阅读说明：本技术 一种酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法 (Method for preparing lysine oligopeptide through enzyme catalysis and modifying lysine oligopeptide by monomethoxypolyethylene glycol ) 是由 蒋晓晓 廖小凤 尹韦蔚 高鹏 杨长林 王峰 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法,属于酶催化反应技术领域。其采用蛋白酶为催化剂催化合成酪氨酸寡肽,然后在寡聚酪氨酸寡肽的氨基末端接枝单甲氧基聚乙二醇,制备得到单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽。本发明方法涉及的聚肽合成步骤的催化剂为酶多相催化剂,具有反应条件温和、环境更友好、副反应少等优点,而且避免了繁琐的保护和去保护步骤,提供了一种应用前景良好的制备单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽的方法,其制备所得的赖氨酸寡肽条件温和、无污染,产率最高达35%。(The invention relates to a method for preparing lysine oligopeptide by enzyme catalysis and a method for modifying monomethoxy polyethylene glycol thereof, belonging to the technical field of enzyme catalysis reaction. The method comprises the steps of catalytically synthesizing tyrosine oligopeptide by using protease as a catalyst, and grafting monomethoxypolyethylene glycol to the amino terminal of the oligomeric tyrosine oligopeptide to prepare monomethoxypolyethylene glycol modified lysine oligopeptide. The catalyst in the polypeptide synthesis step related by the method is an enzyme heterogeneous catalyst, has the advantages of mild reaction conditions, more environment-friendly property, less side reaction and the like, avoids fussy protection and deprotection steps, and provides the method for preparing the monomethoxy polyethylene glycol modified lysine oligopeptide with good application prospect, the prepared lysine oligopeptide has mild conditions and no pollution, and the yield can reach as high as 35%.)

一种酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的 方法

技术领域

本发明涉及一种酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法，属于酶催化反应技术领域。

背景技术

人工聚肽是以天然氨基酸为单体进行聚合反应，通过酰胺键而形成的聚氨基化合物，性质与天然肽、聚氨基酸和蛋白质类似。由人工聚肽形成的材料具有良好的生物亲和性和可降解性。聚肽或其改性低聚物表现出自组装、液晶行为等独特结构性质，具有较强可塑性，在生物、医药和天然高分子材料领域具有很大的应用潜力。

赖氨酸聚肽的研究在国外特别是在日本已比较成熟，我国刚刚起步。它是一种天然的生物代谢产品。具有很好的杀菌能力和热稳定性，是具有优良防腐性能和巨大商业潜力的生物防腐剂。在日本，赖氨酸聚肽已被批准作为防腐剂添加于食品中，广泛用于方便米饭、湿熟面条、熟菜、海产品、酱类、酱油、鱼片和饼干的保鲜防腐中。同时还发现赖氨酸聚肽和其他天然抑菌剂配合使用，有明显的协同增效作用，可以提高其抑菌能力。

氨基酸聚合法有固相法、NCA法和酶催化法。与其它聚合方法相比，酶催化法具有反应条件温和、环境更友好、副反应少等优点，而且避免了繁琐的保护和去保护步骤。本发明拟采用蛋白酶为催化剂催化合成赖氨酸寡肽，并对赖氨酸寡肽进行单甲氧基聚乙二醇修饰，提高其亲水性。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种反应条件温和、环境更友好的酶催化制备赖氨酸寡肽及其甲氧基聚乙二醇修饰的方法。

本发明的技术方案，酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法具体包括（1）蛋白酶多相催化剂的制备；（2）赖氨酸寡肽的合成；（3）甲氧基聚乙二醇的修饰制备赖氨酸寡肽-单甲氧基聚乙二醇共聚物。

（1）蛋白酶多相催化剂的制备：将蛋白酶用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置成蛋白质溶液，在其中加入乙二醇二缩水甘油醚室温下搅拌反应，反应结束后离心收集沉淀，冷冻干燥，即制得蛋白酶多相催化剂。

具体步骤如下：将蛋白酶用磷酸缓冲液配置成质量百分比为5~20%的蛋白质溶液。在蛋白质溶液中加入乙二醇二缩水甘油醚后在室温下搅拌反应4～8小时。缓冲溶液中蛋白质与乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:20～1:50。反应结束后将反应液在300~5000rpm离心5~10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为蛋白酶多相催化剂。

