阅读说明：本技术 达托霉素在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用 (Application of daptomycin in preparation of medicine for treating rheumatoid arthritis ) 是由 梁淑芳 叶洋 朱璟 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及达托霉素的用途,具体涉及达托霉素在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用,属于生物药物技术领域。本发明解决的技术问题是提供达托霉素的新用途,即达托霉素在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。本发明首次创造性证实了达托霉素对类风湿关节炎的免疫调节活性和疗效,提供了达托霉素作为免疫调节剂治疗类风湿关节炎的新药用用途,为类风湿关节炎的治疗提供了一种全新的选择,应用前景广泛。(The invention relates to an application of daptomycin, in particular to an application of daptomycin in preparing a medicament for treating rheumatoid arthritis, belonging to the technical field of biological medicaments. The invention aims to provide a new application of daptomycin, namely an application of daptomycin in preparing a medicament for treating rheumatoid arthritis. The invention creatively proves the immunoregulation activity and curative effect of daptomycin on rheumatoid arthritis for the first time, provides new medicinal application of daptomycin serving as an immunomodulator to treat rheumatoid arthritis, provides a brand new choice for treating rheumatoid arthritis, and has wide application prospect.)

达托霉素在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及达托霉素的用途，具体涉及达托霉素在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用，属于生物药物技术领域。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜细胞增生，关节滑膜结构和功能异常病变为主要特征的慢性、全身性、自身免疫性疾病。据统计，RA在全球范围内患病率约为0.5％，其中我国发病率为0.3％-0.5％，女性发病率高于男性。由于RA是一种由遗传、细菌感染、内分泌失调、免疫调节失衡等多因素引起的疾病，发病机制较为复杂，尚不能根治。目前治疗措施有药物治疗、免疫净化、功能锻炼和外科治疗等。就药物治疗而言，使用的药物主要有非甾体类药物，抗风湿药物，生物制剂，甾体类药物等，这些药物能减轻RA患者的临床症状，消除关节局部的炎症反应，但也存在副作用。例如甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)，能延缓RA患者关节周围骨破坏进程和抑制滑膜炎性增生，但由于其毒副作用，尤其是在过量或长期使用的情况下而出现的肝毒性，使其临床疗效受限。因此，发展新的RA治疗药物是急需解决的重要课题和国民健康的重大需求。

达托霉素(Daptomycin，以下简称DAP)是由玫瑰孢链霉菌发酵产生的环脂肽类抗生素，通常采用生物发酵方法进行生产，相对生物制剂和小分子化合物来说简单易得，成本较低。DAP主要用于治疗革兰氏阳性菌感染，2003年由美国食药监局(FDA)批准治疗复杂性皮肤和皮肤结构感染、菌血症、右心感染性心内膜炎、脑膜炎、泌尿道感染相关疾病。DAP具有独特的抗菌作用机制，通过扰乱细菌细胞膜对氨基酸的转运，引起钠钾离子流失，阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成以此达到杀菌目的。可见，目前对DAP的研究多集中在抗菌及耐药方面，现有研究未见有DAP免疫作用机理及治疗RA的报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供达托霉素的新用途，即达托霉素在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。

通过研究发现，达托霉对类风湿关节炎具有免疫调节活性和疗效，可用于制备治疗类风湿关节炎的药物中。

优选的，所述药物的剂型为注射给药剂型。

本发明还提供一种治疗类风湿关节炎的药物。

本发明治疗类风湿关节炎的药物，其活性成分包含达托霉素和甲氨蝶呤。

作为优选方案，本发明治疗类风湿关节炎的药物，其活性成分仅为达托霉素和甲氨蝶呤。

优选的，达托霉素和甲氨蝶呤的质量比为10～30:1。

作为优选方案，达托霉素和甲氨蝶呤的质量比为20:1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次创造性证实了达托霉素对类风湿关节炎的免疫调节活性和疗效，提供了达托霉素作为免疫调节剂治疗类风湿关节炎的新药用用途，为类风湿关节炎的治疗提供了一种全新的选择，应用前景广泛。

