一种妇科荧光染色液
阅读说明：本技术 一种妇科荧光染色液 (Gynecological fluorescent staining solution ) 是由 肖波 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种妇科荧光染色液,所述荧光染色液A液试剂成分由以下组分组成：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚、proclin300和纯化水；所述荧光染色液B液试剂成分由以下组分组成：吖啶橙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、纯化水和proclin300。本发明的妇科荧光染色液降低了试剂的存储条件,优化了试剂的工艺流程；延长试剂有效期,降低了试剂成本,提高了妇科白带检测的准确性,降低妇科白带标本的漏诊率和误诊率。(The invention discloses a gynecological fluorescent staining solution, wherein a reagent of the fluorescent staining solution A comprises the following components: 4', 6-diamidino-2-phenylindole, proclin300 and purified water; the reagent component of the fluorescent staining solution B consists of the following components: acridine orange, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, purified water and proclin 300. The gynecological fluorescent staining solution reduces the storage condition of the reagent, and optimizes the process flow of the reagent; the effective period of the reagent is prolonged, the reagent cost is reduced, the accuracy of the gynecological leucorrhea detection is improved, and the missed diagnosis rate and the misdiagnosis rate of the gynecological leucorrhea specimen are reduced.)
技术领域
本发明涉及医疗化验技术领域，具体为一种妇科荧光染色液。
背景技术
阴道炎是不同病因引起的多种阴道粘膜炎性疾病的总称。在正常生理状态，阴道的组织解剖学及生物化学特点足以防御外界微生物的侵袭。如果遭到破坏，则病原菌即可趁机而入，借种种因素，导致阴道炎症。
阴道炎是妇产科患者最常见疾病，分特异性和非特异性阴道炎，大多是由加德纳菌、真菌、滴虫感染引起的细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎。细菌性阴道炎是育龄妇女最常见的阴道炎类型之一，因为阴道中的乳酸杆菌被高浓度厌氧菌(如普雷沃菌、动弯杆菌)、加德纳菌、流感嗜血杆菌、球菌和支原体等病原菌所代替。细菌性阴道炎主要通过性传播途径感染，但性传播途径不是细菌性阴道炎的唯一感染方式，因为健康女性阴道内也可检出上述病原菌。细菌性阴道炎的其他危险因素包括阴道内窥镜和过早怀孕等。阴道炎的症状缺乏特异性，因此在缺乏实验室确诊依据时，依据患者主诉和其他检查难以确诊。
多数阴道炎患者即使反复感染，依然无法确认发病原因，且阴道炎患者多为混合感染，因此阴道炎的确诊十分困难。
细菌性阴道炎是育龄妇女最常见的阴道炎类型之一，因为阴道中的乳酸杆菌被高浓度厌氧菌(如普雷沃菌、动弯杆菌)、加德纳菌、流感嗜血杆菌、球菌和支原体等病原菌所代替。细菌性阴道炎主要通过性传播途径感染，但性传播途径不是细菌性阴道炎的唯一感染方式，因为健康女性阴道内也可检出上述病原菌。
