一种倍半萜二聚体化合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种倍半萜二聚体化合物及其制备方法和应用 (Sesquiterpene dimer compound and preparation method and application thereof ) 是由 周旭东 郭婷婷 周建红 曹宏伟 盛文兵 汤红霞 于 2021-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种倍半萜二聚体化合物及其制备方法和应用,通过对大籽蒿的地上部分药材进行提取分离、系统化学成分研究和炎症的抑制评价。研究结果表明,该倍半萜二聚体化合物具有良好的抗炎活性,且高效低毒,可用于制备具有预防和治疗神经退行性疾病作用的药物和保健食品。(The invention discloses a sesquiterpene dimer compound and a preparation method and application thereof, which are characterized in that the above-ground medicinal materials of artemisia sieversiana are extracted and separated, the chemical components of the system are researched, and the inhibition and evaluation of inflammation are carried out. Research results show that the sesquiterpene dimer compound has good anti-inflammatory activity, high efficiency and low toxicity, and can be used for preparing medicines and health-care foods with the effects of preventing and treating neurodegenerative diseases.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种天然药物化合物，更具体地，涉及一种倍半萜二聚体化合物及其制备方法和应用。
背景技术
大籽蒿(Artemisia sieversiana)，又名白蒿、蘩母、由胡、蓬蒿，为菊科蒿属草本植物。
大籽蒿味甘、性平、无毒，是中医蒙医临床应用多年的传统民间用药，具有清热利湿、凉血止血的功效；用于肺热咳喘，咽喉肿痛，湿热黄疸，热痢，淋病，风湿痹痛，吐血，咯血，外伤出血，疥癞恶疮。
炎症是指当生物体的组织及细胞受到病菌、有害刺激或物理损伤时所发生的防御反应，其局部的临床症状是红肿、疼痛和功能性障碍；炎症是很多急慢性疾病的致病因素之一，如感冒、各种慢性疼痛、病毒感染类疾病、风湿性关节炎、阿尔兹海默症、心脑血管疾病等，均有炎症参与。
因此，抗炎药物在临床上具有广泛的用途；几千年的中医临床实践证明，很多中药具有不同的抗炎作用。
来源于天然药物的抗炎新药研究越来越受到人们的重视，同时也是抗炎药物发现的重要途径之一。
发明内容
本发明提供了一种倍半萜二聚体化合物及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种倍半萜二聚体化合物，其结构式如下：
本发明另一方面提供了上述倍半萜二聚体化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、取大籽蒿的地上部分药材粉碎后采用溶剂提取，回收提取液并减压浓缩，得提取物浸膏；
S2、将步骤S1所得提取物浸膏分散于水中，采用与水不相混溶的有机溶剂萃取，回收溶剂萃取物；
S3、将步骤S2所得溶剂萃取物，上硅胶柱，以石油醚∶乙酸乙酯按体积比为9∶0至0∶9的比例依次梯度洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并得到流份I-VI；
S4、将步骤S3中的流份III上硅胶柱，以正己烷∶乙酸乙酯按体积比为10∶1至0∶10的比例依次梯度洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并得到流份F1-F15；
S5、将步骤S4中的流份F10用体积比1∶1的甲醇和二氯甲烷的混合物作为溶剂溶解，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以体积比为1∶1的甲醇∶二氯甲烷为流动相进行洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并得到流份A-J；
S6、将步骤S5中的流份E和F合并，用甲醇完全溶解后，进行ODS反相柱色谱分离，以甲醇∶水按体积比为40∶60至90∶10的比例依次梯度洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并得到流份a-1；
S7、取步骤S6中的流份h，用甲醇氯仿溶剂体系溶解后重结晶，收集白色针状结晶物，即得。
在上述技术方案中，在步骤S3中，将石油醚∶乙酸乙酯依次按体积比为9∶0、5∶1、9∶3、9∶9和0∶9进行梯度洗脱。
