具体实施方式

以下，更详细地说明本发明。

如上所述，试图抑制肾病患者的腹膜纤维化，不仅可以抑制进展为导致社会-经济损失的慢性肾病，并被认为式可确定肾脏替代疗法的持续性的重要问题，因此迫切需要研发其的治疗剂。

因此，本发明人确认CHP(Cyclo-His Pro)在诱导腹膜纤维化的动物模型中显示出抑制腹膜的上皮间充质转化、抑制腹膜的细胞凋亡或免疫细胞浸润至腹膜的效果，可有效治疗腹膜纤维化，从而完成了本发明。

由此，本发明提供包含CHP或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗腹膜纤维化的药学组合物和/或包含CHP或其食品上可接受的盐的用于预防或改善腹膜纤维化的保健功能食品组合物。

在本发明中，“CHP(Cyclo-HisPro)”为由作为促甲状腺激素释放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)的代谢产物的组氨酸-脯氨酸组成的天然存在的环状二肽(dipeptide)或通过促甲状腺激素释放激素代谢过程和de novo在体内合成的生理活性二肽，是指广泛分布在整个大脑和脊髓及胃肠道等的物质。

在本发明的组合物中，上述CHP可使用合成的或市售的。并且，可从包含CHP的物质，如前列腺提取物及大豆水解物等纯化来使用。

使用的术语“纯化”是指CHP与可从如前列腺提取物的天然来源获取的形式相比，呈浓缩的形式。纯化的成分可从它们的天然来源浓缩或者通过化学合成方法获取。

在本发明中，“腹膜纤维化”是指腹膜呈纤维化的状态，是指在腹膜异常形成纤维细胞，例如，意味着包括腹膜后纤维化或包裹性腹膜硬化症，但并不限定于此。例如，腹膜的纤维化可通过透析发生。

在本发明的用于预防、改善或治疗腹膜纤维化的组合物中，CHP、其药学上可接受的盐或其食品上可接受的盐可显示出选自由抑制腹膜的上皮间充质转化、抑制腹膜的细胞凋亡或免疫细胞浸润至腹膜组成的组中的一种以上的效果。

在本发明中，术语“上皮间充质转化”是指上皮细胞表型转化为间充质细胞。具体地，上皮间充质转化为细胞之间的结合松动且细胞骨骼发生变化而使组织获得运动性的现象，是指细胞失去原来的细胞表型且转换为间充质细胞的表型。若诱导上皮间充质转化，则可导致成纤维细胞的积累，上皮间充质转化的诱导被认为是腹膜纤维化的重要机制。

由此，在本发明的一具体实施例中，在腹膜纤维化动物模型中确认根据给药CHP的如E-钙粘蛋白及α平滑肌肌动蛋白的上皮间充质转化标志物的表达变化，由此评价抗纤维效果。如图3a、图3c及图4c中所确认，CHP在腹膜组织中抑制纤维化的标志物即α平滑肌肌动蛋白的表达，增加细胞突触标志物即E-钙粘蛋白的表达，结果可知通过抑制腹膜的上皮间充质转化来显示出抗纤维效果。

在本发明的再一具体实施例中，为了在诱导腹膜纤维化的动物模型中评价根据给药CHP的腹膜的细胞凋亡，确认了细胞凋亡标志物即p16及p21的表达变化。如图3a、图3d、图3e及图4b中所确认，CHP处理组中的p16及p21的表达显著减少，由此可知细胞凋亡被抑制。

术语“纤维化(fibrosis)”指代将成纤维细胞的调节障碍性增殖或活性、纤连蛋白的异常积累和/或胶原组织的病理或过度积累为特征的病症、疾病或障碍。

因此，本发明的具体另一实施例中，在诱导腹膜纤维化的动物模型中，确认根据给药CHP的胶原1的表达变化，由此评价抗纤维效果。如图1(天狼星红染色结果)、图3a、图3b及图4a中所确认，CHP显著减少因纤维化诱导增加的胶原1的表达，由此可知显示出优秀的抗纤维效果。