所述蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的任一种。

所述磷酸缓冲液为0.1~0.2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸缓冲液的pH值为7.0~8.5。

（2）酶催化合成合成赖氨酸寡肽：在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中加入L-赖氨酸甲酯盐酸盐，叔丁醇和蛋白酶多相催化剂，混合反应后离心，去上清液采用冰乙醇醇提，离心取沉淀冷冻干燥后制得赖氨酸寡肽。

具体步骤如下：在5.0～10.0mL、pH值为5.5~8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中加入2～6g的L-赖氨酸甲酯盐酸盐和10～20U蛋白酶多相催化剂，再加入缓冲液体积分数30%～45%的叔丁醇，充分混合，置于恒温振荡器中以300~600rpm的转速在20～50℃下反应6～12小时；反应结束后，将反应混合物在在8000~10000rpm下离心2～4分钟，取上清液加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在8000~10000rpm下离心2～4分钟，沉淀冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。

所述磷酸缓冲液为0.1~0.2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸缓冲液的pH值为5.5~8.0。

所述叔丁醇的体积分数为30～45 %磷酸缓冲液。

（3）单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽的制备采用如下方法：在无水甲醇中加入赖氨酸寡肽、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、三乙胺，充分混合后在氮气保护下反应；静置过夜，减压抽滤，得到的滤液真空干燥，加入无水乙醇浸泡，离心，去除上清液加入到丙酮直至全部溶解；将所得溶液静置过夜，减压抽滤，所得沉淀即为产品单甲氧基聚乙二醇修饰的赖氨酸寡肽。

具体步骤如下：在20mL无水甲醇中加入10～20g的赖氨酸寡肽、12~40g单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯和60~240g三乙胺；反应混合物在氮气保护和30~50℃下反应10~24h；反应结束后，将反应混合物在0℃静置过夜，0～10KPa减压抽滤；将滤液在30℃下0～10KPa真空干燥2~6小时后，加入50~100mL无水乙醇浸泡7~12小时，8000~10000rpm离心2～4分钟，去除上清液，加入预热到30~40℃的丙酮直至全部溶解；将所得溶液在0℃静置过夜，0～10KPa减压抽滤，所得沉淀为单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽。

所述赖氨酸寡肽、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、乙胺的重量比为1:1.2:6～1: 2:12。

所述单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯中单甲氧基聚乙二醇的平均分子量为200、400、1000 Da。

采用1HNMR对单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽检测：使用AVANCEⅢ HD-400 MHz核磁共振谱仪，以CF3COOD为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标，在室温下测定共聚物的1HNMR谱图。

本发明的有益效果：本发明方法涉及的聚肽合成步骤的催化剂为酶多相催化剂，具有反应条件温和、环境更友好、副反应少等优点，而且避免了繁琐的保护和去保护步骤，提供了一种应用前景良好的制备单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽的方法，其制备所得的赖氨酸寡肽条件温和、无污染，产率最高达35%。

附图说明

图1是实施例1所得产物1HNMR检测图。

具体实施方式

以下实施例中的蛋白酶均购自上海沃凯生物技术有限公司，缓冲液购自南昌雨露实验器材有限公司，其他反应试剂均购自国药集团化学试剂有限公司或湖南华腾制药有限公司。

实施例1

（1）蛋白酶多相催化剂的制备：将菠萝蛋白酶用0.1M、pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置成质量百分比为5%的蛋白质溶液。在蛋白质溶液中加入乙二醇二缩水甘油醚后在室温下搅拌反应4小时。缓冲溶液中蛋白质与乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:20。反应结束后将反应液在300rpm离心10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为蛋白酶多相催化剂。

（2）酶催化合成合成赖氨酸寡肽：在5.0 mL、0.1M、pH5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中加入0.5g的L-赖氨酸甲酯盐酸盐、叔丁醇和10U蛋白酶多相催化剂。叔丁醇的体积分数为30%磷酸缓冲液。反应混合物置于恒温振荡器中(300rpm)在20℃下反应12小时。反应结束后，将反应混合物在在10000rpm下离心3分钟，取上清液加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在10000rpm下离心3分钟，沉淀冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。

