阅读说明：本技术 一种鸭疫里氏杆菌高效价阳性血清的快速简便制备方法 (Rapid and simple preparation method of high-titer positive serum of riemerella anatipestifer ) 是由 孟照洁 翁立雪 赵杰 赵情 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种鸭疫里氏杆菌高效价阳性血清的快速简便制备方法,属于生物制品领域。包括以下步骤：1)培养基制备：培养基分为液体培养基和固体培养基；2)菌液制备；3)菌液灭活；4)免疫抗体制备；5)免疫；6)抗体滴度检测；7)特异性检测。该方法使用兔作为免疫对象,使用含有合适用量的鸭疫里氏杆菌的灭活抗原对其免疫,7天产生高免血清,试管凝集抗体可以达到1：16。(The invention relates to a rapid and simple preparation method of high-efficiency positive serum of riemerella anatipestifer, belonging to the field of biological products. The method comprises the following steps: 1) preparing a culture medium: the culture medium is divided into a liquid culture medium and a solid culture medium; 2) preparing a bacterial liquid; 3) inactivating bacterial liquid; 4) preparing immune antibodies; 5) immunization; 6) detecting the antibody titer; 7) and (4) detecting the specificity. The method uses a rabbit as an immune object, uses an inactivated antigen containing a proper amount of Riemerella anatipestifer to immunize the rabbit, generates high immune serum in 7 days, and can ensure that a test tube agglutination antibody reaches 1: 16.)

一种鸭疫里氏杆菌高效价阳性血清的快速简便制备方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，尤其涉及一种鸭疫里氏杆菌高效价阳性血清的快速简便制备方法。

背景技术

鸭疫里氏杆菌又称鸭传染性浆膜炎，是一种接触性、急性或慢性、败血性传染病。主要特征为纤维素性心包炎、纤维素性肝周炎、纤维素性气囊炎、干酪性输卵管炎、关节炎及麻痹。

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌引起的侵害鸭/鹅的一种慢性或急性败血性传染病。主要感染鸭、鹅，鸡及某些野禽也可感染。表现为精神沉郁，厌食，流泪，软脚，粪便稀且呈黄白色或绿色，偏头扭颈、转圈，间歇性抽搐，直至死亡。解剖可见心包液增多或与心外膜粘连，肝脏肿大，或表面多有纤维素性分泌物。发病死亡率一般为5%-80%，常引起雏鸭/鹅大批死亡以及导致鸭/鹅发育迟缓。四季均可发病，秋冬季节尤甚。以往治疗鸭传染性浆膜炎都是以药物为主，严重威胁食品安全，又由于国家禁抗令的发布。这对鸭传染性浆膜炎防控不得不回归到疫苗预防。

目前主要依靠将鸭疫里式杆菌制备成油乳剂疫苗，免疫SPF鸡，经过多次免疫，制备高免血清；缺点是周期长，实验动物为同源动物，容易出现非特异性凝集；疫苗乳化和制备相对繁琐。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种鸭疫里氏杆菌高效价阳性血清的快速简便制备方法，本发明通过制备高含菌量鸭疫里氏菌杆菌抗原，特殊方式免疫兔子，达到7天制备出高免鸭疫里氏菌杆菌血清的办法。

本发明是通过如下技术方案实现的，本发明一方面提供一种鸭疫里氏杆菌高效价阳性血清的快速简便制备方法，包括以下步骤：

1）培养基制备

培养基分为液体培养基和固体培养基；

2）菌液制备

将预制备血清的菌株接种固体培养基；

3）菌液灭活

将步骤2）所得混合菌液添加0.2%甲醛，放37℃摇床灭活24h，摇床速度控制在120r/min，灭活后进行灭活检验，确认无菌生长后，得到灭活菌液；

4）免疫抗体制备

将灭活后的菌液8000r/min，离心10min，去除上清，留下菌体，达到去除毒素和浓缩的效果，将菌体用生理盐水冲下，配置成1000亿cfu/mL的抗原液；

5）免疫

将制备好的抗原耳缘静脉接种雌兔，第一天接种0.5ml，第三天接种1ml，第5天接种1.5ml；

6）抗体滴度检测

分别于免疫后每次免疫后的第二天采集少量血清，使用试管凝集的方法检测出血清抗体滴度，大于等于1：16时心脏采血，收集血清；

7）特异性检测

将收集的血清与大肠杆菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌和免疫用鸭疫里氏杆菌做玻片凝集。