在本发明的具体还有一实施例中，在诱导腹膜纤维化的动物模型中，确认根据给药CHP的免疫细胞的浸润程度，由此评价腹膜纤维化治疗效果。如图1(碘酸雪夫氏染色结果)及图2中所确认，CHP浓度依赖性地减少因诱导纤维化而增加的免疫细胞的沉积，减少诱发初始免疫反应的细胞间粘附分子-1(ICAM-1，Intercellular Adhesion Molecule 1)的表达量，减少巨噬细胞(macrophage)和树突细胞的标志物即f4/80阳性细胞的表达量，由此迅速减少免疫细胞的浸润。由此，可知CHP通过减少免疫细胞的浸润来妨碍腹膜纤维化的进展。

在本发明的用于预防、改善或治疗腹膜纤维化的组合物中，术语“预防”、“改善”和/或“治疗”是指所有抑制或延缓疾病或病症的行为、所有使疾病或病症状态好转或有益地改变的行为及所有延缓、停止、逆转疾病或病症的进展的行为。

在本申请中，术语“药学上可接受的”是指在生理上可接受且向人体给药时通常不会引起过敏反应或其相似反应，优选地，上述盐为通过药学上可接受的游离酸(free acid)形成的酸加成盐。

上述药剂学上可接受的盐可以为利用有机酸或无机酸形成的酸加成盐，上述有机酸包括例如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、丁酸、异丁酸、三氟乙酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、琥珀酸单酰胺、谷氨酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、乙醇酸、葡糖醛酸、抗坏血酸、苯甲酸、邻苯二甲酸、水杨酸、邻氨基苯甲酸、二氯乙酸、氨氧基乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸或甲基磺酸。无机酸包括例如盐酸、溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸或硼酸。酸加成盐优选为氯酸盐或乙酸盐形式，更优选为氯酸盐形式。

除此之外，可接受的盐的其他示例包括γ-氨基丁酸(GABA)盐、加巴喷丁盐、普瑞巴林盐、烟酸盐、己二酸盐、半-丙二酸盐、半胱氨酸盐、乙酰半胱氨酸盐、甲硫氨酸盐、精氨酸盐、赖氨酸盐、鸟氨酸盐或天冬氨酸盐等。

并且，本发明的药学组合物还可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可包括例如用于口服给药的载体或用于肠胃外给药的载体。用于口服给药的载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。用于肠胃外给药的载体包括水、适当的油、盐溶液、葡萄糖水溶液、乙二醇等。此外，上述载体还可以包括稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂有如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗环血酸等的抗氧化剂。合适的防腐剂有苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。其他药学上可接受的载体可参考以下文献(Remington'sPharmaceutical Sciences,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,1995)。

本发明的药学组合物可以通过任何方法对包括人类的哺乳动物给药。例如，可口服给药或肠胃外给药，肠胃外给药的方法可以为静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、硬膜内、心脏内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠道、局部、舌下、直肠给药，但并不局限于此。

本发明的药学组合物可根据如上所述的给药途径剂型化为口服给药或肠胃外给药的制剂。在剂型化的情况下，可以通过使用一种以上的缓冲液(例如，盐溶液或磷酸盐缓冲液(PBS))、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖等)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA)或谷胱甘肽)、填充剂、增量剂、粘合剂、辅助剂(例如，氢氧化铝)、悬浮剂、增稠剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、稀释剂或赋形剂来配制。

用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末、颗粒、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液或胶囊等，这种固体制剂可以通过在本发明的药学组合物混合至少一种赋形剂来制备，上述赋形剂的实例包括淀粉(包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉及马铃薯淀粉)、碳酸钙(Calcium carbonate)、蔗糖(Sucrose)、乳糖(Lactose)、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇麦芽糖醇、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或明胶等。例如，配合活性成分与固体赋形剂并粉碎其后，向其添加合适的辅助剂后加工成颗粒混合物，从而可获得片剂或糖衣片剂。