附图说明

图1为不同浓度DAP对RAW264.7细胞的作用。

图2为细胞中各炎症因子的mRNA表达水平，其中，a-c为小鼠巨噬细胞模型，d-f为人单核细胞模型。

图3为细胞上清液中IL-1β和IL-6炎症因子的含量。

图4为DAP缓解胶原诱导的RA小鼠模型关节肿胀程度。其中，图4a为各组小鼠的体重，图4b为各组小鼠关节评分。

图5为各组小鼠血清中炎症因子MCP-1含量。

具体实施方式

RA患者的细菌感染风险高于非RA患者，细菌感染也是RA的发生发展机制之一。MTX作为治疗RA的一线小分子化学药也具有一定的免疫抑制作用，长期使用会增加RA患者的感染率和感染疾病(隐球菌病等常见的细菌感染、带状疱疹以及机会性感染)的严重程度。由于DAP主要是由肾脏代谢，不是由人体肝脏微粒体代谢。因此，与MTX相比，DAP对人体的肝毒性较小。

本发明通过体外细胞实验和动物实验两部分的研究发现，DAP对RA具有免疫调节活性和疗效，可用于制备治疗RA的药物中。

本发明DAP在治疗类风湿关节炎时，可以制备成静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射及腔内注射等多种注射给药剂型。

在治疗RA时，可以采用DAP，也可以将DAP与其他治疗RA的药物联合使用，可以通过同时、序贯或单独给予各种治疗成分可实现这种联合使用，达到治疗RA的目的。

本发明还提供一种治疗类风湿关节炎的药物。

本发明治疗类风湿关节炎的药物，其活性成分包含DAP和MTX。这种药物的活性成分可以为DAP、MTX以及其他的治疗RA的药物。

作为优选方案，本发明治疗类风湿关节炎的药物，其活性成分仅为DAP和MTX。

通过研究，优选的，DAP和MTX的质量比为10～30:1。

作为优选方案，DAP和MTX的质量比为20:1。

为了更好地理解本发明的实质，下面将用DAP的药理试验及结果来说明其在制备治疗类风湿性关节炎中的新用途。

1、实验材料

1.1、细胞来源

小鼠巨噬细胞RAW264.7：源自ATCC，保存于四川大学生物治疗国家重点实验室。

人单核细胞THP-1：源自ATCC，保存于四川大学生物治疗国家重点实验室。

1.2、试剂来源

细胞培养液DMEM，细胞培养液RPM11640，胎牛血清(FBS)，消化液胰酶(Trypsin)购自Hyclone。

脂多糖：购自Sigma-Aldrich公司。

BCA蛋白定量试剂：购自碧云天生物技术有限公司。

反转录试剂盒(iScript cDNA Synthesis Kit)，购自Bio-Rad。

qPCR荧光定量试剂盒(SsoAdvanced SYBR GreenSupermix)：购自Bio-Rad。

鼠TNF-αELISA检测试剂盒，鼠IL-6ELISA检测试剂盒，鼠IL-1βELISA检测试剂盒均购自北京达科为公司。

完全弗氏佐剂(Complete freund’s adjuvant)，不完全弗氏佐剂(Incompletefreund’s adjuvant)，二型牛胶原(Immunization grade bovine typeⅡcollagensolution)均购自Chondrex公司。

DBA/1J(N000219)小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司。

CBA Flex Set多因子检测试剂盒购自BD Biosciences公司。

达托霉素(DAP)购自大连美仑公司。

甲氨蝶呤(MTX)购自Sigma-Aldrich公司。

2、体外细胞实验

(1)MTS法检测DAP对RAW264.7的细胞毒性：

Ⅰ、收集对数期的RAW264.7细胞，调整细胞悬液浓度，使96孔板每孔的细胞密度为5000个，每孔加入200μL DMEM培养基，边缘孔用无菌PBS填充。

Ⅱ、96孔板于37℃，5％CO2培养箱中培养24h，加入浓度梯度的DAP，共设置8个浓度，分别为0、1、3、5、20、50、150和500ug/ml，以上每一浓度均设置3个复孔。

