味蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶对步骤1)中的备用物料进行酶解，将两种蛋白酶以1：1的比例进行复合，添加量均为5.0％，用氢氧化钠调节pH值至7.5～8.0，调整料液为1：11，并在50-55℃酶解4～5h，将风味蛋白酶与Alcalase碱性蛋白酶酶解后的啤酒糟料液于85℃水浴灭酶15min，冷却至室温备用；

3)啤酒糟蛋白的水解度测定：将步骤2)中灭酶后的啤酒糟在3000r/min条件下离心10min，并收集酶解液；啤酒糟蛋白的水解度即为蛋白质水解过程中被裂解的肽键数占原料蛋白质总肽键数的百分数，即水解度＝水解液中氨基态氮含量/原料液中总氮含量×100％，采用甲醛滴定法测定啤酒糟蛋白的氨基酸态氮含量，记为X1，即可算出水解度，经测定，啤酒糟蛋白的水解度达到25％～30％；

4)啤酒糟多肽产量的测定：

a)酸溶蛋白质的测定：吸取酶解液10mL，加入质量分数为15％的三氯乙酸(TCA)溶液10mL，混合均匀，静置10min；将溶液定量转移后在3000r/min下离心10min后，保留上清液，去除沉淀并计算上清液中酸溶蛋白质含量，记为X2；

b)多肽产量计算：

X＝X₂-X₁

其中：X为啤酒糟酶解液中多肽产量，单位为g/100mL；

X1为酶解液中氨基酸态氮含量，单位为g/100mL；

X2为酶解液中酸溶蛋白质含量，单位为g/100mL；

经计算，啤酒糟多肽产量可达到25％～35％；

5)啤酒糟多肽的分离纯化：用截留分子量为3kDa、10kDa的超滤膜对啤酒糟水解液进行超滤，压力为2～8bar，温度为30℃，分别获得分子量小于3kDa和分子量小于10kDa的两种组份，加入活性炭1.5～2.0g/100ml，脱色15～20min，过滤活性炭，即得到抗氧化肽溶液，经测定，滤液3kDa以下多肽含量为18.91mg/ml；10kDa以下多肽含量为22.17mg/ml；

6)啤酒糟中水不溶性膳食纤维的提取：将酶解后的料液进行分离，所得残渣经多次水洗干燥后即得不溶性膳食纤维。

啤酒糟多肽的抗氧化性测定

一、铁离子还原法(FRAP)测定抗氧化性

1、溶液的配制

1)40mmol/L盐酸(HCl)溶液：取HCl(12mol/L)0.1ml加水至30ml，置于避光处，备用；

2)0.3mol/L醋酸钠(NaAc)缓冲溶液：称取NaAc5.1 g，加冰醋酸(HOAc)20ml，用水稀释定容至250ml，置于避光处，备用；

3)10mmol/L三吡啶基三嗪(TPTZ)溶液：称取TPTZ样品31.233mg，用40mmol/L的HCl溶液定容至10ml，置于避光处，备用；

4)FRAP工作液：2.5ml 10mmol/L的TPTZ溶液，2.5ml20 mmol/L的氯化铁(FeCl₃·6H₂O)溶液和25ml 0.3mol/L的NaAc-HOAc缓冲液(pH3.6)混合均匀即得；

5)硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)标准溶液：称取0.278g FeSO₄·7H₂O，溶解并定容到100ml，此时浓度即为10.0mmol/L；

6)硫酸亚铁工作液：用移液管分别移取FeSO₄标准溶液2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL于100mL容量瓶中，分别用蒸馏水定容至刻度，摇匀，浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L；

硫酸亚铁溶液容易氧化产生三价铁盐，使溶液的颜色从最初的淡绿色逐渐转变为浅黄色，宜新鲜配制使用。如果发现溶液的颜色已经呈现明显的黄色，应该弃用该溶液，并重新配制。

2、标准曲线绘制：分别将0.1mL各浓度FeSO₄工作液加入5.0mL蒸馏水水中，再加入1.9mLFRAP工作液，37℃下水浴保温3-5min。以不加FeSO₄工作液的蒸馏水为空白对照，用10mm比色皿在593nm下测定吸光值。以FeSO₄浓度作为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3、总抗氧化能力的测定：将0.1mL待测样品加入5.0mL蒸馏水中，再向其中加入1.9mLFRAP工作液，37℃下水浴保温3-5min，在593nm下测定吸光值，根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。