除了简单的赋形剂之外，还可以使用如硬脂酸镁和滑石粉等润滑剂。用于口服给药的液体制剂与悬浮剂、内用液体、乳液、糖浆等相对应，除了经常使用的作为简单稀释剂的水或液体石蜡之外，还可以包括几种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂或保存剂等。

并且，根据情况，还可添加交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠等作为崩解剂，还可以添加抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂及防腐剂。

在肠胃外给药的情况下，本发明的药学组合物可以通过本领域公知的方法与合适的用于肠胃外给药的载体一同剂型化为注射剂型、透皮给药剂及鼻内吸入剂。上述注射剂必须进行灭菌、并且需要保护其免受如细菌和真菌等微生物的污染。用于注射剂的合适的载体的示例可以包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其混合物和/或包括植物油的溶剂或分散剂，但并不限定于此。更优选地，可将Hanks液、林格氏液、包含三乙醇胺的磷酸盐缓冲盐水(phosphate bufferedsaline，PBS)或注射用无菌水、或等渗溶液(例如10％乙醇、40％丙二醇或5％葡萄糖)用作合适的载体。为了保护上述注射剂免受微生物污染，注射剂还可包含各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫汞撒等。并且，在大多数情况下，上述注射剂还可包含如糖或氯化钠的等渗剂。

透皮给药制剂的形式包括软膏、乳膏、洗剂、凝胶、外用溶液、膏药、涂敷药和气雾剂等。上述“透皮给药”是指将药学组合物局部给药至皮肤上以向皮肤内传递包含在药学组合物的有效量的活性成分。

在吸入剂的情况下，根据本发明使用的化合物可以使用合适的推进剂例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，以气雾喷雾剂的形式从加压包装或喷雾器方便地传递。在加压的气雾剂的情况下，给药单位可以通过提供阀门来确定，上述阀门递送测量的量。例如，用于吸入器或吹入器中的明胶胶囊及药筒可剂型化为包含化合物及如乳糖或淀粉等的合适粉末材料的粉末混合物。用于肠胃外给药的剂型描述于在药品化学中是通常公知的处方集(Remington's Pharmaceutical Science,15thEdition,1975.Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania 18042,Chapter 87:Blaug,Seymour)。

当本发明的药学组合物包括有效量的CHP时，可提供优选的预防、改善或治疗腹膜纤维化的效果。在本申请中，术语“有效量”是指示出与对照组相比更多响应的量，优选为足以预防、改善或治疗腹膜纤维化的量。本发明的药学组合物可包含0.01％至99.9％的CHP，剩余量为药学上可接受的载体。包含在本发明的药学组合物的CHP的有效量可根据将组合物产品化的形式而不同。

本发明的药学组合物的总有效量能够以单剂量(single dose)给药至患者，或者以多剂量(multiple dose)通过长期给药的分次治疗方法(fractionated treatmentprotocol)给药。本发明的药学组合物可根据疾病的程度改变有效成分的含量。例如，以CHP为基准，一天按每1kg体重给药0.001mg至100mg，一天给药一次或多次，更优选地，一天按每1kg体重给药0.01mg至10mg，一天给药一次或多次。但是，上述CHP的剂量考虑药学组合物的给药途径及治疗次数、患者的年龄、体重、健康状态、性别、疾病的严重程度、饮食及排泄率等各种因素来确定针对患者的有效剂量，因此，鉴于此，只要是本领域的普通技术人员可确定上述CHP的用于预防、治疗或改善腹膜纤维化的特定用途的适当有效剂量。本发明的药学组合物只要显示出本发明的效果，并不特别限制其剂型、给药途径及给药方法。

本发明的用于预防或治疗腹膜纤维化的药学组合物可单独使用或与采用手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法或生物反应控制剂的方法组合使用。

在本发明中，术语“保健功能食品”意在“功能性食品”及“保健食品”。

在本发明中，术语“功能性食品(functional food)”为与特殊保健食品(food forspecial health use，FoSHU)相同的术语，是指除了供给营养外，以有效发挥生物调节功能的方式加工的医学、医疗效果佳的食品。