细菌性阴道炎(BV)是一种由阴道加德纳菌和一些厌氧菌的混合感染，导致阴道内微生态平衡失调，引起的阴道分泌物增多，白带有鱼腥臭味及外阴瘙痒灼热的综合征。
念珠菌性阴道炎(monilialvaginitis)又称外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)、霉菌性阴道炎，是由假丝酵母菌(俗称“霉菌”)引起的常见外阴阴道炎症，主要症状为外阴瘙痒、灼热痛、阴道分泌物增多、呈豆腐渣状或凝乳样。如果没有及时进行正规、彻底的治疗，患者容易反复发作，严重影响日常生活和身心健康。
滴虫性阴道炎(TV)是由毛滴虫引起，寄生人体的毛滴虫有阴道毛滴虫、人毛滴虫和口腔毛滴虫，分别寄生于泌尿生殖系统、肠道和口腔，与皮肤病有关的是阴道毛滴虫，引起滴虫性阴道炎，是一种主要通过性交传播的寄生虫疾病，具有传染性。滴虫性阴道炎表现为外阴瘙痒、分泌物增多，其特点是泡沫样的黄色白带，诊断需要进行专门的检测，和其他阴道炎进行鉴别。
传统的阴道炎诊断方法主要依赖于患者主诉、阴道检查以及实验室检查。目前临床主要检测方法有传统湿片法、革兰氏染色、酶化学法、培养法以及PCR法。
(1)传统湿片法：生理盐水稀释后涂片观察，湿片法方便经济，可在几分钟内完成，但是线索细胞的观察需要经验，背景复杂，易漏检，整体阳性检出率低且没办法检查失活的滴虫。
(2)革兰氏染色：细胞和微生物可以上色，染色后形态较湿片清晰，但滴虫会破碎，且背景也相对复杂，容易漏检或误检。
(3)酶化学方法：可搭配全自动化设备，自动化程度高，但酶的干扰因素多，无国际权威报道支持，临床符合率低，假阳性假阴性概率高，另外操作复杂，需要45分钟，37℃温育，冷链运输。
(4)培养法：指对临床标本进行培养，目的在于分离致病菌，以明确是否存在该致病菌感染，特别是在直接镜检为阴性时，可从疑似患者身上采集标本，进一步进行致病菌培养。一般培养超过2至4周以上依然没有致病菌生长，才可报告阴性。
(5)PCR法：具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等优点，但操作要求高，步骤复杂，需要专门的PCR实验室以及专业检验医师，检测成本也高。
阴道炎的治疗关键在于准确的确定阴道炎的病原体，而镜检是阴道炎诊断的金标准，但湿片或者普通染色检测局限性相对较多，针对以上技术不足，现有采用荧光标记方法，然而普遍荧光染色液存在染色效果不佳，染色后荧光效果淬灭快，染色液长期存放不稳定，使得染色后荧光强度较低等问题。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种妇科荧光染色液，以解决背景技术中提出的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种妇科荧光染色液，所述荧光染色液A液试剂成分由以下组分组成：4',6-二脒基-2-苯基吲哚、proclin300、纯化水；
所述荧光染色液B液试剂成分由以下组分组成：吖啶橙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、纯化水、proclin300。
所述A液试剂由如下组分按照重量百分比组成：4',6-二脒基-2-苯基吲哚0.1-1.8％、proclin3000.01-0.5％、纯化水99.00-99.99％。
优选地，配制A液试剂成品100mL，A液试剂组分配方表如下：
优选地，A液试剂配置方法，包括如下步骤：
(1)称量4',6-二脒基-2-苯基吲哚于烧杯中，加入纯化水；
(2)将步骤(1)的烧杯放在磁力搅拌器上，并搅拌8-15分钟；
(3)量取proclin300于步骤(2)的烧杯中，继续搅拌8-15分钟；
(4)称取A液的pH值范围应在6.9～7.0。
步骤(2)和(3)搅拌的速度为1500转/分钟。
所述B液试剂由如下组分按照重量百分比组成：吖啶橙0.1-0.5％、proclin3000.01-0.5％、磷酸二氢钠1.20-1.50％、磷酸氢二钠2.00-3.00％、纯化水95.00-99.99％。
优选地，配制B液试剂成品100mL，B液试剂组分配方表如下：
原料名称
原料质量/体积
吖啶橙
0.222mg