Ⅲ、96孔板于37℃，5％CO₂培养箱中分别培养24h、48h、72h，倒置显微镜下观察细胞生长状态。

Ⅵ、每孔加入10ul MTS溶液，在细胞培养箱内继续孵育2小时，酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，其结果见图1。

结果表明，在LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型中，1-5μg/ml的DAP不会影响细胞的正常生长。所以我们选取3μg/ml，5ug/ml两个浓度进行后续实验。

(2)以小鼠巨噬细胞RAW264.7和人单核细胞THP-1为供试细胞株，LPS诱导浓度为1ug/mL，选取3ug/ml，5ug/ml的DAP药物浓度为测试浓度，阳性药物对照组为MTX，设置空白对照组，待LPS刺激细胞5h后，分别给予3ug/ml，5ug/ml DAP及阳性药物MTX 0.45ug/ml处理24h，分别收集上清液和细胞。

(3)用RNA提取试剂盒提取受试细胞RNA，反转录后q-PCR检测各炎症因子相应的mRNA水平，其结果见图2。

图2表明DAP对LPS诱导的免疫细胞炎症有显著抑制作用。由图可知，与正常细胞(对照组，control)相比，LPS模型组TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平较高，说明细胞模型建立成功。与LPS模型组相比，3μg/ml、5ug/ml的DAP对小鼠巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平具有显著抑制作用(图2a-c)。此外，以LPS诱导的人单核细胞THP-1细胞来源的巨噬细胞为模型，0.45ug/ml MTX对TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平具有显著抑制作用，3μg/ml、5ug/ml的DAP对TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平具有显著抑制作用，而且与阳性药物MTX组的抑制作用无显著差异(图2d-f)。

(4)用ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的含量，其结果见图3。

图3表明DAP降低LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症模型中促炎因子IL-1β、IL-6含量。ELISA结果表明，与LPS模型组相比，5μg/ml的DAP可减少细胞中IL-1β、IL-6的分泌。

上述结果表明，DAP具有较好的抗炎作用。

3、动物实验

(1)造模剂的准备

牛II型胶原乙酸溶液与完全弗氏佐剂等体积充分混匀、完全乳化(4℃乳化)，标记为造模剂1；牛II型胶原乙酸溶液与不完全弗氏佐剂等体积充分混匀、完全乳化，标记为造模剂2。

(2)造模

小鼠尾根部1-2cm处皮内注射100μl造模剂1，对照组注射等体积完全弗氏佐剂。将注射当日记为第0d，21d后，用等体积造模剂2进行第二次造模，对照组注射等体积不完全佐剂。再一周(即28d)后，小鼠后爪开始出现红肿、行动迟缓，标志RA动物模型建立成功。病症可持续2月。

(3)观察

第二次造模后，观察小鼠的精神状态、食欲和活动情况；关节炎的轻重程度以第二次造模(第21d)开始的关节炎指数进行评估，每3d测量一次，临床关节炎评分标准：无症状-0分，一趾明显肿胀发红-1分，肢体轻度肿胀或两趾以上肿胀-2分，肢体有明显肿胀及红斑-3分，肢体重度肿胀及红斑，强直-4分。

(4)动物分组及给药

将建模成功的小鼠随机平均分为5组，每组4-5只，饲养环境：22±1℃、12h光照/12h黑暗循环。所有操作严格按照国家健康卫生准则执行。①对照组(Normal)：建模时只注射佐剂，不使用药物干预，只注射溶剂；②模型组(CIA)：已建成RA动物模型，不使用药物干预，只注射溶剂；③MTX组：注射0.5mg/kg的阳性对照药物MTX每3天注射一次；④-⑤DAP处理组：根据细胞实验结果及文献，设置DAP大剂量组10mg/kg、小剂量组6mg/kg每隔1天注射一次；⑥DAP+MTX联合用药组(MTX 0.5mg/kg+DAP 10mg/kg),MTX每3天注射一次，DAP每隔一天注射一次。