具体地，上述萃取物的成分众多且类型复杂，可根据其化合物极性的差异，通过优化步骤S3中的梯度洗脱条件(具体为石油醚∶乙酸乙酯的体积比)，将各个类型的成分进行粗分开来；并利用薄层色谱技术将含有该化合物的流分进行追踪。
在上述技术方案中，在步骤S4中，将正己烷∶乙酸乙酯依次按体积比为10∶1、5∶1、3∶1和0∶10进行梯度洗脱。
具体地，由于该化合物极性与部分倍半萜类成分具有相似性，仅通过步骤S3难以从极性差异上将其分离出来；但是，由于倍半萜二聚体分子量较大，与常规化合物如倍半萜和黄酮类的差异明显，因此，再采用步骤S5中的凝胶色谱(Sephadex LH-20)技术，可从分子量差异层面上对该类化合物进行富集和精分。
在上述技术方案中，在步骤S6中，将甲醇∶水依次按体积比为40∶60、50∶50、70∶30和90∶10进行梯度洗脱。
具体地，由于其成分极性相对不大，在反相色谱中有相当的保留性，同时，反相色谱填料柱效相对更高，因此，在步骤S6中采用反相色谱技术对其进行再次精分。
在上述技术方案中，在步骤S1中，在提取的过程中，所述溶剂为乙醇水溶液。
优选地，在上述技术方案中，在步骤S1中，所述提取的过程包括，按固液比为1g∶10mL的比例加入95wt％的乙醇水溶液，加热回流提取2-3h后过滤，重复2-4次后，合并滤液。
具体地，上述提取的过程可以尽可能将该成分从植物体中提取出来，且该提取溶剂绿色环保，易于回收。
详细地，在上述技术方案中，由于乙醇提取物的成分众多且类型复杂，且包含各个极性段的成分，通过不同极性溶剂的萃取，可对提取物中不同极性段的成分进行初步分离；同时，由于倍半萜二聚体类成分极性较小，其可将该类成分初步富集在低极性溶剂萃取部位，有利于后续的化合物精分。
本发明又一方面还提供了一种药物组合物，包括上述倍半萜二聚体化合物和药学上可接受的辅料。
本发明再一方面提供了上述倍半萜二聚体化合物和上述药物组合物在制备抗炎药物、预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用。
详细地，在上述技术方案中，所述抗炎药物为抑制脂多糖LPS诱导的神经胶质瘤BV-2细胞NO释放的活性的药物。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明公开了一种新颖的愈创木烷内酯型倍半萜二聚体，其通过一个四元环将两个单体愈创木烷内酯连接起来，导致其具有高度的对称性，是一种新的化学结构骨架；
(2)本发明公开的化合物对脂多糖(LPS)诱导的神经胶质瘤BV-2细胞NO释放显示出较好的抑制活性，其IC50值为20.6μM，即该倍半萜二聚体具有良好的抗炎活性，且具有高效、低毒的特点，可用于制备具有预防和治疗神经退行性疾病作用的药物或者保健食品，并对充分开发利用大籽蒿资源提供一定的科学依据。
附图说明
图1为本发明实施例中倍半萜二聚体化合物的结构图；
图2为本发明实施例中倍半萜二聚体化合物的1H NMR谱；
图3为本发明实施例中倍半萜二聚体化合物的13C NMR谱；
图4为本发明实施例中倍半萜二聚体化合物的X-ray单晶衍射信息；
图5为本发明实施例中倍半萜二聚体化合物的X-ray单晶衍射实验所得的结构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。
本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一种倍半萜二聚体化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、取大籽蒿地上部分药材原料，捡净，阴干，粉碎，按质量体积比为1g∶10mL的比例加入95wt％的乙醇水溶液，加热回流提取3次，每次2-3h，提取液过滤，合并3次滤液，将滤液减压浓缩至无醇味，得浸膏；
S2、向浸膏加入3倍质量的水，将浸膏分散悬浮于水中，再加入等体积的石油醚萃取3次，去除石油醚层后，向水层再加入等体积的二氯甲烷，搅拌混匀，萃取，静置(1h)，放出下半层二氯甲烷萃取液，减压回收溶剂，得到二氯甲烷萃取部位。如此重复3次，合并二氯甲烷萃取部位，将二氯甲烷萃取部位浓缩干燥；
S3、将二氯甲烷萃取部位与正向硅胶(100-200目)1∶1混合拌样，进行正向硅胶柱色谱分离，样品和装柱硅胶(200-300目)比例为1∶20，以流动相石油醚∶乙酸乙酯(9∶0)、石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)、石油醚∶乙酸乙酯(9∶3)、石油醚∶乙酸乙酯(9∶9)、石油醚∶乙酸乙酯(0∶9)依次梯队洗脱，经硅胶薄层色谱检识合并得到6个流份I-VI；
S4、将步骤S3中的流份III与正向硅胶(100-200目)1∶1混合拌样，进行正向硅胶柱色谱分离，样品和装柱硅胶(200-300目)比例为1∶20，以流动相正己烷∶乙酸乙酯(10∶1)、正己烷∶乙酸乙酯(5∶1)、正己烷∶乙酸乙酯(3∶1)、正己烷∶乙酸乙酯(0∶10)依次梯队洗脱，经硅胶薄层色谱检识合并得到15个流份F1-F15；
S5、将步骤S4中的流份F10用体积比1∶1的甲醇和二氯甲烷的混合物作为溶剂溶解，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以体积比为1∶1的甲醇∶二氯甲烷为流动相进行洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并得到10个流份A-J；