（3）单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽的制备：在20mL无水甲醇中加入10g的赖氨酸寡肽、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、三乙胺。赖氨酸寡肽、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、三乙胺的重量比为1: 1.2:6。单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯分子中甲氧基聚乙二醇的平均分子量为200Da。反应混合物在氮气保护、30℃下反应10h。将反应混合物在0℃静置过夜，减压抽滤。将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入50mL无水乙醇浸泡12小时，离心（10000 rpm）3分钟，去除上清液，加入预热到40℃的丙酮直至全部溶解。将所得溶液在0℃静置过夜，0～10KPa减压抽滤，所得沉淀为单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽，产率为15 %。

通过1HNMR手段检测单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽，具体如图1所示，图中a处为聚乙二醇单甲醚链段中-CH₃上的氢化学位移峰；e处为赖氨酸寡肽甲基（-OCH3）上的氢化学位移峰。通过两者积分面积的比例得到取代度为1.01。

实施例2

蛋白酶多相催化剂的制备：将木瓜蛋白酶用0.15M、pH8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置成质量百分比为15 %的蛋白质溶液。在蛋白质溶液中加入乙二醇二缩水甘油醚后在室温下搅拌反应6小时。缓冲溶液中蛋白质与乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:30。反应结束后将反应液在300 rpm离心10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为蛋白酶多相催化剂。

酶催化合成合成赖氨酸寡肽：在8.0mL、0.15M、pH7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中加入5g的L-赖氨酸甲酯盐酸盐、叔丁醇（国药集团化学试剂有限公司）和15U蛋白酶多相催化剂。叔丁醇的体积分数为40 %磷酸缓冲液。反应混合物置于恒温振荡器中(300rpm)在40℃下反应10小时。反应结束后，将反应混合物在在10000 rpm下离心3分钟，取上清液加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在10000 rpm下离心3分钟，沉淀冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。

单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽的制备：在20mL无水甲醇中加入20 g 的赖氨酸寡肽、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、三乙胺。赖氨酸寡肽、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、三乙胺的重量比为1: 2:12。单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯分子中单甲氧基聚乙二醇的平均分子量为400 Da。反应混合物在氮气保护、50℃下反应24 h。将反应混合物在0℃静置过夜，减压抽滤。将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入50mL无水乙醇浸泡12小时，离心（10000 rpm）3分钟，去除上清液，加入预热到40℃的丙酮直至全部溶解。将所得溶液在0℃静置过夜，0～10KPa减压抽滤，所得沉淀为单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽，产率为25 %。

通过1HNMR手段检测单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽，为1.06。

实施例3

蛋白酶多相催化剂的制备：将中性蛋白酶用0.2M、pH8.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置成质量百分比为20 %的蛋白质溶液。在蛋白质溶液中加入乙二醇二缩水甘油醚后在室温下搅拌反应8小时。缓冲溶液中蛋白质与乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:50。反应结束后将反应液在300rpm离心5分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为蛋白酶多相催化剂。

酶催化合成合成赖氨酸寡肽：在10.0mL、0.2M、pH8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中加入6g 的L-赖氨酸甲酯盐酸盐、叔丁醇和20 U蛋白酶多相催化剂。叔丁醇的体积分数为45%磷酸缓冲液。反应混合物置于恒温振荡器中(300rpm)在50℃下反应6小时。反应结束后，将反应混合物在在10000rpm下离心3分钟，取上清液加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在10000rpm下离心3分钟，沉淀冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。

单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽的制备：在20mL无水甲醇中加入15 g 的赖氨酸寡肽、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、三乙胺。赖氨酸寡肽、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、三乙胺的重量比为1: 2:8。单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯分子中单甲氧基聚乙二醇的平均分子量为1000 Da。反应混合物在氮气保护、40℃下反应20 h。将反应混合物在0℃静置过夜，减压抽滤。将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入50mL无水乙醇浸泡12小时，离心（10000 rpm）3分钟，去除上清液，加入预热到40℃的丙酮直至全部溶解。将所得溶液在0℃静置过夜，0～10KPa减压抽滤，所得沉淀为单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽，产率为35 %。

通过1HNMR手段检测单甲氧基聚乙二醇修饰赖氨酸寡肽，为1.1。