(5)RA小鼠模型关节肿胀程度评估

检测各阶段小鼠体重(21天和75天)，其结果见图4a，从图4a可以看出，自第二次免疫后，RA小鼠体重变化不大，说明RA模型并不显著影响小鼠的体重。

用模型小鼠关节评分变化来反映RA模型小鼠的建立以及DAP对RA模型建立的影响。图4b为记录动物模型关节评分，从结果中可以看出，CIA模型小鼠出现明显红肿，疼痛及关节活动受限等典型的RA症状，表明模型建立成功。与CIA模型组相比较，DAP(6mg/kg)组无显著差异，而DAP(10mg/kg)组、阳性药物MTX(0.5mg/kg)处理组以及联合用药组小鼠评分较CIA模型组均有明显降低，同时联合用药组较MTX单药组评分低，并且小鼠脚趾红肿程度增长缓慢，持续治疗后，部分脚趾能观察到红肿缓解，说明DAP(10mg/kg)组对于关节炎症状有显著抑制作用，并且与阳性药物MTX组抑制作用无显著差异。由此可见，持续大剂量DAP治疗或者MTX与DAP联合用药均能缓解RA小鼠关节肿胀。

(6)流式液相多重蛋白定量技术检测血清中炎症因子含量变化

在给药5周时从实验小鼠眼眶分别取血，收集血样，室温静置30min后，3000rpm离心15min，取上清液，用小鼠血清多因子检测试剂盒检测血清中MCP-1等炎症因子含量，以分析评估模型和待测物治疗效果，其步骤如下：

1)清洗仪器，通过仪器质控微球进行仪器相关功能检测，确保PE通道、APC通道和APC-Cy7通道功能正常。

2)标准品制备，将所有标准品冻干微球倒入同一个试管内，4ml稀释液稀释标准品，轻柔混匀，不能剧烈涡旋混匀，混匀后静置15分钟。

3)将最高浓度标准品用稀释液连续倍比稀释。

4)制备捕获微球：确定实验所需稀释的捕获微球总量，每个反应需要50μL稀释的捕获微球。确定每种捕获微球的需要量，试剂盒提供的捕获微球1.0μL/样本。确定所需捕获微球稀释液体积，混匀捕获微球转移到新的试管中，标记为混合微球。

5)制备检测抗体:确定所需稀释的PE检测试剂的体积,标记为混合后的PE检测试剂。

6)在每管中加入50μL混合微球。分别在各管中加入50μL相应的标准品或样品。混匀，室温避光孵育1小时。在每个管中加入50μL混合后的PE检测试剂。轻轻混匀室温孵育1小时。

7)在每个管中加1.0mL洗液，300g离心5分钟,小心吸去上清,每管加入300ul洗液重悬微球。上机分析，导出FCS数据文件，用FCAP软件进行分析。其结果见图5。

通过小鼠血清的多因子检测实验证明，在胶原诱导的RA模型中，CIA模型组MCP-1含量显著升高，说明CIA模型建立成功。与CIA模型组相比，DAP(6mg/kg)组MCP-1含量无明显差异，而DAP(10mg/kg)组与和阳性药物MTX(0.5mg/kg)处理组较CIA模型组都有显著差异，并且DAP与MTX联用组的MCP-1含量较CIA模型组也有显著差异，说明DAP(10mg/kg)可降低小鼠血清MCP-1的含量，且与阳性药物MTX(0.5mg/kg)组抗炎效果相当(图5)。MCP-1是重要的促炎细胞因子，在RA的发生和发展过程中发挥重要作用。而10mg/kg DAP可以减少其分泌，缓解炎症进展。

综上，DAP可减轻RA小鼠发病程度。

可见，本发明拓展了DAP的新药理活性，发现其能在一定程度上缓解关节炎病症，同时防治关节炎治疗中出现的严重感染，进而起到缓解RA的目的，为RA的治疗提供了一种全新的选择。