在本发明中，术语“保健食品(health food)”是指与普通食品相比具有积极的保健或促进健康效果的食品，保健辅助食品(health supplement food)是指以保健辅助为目的的食品。根据情况，术语功能性食品、保健食品、保健辅助食品互换使用。上述食品可制备为片剂、胶囊、粉末、颗粒、液相制剂、丸剂等的各种形式。

作为这种功能性食品的具体例，通过使用上述组合物，可制备在利用农产品、畜产品或水产品的特性转化的同时具有良好的储藏性的加工食品。

本发明的保健功能食品组合物还可制备为营养补充剂(nutritionalsupplement)、食品添加剂(food additives)及饲料等的形式，以包括人类或家畜的动物为对象。

上述食品组合物的类型可以根据本领域公知的常规方法制备成各种形式。可通过向一般食品添加CHP来制备，上述一般食品包括饮料(包括酒精饮料)、水果及其加工食品(例如水果罐头、瓶装食品、果酱、带皮果酱等)、鱼类、肉类及其加工产品(例如火腿、香肠、咸牛肉等)、面包、面条(例如乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、糖浆、乳制品(例如黄油、奶酷等)、食用植物油、人造黄油、植物蛋白、蒸煮食品、冷冻食品和各种调味料(例如大豆酱、酱油、调味汁等)，但并不限定于此。

并且，营养补充剂可通过向胶囊、片剂、丸剂等添加CHP来制备，但不限于此。

并且，保健功能食品可将上述CHP液相化、颗粒化、胶囊化及粉末化来在摄取，例如，可制备为茶、果汁及饮料来饮用(保健饮料)，但不限于此。并且，为了将上述CHP用作食品添加剂的形式，能够以粉末或浓缩液形态制备来使用。并且，可使上述CHP与以具有预防或改善腹膜纤维化效果而周知的活性成分混合来制备为组合物的形式。

在将本发明的食品组合物用作保健饮品组合物的情况下，上述保健饮料组合物可以包含如在普通饮料中的一些调味剂或天然碳水化合物等作为追加成分。上述的碳水化合物可以是：单糖，如葡萄糖和果糖；双糖，如麦牙糖和蔗糖；多糖，如糊精和环糊精；糖醇，如木糖醇，山梨糖醇和赤藓醇。甜味剂可以使用：天然甜味剂，如祝马丁、甜叶菊萃取物；以及合成甜味剂，如糖精和阿斯巴甜。上述天然碳水化合物的比例通常为每100mL的本发明组合物中为约0.01g～0.04g，优选为约0.02g～0.03g。

CHP可包含在用于预防或改善腹膜纤维化的食品组合物中作为有效成分，其量为足以获得上述预防或改善效果的有效量，例如，相对于整个组合物的总重量，优选为0.01重量百分比至100重量百分比，但并不限定于此。本发明的食品组合物可通过与CHP一同混合具有预防或改善腹膜纤维化效果而周知的其他活性成分来制备。

除上述之外，本发明的保健功能食品可包含各种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH值调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类或碳酸化剂等。此外，本发明的保健食品可包含有用于制造天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这种成分可单独使用或混合使用。这种添加剂的比例并不是很重要，但相对于100重量份的本发明的组合物，通常选自0.01重量份～0.1重量份的范围内。

并且，本发明提供包含CHP或其药学上可接受的盐的腹膜透析液。上述CHP及其药学上可接受的盐如前所述。

本发明的CHP或其药学上可接受的盐抑制上皮间充质转化及腹膜细胞的细胞凋亡，因此可通过包含在腹膜透析液中来改善、延迟、预防或治疗腹膜纤维化。

本发明的包含CHP或其药学上可接受的盐的腹膜透析液可包含选自由渗透剂、缓冲剂、电解质及它们的组合组成的组中一种以上。例如，渗透剂包括葡萄糖、葡萄糖聚合物(例如麦芽糖糊精、艾考糊精)、葡萄糖聚合物衍生物、环糊精、改性淀粉、羟乙基淀粉、多元醇、果糖、氨基酸、肽、蛋白质、氨基糖、甘油、N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)或它们的组合。缓冲液可包括碳酸氢盐、乳酸盐、丙酮酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、tris(即，三羟甲基氨基甲烷)、氨基酸、肽或它们的组合。电解质可包括钠、钾、镁、钙及氯化物。