S6、将步骤S5中的流份E和F合并，用甲醇完全溶解后，进行ODS反相柱色谱分离，以甲醇∶水(40∶60)、甲醇∶水(50∶50)、甲醇∶水(70∶30)、甲醇∶水(90∶10)为流动相进行梯度洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并得到12个流份a-1；
S7、取步骤S6中的流份h，用甲醇氯仿溶剂体系溶解后重结晶，收集白色针状结晶物，即得。
如表1所示为所制得的倍半萜二聚体化合物的1H和13C NMR信号归属。可以看出，该化合物1H-NMR谱(表1和图2)显示三个甲基信号，两个为单峰，δH 1.27(3H，s，H-14)和2.07(3H，s，H-15)；剩下一个甲基为二重峰，δH 1.10(3H，d，J＝7.7Hz，H-13)；在相对低场区，还出现了一个连氧质子信号，δH 3.57(1H，brt，J＝10.0Hz，H-6)。该化合物13C-NMR谱(表1和图2)显示一共15个碳信号，结合HSQC谱可以知道，其结构中包括3个甲基(δC 10.7，18.1，20.7)，2个亚甲基(δC 20.9，34.4)，5个次甲基(δC 10.7，18.1，20.7)以及5个季碳信号(δC45.3，65.6，178.6，178.6，207.9)。值得注意的是，双键4位上的碳化学位移与酯基12位的完全重叠，均为δC 178.6；季碳信号中包含一个酮羰基(δC 207.9)和一个酯基信号(δC178.6)。综合以上，初步判断该化合物为倍半萜内酯类成分。
表1.亭亭素的1H和13C NMR信号归属(δin ppm，J in Hz)
1H-1H COSY谱中，H-5/H-6/H-7/H-8/H-9之间的相关，结合HMBC中H-6/C-1、C-8和H-14/C-10、C-9、C-1的远程相关关系确定了七元环结构；同时，H-6/H-7/H-11/H-13之间的1H-1H COSY相关，以及H-13到C-7、C-12，H-6到C-12的HMBC相关点确定了一个五元内酯环的结构；至此，还剩下4个碳信号，包括一个甲基、一个羰基和一对双键信号，推测是通过与B环共用C-1和C-5形成的五元环结构A，并且得到了H-3到C-1、C-5和H-15到C-3、C-5的HMBC相关的确定，至此基本确定了该化合物的平面结构；最后，通过X-ray单晶衍射实验(见图4和图5)完全确证了该化合物为一个具有高度对称性的倍半萜二聚体，由于其高度对称性，左右两部分的1H NMR和13C NMR核磁信号完全重叠。
实施例2抗炎活性测试
1.细胞及试剂
BV-2细胞(购自北京协和医科大学)，并培养于10％特优级胎牛血清(FBS，Hyclone)的DEME培养基中，培养液添加浓度均为100U/mL的青霉素和链霉素，并置于包含有95％空气和5％CO2的培养箱中37℃恒温培养。实验用细胞处于对数生长期。培养液中NO含量测定使用一氧化氮测试盒(南京建成生物工程研究所)，根据说明书使用亚硝酸钠标准液制备标准曲线。
2.实验样品及配制方法
实验用所有化合物均配制成浓度为10mM的DMSO贮备溶液。
3.实验方法
NO极不稳定，很容易被氧化成硝酸盐或者亚硝酸盐，后二者遇硝酸盐显色剂可生成淡红色偶氮化合物，因此，可以采用Griess法测定样品中NO2的浓度，便可以间接反映NO浓度。
Griess试剂由试剂A和试剂B等体积现配制而成，试剂A：0.1％N-萘乙二胺盐酸盐；试剂B：5％H3PO4含1％对氨基苯磺酸酰胺。
用培养液(含10％FBS的DEME培养基)稀释被测化合物，将被测化合物稀释至50μM即为初筛浓度；取对数生长期细胞，并用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，将其配制成单细胞混悬液，并接种于96孔板，接种密度约为5×105cells/mL，在每孔加100μL BV-2细胞，然后在CO2培养箱中培养1小时，之后在每孔加入浓度为100 ng/mL的LPS、浓度为100units/mL的IFN-γ以及不同浓度的测试样品0.4μL，只加0.4μL DMSO作为空白对照组，同时设LPS/IFN-γ组(不加测试样品)，每个样品重复测试4次；然后，在5％CO2、37℃条件下继续培养24小时；洗去培养液上清100μL至酶标板中，加入等体积的Griess试剂，室温反应10min后测定其在波长540nm处的吸收值。
根据NO测试盒说明书，用浓度分别为50μM、25μM、20μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM的亚硝酸钠标准液绘制标准曲线，根据标准曲线计算细胞培养上清液中亚硝基(NO2-)的浓度以及对NO释放的抑制率。
在初筛结果的基础上，将化合物分别配制成浓度为50μM、25μM、12.5μM和6.5μM溶液，测定各浓度下的NO抑制率，按照中效方程计算各化合物对NO抑制的IC50值。
结果显示，其IC50值为20.6μM，即所制得的倍半萜二聚体具有良好的抗炎活性，且具有高效、低毒的特点，可用于制备具有预防和治疗神经退行性疾病作用的药物或者保健食品。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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