3kDa过滤液的总还原能力为0.546mmolFeSO₄/L；10kDa过滤液相当于0.646mmolFeSO₄/L。

二、Folin-Ciocalteu比色法测定总酚含量

1、溶液配制

1)10％福林酚试剂：将10mL1 mol/L福林酚试剂转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容；

2)7.5％碳酸钠(Na₂CO₃)溶液：称取37.50g Na₂CO₃，加适量蒸馏水溶解，转移至500mL容量瓶中，用蒸馏水定容；

3)没食子酸(GAE)标准储备溶液：精密称取没食子酸标准品0.1g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，得到浓度为1.0mg/mL的标准液；

4)没食子酸工作液：用移液管分别移取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL的没食子酸标准储备溶液于100mL容量瓶中，分别用蒸馏水定容至刻度，摇匀，浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL。

2、标准曲线绘制：准确吸取没食子酸工作液1.0mL于10mL比色管内，分别加入0.1mol/L福林试剂5.0mL，混匀，在3-8min内加入4.0mL 7.5％的Na₂CO₃溶液，充分混合后定容，室温下避光放置60min。以不加标准液的蒸馏水为空白对照，用10mm比色皿在765nm下测定吸光值。以没食子酸浓度作为横坐标，以吸光度值最为纵坐标，绘制标准曲线。

3、总酚含量测定：用移液管移取待测样品各1.0mL于10mL比色管内，在每个试管内分别加人5.0mL的福林酚试剂摇匀。反应3-8min内，加入4.0mL7.5％碳酸钠溶液，加水定容至10mL，摇匀，室温下避光放置60min，在765nm波长条件下用分光光度计测定吸光度。

3kDa过滤液总酚含量相当于0.88mgGAE/mL；10kDa过滤液总酚含量相当于1.072mgGAE/mL。

三、铁***还原法测定抗氧化性

1、溶液配制

1)pH6.6，0.2mol磷酸盐缓冲液：称取7.164g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)和3.121g磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)分别溶于蒸馏水中，配成溶液各100mL，以37.5：62.5的比例混合即得；

2)1％铁***(K₃Fe(CN)₆)溶液：称取1g K₃Fe(CN)₆，蒸馏水定容至100mL；

3)0.1％三氯化铁(FeCl₃)溶液：称取FeCl₃0.1 g，蒸馏水定容至100mL；

4)10％三氯乙酸(TCA)溶液：称取TCA10 g，蒸馏水定容至100mL；

5)奎诺二甲基丙烯酸酯标准溶液：精密称取奎诺二甲基丙烯酸酯标准品0.15g，用无水乙醇溶解并定容至100mL，得到浓度为1.5mg/mL的标准液；

6)奎诺二甲基丙烯酸酯工作液：用移液管分别移取2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL的奎诺二甲基丙烯酸酯标准储备溶液于100mL容量瓶中，分别用无水乙醇定容至刻度，摇匀，浓度分别为30μg/mL、60μg/mL、90μg/mL、120μg/mL、150μg/mL。

2、标准曲线绘制：在2.5mLpH＝6.6磷酸缓冲溶液中准确加入不同浓度的奎诺二甲基丙烯酸酯标准溶液1.0mL，1％K₃Fe(CN)₆l.0mL，混匀，50℃恒温条件下加热20min；急速冷却，加2.5mL10％TCA，3500r/min离心10min。取上层清液5.0mL，加入5.0mL蒸馏水和1.0mL0.1％FeC1₃，混合均匀，静置10min。以无水乙醇为空白对照，用10mm比色皿在波长700mm下测吸光度值。以奎诺二甲基丙烯酸酯浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

3、总抗氧化能力的测定：在2.5mLpH＝6.6磷酸缓冲溶液中准确加入待测样品溶液1.0mL，1％K₃Fe(CN)₆l.0mL，混匀，50℃恒温条件下加热20min。急速冷却，加2.5mL10％TCA，3500r/min离心10min。取上层清液5.0mL，加入5.0mL双蒸水和1.0mL0.1％FeC1₃，混合均匀，静置10min后在波长700mm下测吸光度值，根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。

3kDa过滤液总抗氧化能力相当于1.375mg奎诺二甲基丙烯酸酯/mL；10kDa过滤液总抗氧化能力相当于1.511mg奎诺二甲基丙烯酸酯/mL。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。