本发明的腹膜透析液可以包含一种以上的透析成分(透析液的因子或组成成分)及治疗有效量的有效物质，包含CHP或其药学上可接受的盐作为用于改善、缓解、预防或治疗腹膜纤维化的成分。上述腹膜透析液可以为透析浓缩物，透析液可包含约0.1μM至约1000μM的CHP或其药学上可接受的盐。

上述腹膜透析液可用作单一容器中的单一透析液或单独收容的或具有多腔室的容器的透析部，当进行腹膜透析时，可与当前使用的透析液同时给药至患者或者隔着时间间隔给药至患者。

此外，本发明涉及包括向需要的个体给药有效量的CHP的步骤的预防或治疗腹膜纤维化的方法。

并且，本发明涉及包括向需要的个体给药有效量的CHP的步骤的腹膜透析方法。

在本发明的方法中，术语“个体”包括任意动物(例如，人类、马、猪、兔、狗、羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)，但并不限定于此。这种术语并不表示特定年龄或性别。因此，包括女性/雌性、男性/雄性、成人/成体及新生对象以及胚胎。患者是指患有疾病或障碍的对象。术语“患者”包括人类及兽医学对象。

在本发明的预防或治疗腹膜纤维化的方法中，CHP的效果及其给药途径、给药次数、剂量等的说明与前述内容相同，因此，将省略其记载。

本发明的腹膜透析方法能够以所有肾脏受损且不能自行排泄水分和废物的患者为对象执行，例如，上述患者可以为慢性肾功能衰竭患者，但并不限定于此。

本发明的腹膜透析方法可通过本技术领域公知的方法执行，例如，可以通过如下方式执行，但并不限定于此：在下腹部插入通向腹腔的导管(catheter)，使透析液进入体内，体内的废物和水分通过扩散和渗透现象逸出到透析液中，从而可去除水分及废物。

进而，本发明提供制备用于预防或治疗腹膜纤维化的药学组合物时的CHP的用途。

并且，本发明提供制备腹膜透析液时的CHP的用途。

在本发明的用途中，CHP的效果、用于预防或治疗腹膜纤维化的药学组合物及腹膜透析液的说明与前述的说明相同，因此将省略其记载。

以下，通过实施例更加详细地说明本发明。但是，本发明可实施各种变更，可具有各种实施方式，以下所记述的特定实施例及说明仅帮助理解本发明，本发明并不限定于特定公开实施方式。需理解的是，本发明的范围包括本发明的思想及技术范围内的所有变更、等同技术方案或代替技术方案。

本发明实施方式

准备例

在下述实施例中使用的CHP从瑞士巴亨(BACHEM公司)购入并使用。

实施例1

确认根据CHP给药的腹膜纤维化动物模型中的腹膜硬化症保护效果

1-1.向腹膜纤维化动物模型给药CHP及阴性对照组

为了制备腹膜纤维化动物模型，从博威电子股份有限公司(Koatech TechnologyCo.,Ltd.)购入7周龄的C57BL/6雄性小鼠，在规定条件(温度：22±2℃，相对湿度：55±10％，每日周期：12小时)下饲养。每5只分为一组，在笼中自由供应水和食物，实验前一周驯化后用于实验。适应期结束后，在30天的时间内，每隔3天通过腹腔注射给药0.1％的氯己定(chlorohexidine)，由此确立腹膜纤维化动物模型。分为4个组，将实验动物第一组设置为给药磷酸盐缓冲液并未发生腹膜纤维化的对照执行组(Vehicle)，将第二组设置为给药磷酸盐缓冲液并发生腹膜纤维化的对照执行组(CG-PD)。第三组和第四组为发生腹膜纤维化的组，在第三组中，通过1ml注射器口服给药浓度为17.5mg/kg(CG-PD+CHP(17.5))的CHP，共给药30天，在第四组中，通过1ml注射器口服给药浓度为35mg/kg(CG-PD+CHP(35))的CHP，共给药30天。