作为优选，步骤1）固体培养基采用常规方式：马丁培养基中添加5%大牛血清；液体培养基的基础液是马丁培养基，接菌前添加5%的大牛血清和B1，按照1万毫升培养液中添加0.1gB1。

作为优选，步骤2）在37℃5%二氧化碳培养基培养20h；调取菌种，配置成100亿cfu/ml的菌液，接种至液体培养基，按照5%比例添加，液体培养基的体积与容器的体积控制在1：5，放37℃摇床培养，速度控制在120r/min，培养17小时。

作为优选，步骤5）接种的雌兔的重量为2-3kg。

作为优选，步骤7）中大肠杆菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌为阴性，免疫用鸭疫里氏杆菌阳性。

本发明的有益效果为：

1 原有方法制备周期大约在45-60天，本发明制作周期在7-10天，大大缩短了制备周期。

2原有方法采用SPF鸡，同源动物，容易出现非特异***叉，本方法采用异源动物，避免了非特异***叉。

3 原有方法采用疫苗乳化制备方法制备疫苗后免疫，比较繁琐，需要专业设备，本发明不经乳化，直接免疫，操作简单，一般的实验室条件即可达成。

4 原有抗原扩繁方法，不经过发酵罐的含菌量低，经过发酵罐发酵的需要专业的发酵装置，本发明不需要发酵罐即可达到发酵的效果，操作简便。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

正如背景技术所介绍的，目前主要依靠将鸭疫里式杆菌制备成油乳剂疫苗，免疫SPF鸡，经过多次免疫，制备高免血清；缺点是周期长，实验动物为同源动物，容易出现非特异性凝集；疫苗乳化和制备相对繁琐。

实施例1，一种鸭疫里氏杆菌高效价阳性血清的快速简便制备方法，包括以下步骤：

1）培养基制备

培养基分为液体培养基和固体培养基；固体培养基采用常规方式：马丁培养基中添加5%大牛血清；液体培养基的基础液是马丁培养基，接菌前添加5%的大牛血清和B1，按照1万毫升培养液中添加0.1gB1；

2）菌液制备

将预制备血清的菌株接种固体培养基；在37℃5%二氧化碳培养基培养20h；调取菌种，配置成100亿cfu/ml的菌液，接种至液体培养基，按照5%比例添加，液体培养基的体积与容器的体积控制在1：5，放37℃摇床培养，速度控制在120r/min，培养17小时；

3）菌液灭活

将步骤2）所得混合菌液添加0.2%甲醛，放37℃摇床灭活24h，摇床速度控制在120r/min，灭活后进行灭活检验，确认无菌生长后，得到灭活菌液；

4）免疫抗体制备

将灭活后的菌液8000r/min，离心10min，去除上清，留下菌体，达到去除毒素和浓缩的效果，将菌体用生理盐水冲下，配置成1000亿cfu/mL的抗原液；

5）免疫

将制备好的抗原耳缘静脉接种2-3kg雌兔，第一天接种0.5ml，第三天接种1ml，第5天接种1.5ml；

6）抗体滴度检测

分别于免疫后每次免疫后的第二天采集少量血清，使用试管凝集的方法检测出血清抗体滴度，大于等于1：16时心脏采血，收集血清；

7）特异性检测

将收集的血清与大肠杆菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌和免疫用鸭疫里氏杆菌做玻片凝集；中大肠杆菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌为阴性，免疫用鸭疫里氏杆菌阳性。

原有方法制备周期大约在45-60天，本发明制作周期在7-10天，大大缩短了制备周期。

原有方法采用SPF鸡，同源动物，容易出现非特异***叉，本方法采用异源动物，避免了非特异***叉。

原有方法采用疫苗乳化制备方法制备疫苗后免疫，比较繁琐，需要专业设备，本发明不经乳化，直接免疫，操作简单，一般的实验室条件即可达成。

原有抗原扩繁方法，不经过发酵罐的含菌量低，经过发酵罐发酵的需要专业的发酵装置，本发明不需要发酵罐即可达到发酵的效果，操作简便。

当然，上述说明也并不仅限于上述举例，本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述；以上实施例仅用于说明本发明的技术方案并非是对本发明的限制，参照优选的实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换都不脱离本发明的宗旨，也应属于本发明的权利要求保护范围。