1-2.摘取腹膜纤维化动物模型小鼠组的组织并染色

在实施例1-1中设计的实验动物中，从给药30天的药物及0.1％氯己定的组的小鼠的剑状软骨(xyphoid process)至盆腔上部为止获得宽的腹膜后，通过全血采血牺牲。从皮肤至壁层腹膜层为止，以0.5cm×1.0cm的大小切除肚脐左侧腹部的组织，将一部分固定在10％的福尔马林并包埋在石蜡，由此进行免疫染色。将组织切片切成4μm的厚度，为了确认腹膜的纤维化程度，进行碘酸雪夫氏染色、马松三色染色、天狼星红染色来评价。通过光学显微镜观察后拍摄照片(Olympus BX-50,Olympus Optical,Tokyo,Japan)。

1-3.确认腹膜纤维化动物模型中的抗纤维效果

实验结果，如图1所示，通过碘酸雪夫氏染色确认免疫细胞的沉积与阴性对照组(vehicle)相比在纤维化对照组(CG-PD)中增多，通过给药CHP，确认免疫细胞的沉积浓度依赖性地显著减少。并且，通过马松三色染色确认腹膜层与阴性对照组(vehicle)相比在纤维化对照组(CG-PD)中变厚，可确认与17.5mg/kg给药组相比，35mg/kg的CHP给药组中的变厚的腹膜层显著减少。通过天狼星红染色确认作为细胞外基质的胶原(Collagen)的积累根据CHP的给药以浓度依赖性地显著减少。

通过以上结果，可确认CHP对于腹膜纤维化的优秀的治疗效果。

实施例2

确认腹膜纤维化动物模型中的腹膜硬化症预防效果

从实施例1-1的各组的小鼠中摘出腹膜组织，固定在10％的福尔马林并包埋在石蜡，由此进行免疫染色。利用链霉亲和素生物素过氧化物酶(streptavidin biotinperoxidase)(美国Vector Laboratories公司)方法，在4℃的温度下分别与抗-细胞间粘附分子1抗体及抗-F40/80抗体反应后，通过二氨基联苯胺盐酸盐(DAB，diaminobenzidinetetrahydrochloride)发色来确认表达。通过光学显微镜观察各个表达程度后拍摄照片(Olympus BX-50,Olympus Optical,Tokyo,Japan)。

实验结果，如图2所示，确认诱发初始免疫反应的细胞间粘附分子-1的表达量在纤维化对照组(CG-PD)中与阴性对照组(vehicle)相比增加，可确认通过给药CHP，随着腹膜硬化症的严重程度减少，细胞间粘附分子-1的表达量也一同减少。并且，可确认在CG-PD组中，以免疫细胞中作为巨噬细胞和树突细胞标志物而周知的f4/80阳性细胞的表达量随着腹膜硬化症的增加一同增加，之后，通过给药CHP而迅速减少免疫细胞的浸润。

通过以上结果，可确认通过给药CHP来抑制免疫细胞的浸润并妨碍腹膜硬化症的进展。

实施例3

确认给药CHP的腹膜纤维化动物模型中的作为纤维化标志物的胶原1和α平滑肌肌动蛋白以及作为细胞凋亡标志物的p16和p21的蛋白表达

从韩国Hana Pharm公司购入实施例1-1的各组的小鼠的麻醉和解剖所需的异氟烷(Isoflurane)，准备了美国维特普公司(VetEquip Inc.)的RC2 Rodent CircuitController Anesthesia System。从美国海克隆公司(Hyclone Laboratories Inc)购入磷酸盐缓冲液。为了分离小鼠的腹膜组织，利用3％～3.5％的异氟烷通过呼吸麻醉将小鼠麻醉。从麻醉的小鼠的心脏采血后，立即摘取腹膜组织，利用磷酸盐缓冲液洗涤后，切下50mg的腹膜组织并放入500ul的添加有蛋白酶(protease)及磷酸酶(phosphatase)抑制剂的RIPA缓冲液，利用德国艾卡(IKA)公司的T10均质机(homogenizer)粉碎其。在冰上放置15分钟后，在4℃的温度下以15000rpm的速度离心分离。回收上清液并通过BCA定量法测定蛋白质浓度，利用Bolt^TM蛋白质凝胶电泳系统分离相同量的样品的蛋白质，并转移至硝酸纤维膜(Nitrocellulose membrane)。膜利用5％的脱脂乳(skim milk)在常温条件下封闭(blocking)1小时后，在4℃的温度下与作为一抗的胶原1、α平滑肌肌动蛋白、NRF2、p16、p21及GAPDH抗体反应一夜。利用TBST洗涤3次，每次10分钟，之后，在常温条件下与二抗反应1小时。利用TBST洗涤3分钟，每次10分钟，与ECL反应来测定表达程度。利用ImageJ程序定量所示出的条带大小，将各条带大小值除以GAPDH条带大小值来进行校正。通过与腹膜纤维化对照组(CG-PD)的Student's t-test统计法分析统计学显著性(*p<0.05，**p<0.05，***p<0.0005)。

实验结果，如图3a、图3b及图3c所示，在CHP给药组中观察到作为细胞外基质的胶原和作为成纤维细胞的标志物的α平滑肌肌动蛋白显著减少，由此确认抑制腹膜硬化症的进展。并且，如图3a、图3d及图3e所示，确认通过给药CHP而显著减少诱导细胞周期阻断并最终引起细胞凋亡的p16和p21的蛋白质。

这种结果意味着CHP抑制细胞凋亡并改善腹膜纤维化，被确认为是可应用于治疗腹膜纤维化的证据。

实施例4

确认给药CHP的腹膜纤维化动物模型中的作为纤维化标志物的胶原1、作为细胞周期阻断标志物的p21及作为细胞突触标志物的E-钙粘蛋白的基因表达

[111]从韩国Hana Pharm公司购入实施例1-1的各组的小鼠的麻醉和解剖所需的异氟烷，准备了美国维特普公司的RC2 Rodent Circuit Controller Anesthesia System。从美国海克隆公司购入磷酸盐缓冲液。为了分离小鼠的腹膜组织，利用3％～3.5％的异氟烷通过呼吸麻醉将小鼠麻醉。从麻醉的小鼠的心脏采血后，立即摘取腹膜组织，切下50mg的腹膜并放入500μL的NucleoZOL，利用德国艾卡公司的T10均质机粉碎其。接着，根据NucleoZOL的总RNA分离方案提取RNA，利用iScript cDNA合成试剂盒通过逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)将1μg的RNA合成为cDNA。利用与各基因相对应的正向/反向引物组，通过iQ SYBR Green Supermix进行实时聚合酶链反应来分析合成的cDNA。除以作为管家基因的GAPDH的表达值来校正各基因的表达值。通过与腹膜纤维化对照组(CG-PD)的Student's t-test统计法分析统计学显著性(*p<0.05，**p<0.05，***p<0.0005)。

实验结果，如图4a所示，确认在CHP给药组中减少作为细胞外基质的胶原1的mRNA表达。并且，如图4b所示，确认通过给药CHP而显著减少诱导细胞周期阻断并最终引起细胞凋亡的p21基因，如图4c所示，可确认作为细胞突触标志物的E-钙粘蛋白的表达量在CHP给药组中显著增加。

这种结果示出CHP防止细胞凋亡并抑制腹膜纤维化的进展。