proclin300
0.1mL
磷酸二氢钠
1.38g
磷酸氢二钠
2.68g
纯化水
100mL
优选地，B液试剂配置方法，包括如下步骤：
(1)量取纯化水于烧杯中；
(2)称取磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；
(3)以1000转/分钟的速度开始搅动步骤(1)烧杯中的纯化水，先加入称量好的磷酸二氢钠，然后在磷酸二氢钠与纯化水完全溶解后加入磷酸氢二钠，在磷酸氢二钠与磷酸二氢钠水溶液完全溶解后停止搅拌，得PBS缓冲液；
(4)用移液枪分别从烧杯内液体上中下部分别吸取2mL PBS缓冲液，并测pH值，要求pH值范围为6.9～7.0；
(5)称取吖啶橙，搅拌PBS缓冲液，然后缓慢加入称取好的吖啶橙；
(6)在吖啶橙与PBS缓冲液充分溶解后，加入proclin300，然后继续搅拌10分钟。
优选地，步骤(5)和(6)搅拌的速度为1500转/分钟。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的妇科荧光染色液降低了试剂的存储条件，优化了试剂的工艺流程；延长试剂有效期，降低了试剂成本，提高了妇科白带检测的准确性，降低妇科白带标本的漏诊率和误诊率。
(2)此染色液操作简单快捷，背景干净，图像清晰，易于判断，临床使用可大大提高阴道炎等妇科白带检测项目的准确率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为荧光染色液A对真菌感染标本的荧光染色图一；
图2为荧光染色液A对真菌感染标本的荧光染色图二；
图3为荧光染色液A对真菌感染标本的荧光染色图三；
图4为荧光染色液A对真菌感染标本的荧光染色图四；
图5为荧光染色液B阴性正常标本图，其中从上到下标记处依次为杆菌、白细胞、上皮细胞。
图6为荧光染色液B对线索细胞阳性标本的荧光染色图一，其中标记的是线索细胞。
图7为荧光染色液B对线索细胞阳性标本的荧光染色图二。
图8为荧光染色液B对滴虫感染标本的荧光染色图。
图9为荧光染色液B对线索细胞阳性和滴虫阳性混合感染的荧光染色图。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1：
本发明提供了一种妇科荧光染色液，所述荧光染色液A液试剂成分由以下组分组成：4',6-二脒基-2-苯基吲哚、proclin300、纯化水；
所述荧光染色液B液试剂成分由以下组分组成：吖啶橙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、纯化水、proclin300。
配制A液试剂成品100mL，A液试剂组分配方表如下：
优选地，A液试剂配置方法，包括如下步骤：
(1)用分析天平称量1mg4',6-二脒基-2-苯基吲哚并放置在烧杯中，用量筒量取100mL纯化水。
(2)将呈放4',6-二脒基-2-苯基吲哚和纯化水溶液的烧杯放在磁力搅拌器上，并搅拌10分钟，搅拌速度1500转/分钟。
(3)用移液枪量取0.1mL的proclin300，然后以1500转/分钟的速度搅拌10分钟。
(4)称取A液的pH值范围应在6.9～7.0。
配制B液试剂成品100mL，B液试剂组分配方表如下：
B液试剂配置方法，包括如下步骤：
(1)用量桶量取100mL纯化水并放入烧杯中，将烧杯放置在磁力搅拌器上。
(2)用分析天平称量1.38g的磷酸二氢钠和2.68g的磷酸氢二钠。
(3)以1000转/分钟的速度开始搅动烧杯中的纯化水，先加入称量好的磷酸二氢钠，然后在磷酸二氢钠与纯化水完全溶解后加入磷酸氢二钠，在磷酸氢二钠与磷酸二氢钠水溶液完全溶解后停止搅拌，得PBS缓冲液；
(4)用移液枪分别从烧杯内液体上中下部分别吸取2mL PBS缓冲液，并测pH值，要求pH值范围为6.9～7.0；
(5)用分析天平称取0.222mg吖啶橙，在以1500转/分钟的速度搅动PBS缓冲液，然后缓慢加入称取好的吖啶橙。
(6)在吖啶橙与PBS缓冲液充分溶解后加入0.1mL的proclin300，然后以1500转/分钟搅拌10分钟。
本发明实施的妇科荧光染色液验证试验
一、方法验证内容
1.配套设备：
一台荧光显微镜(显微镜型号CX23，荧光模块的要求激发波长330-380nm高透，分光镜400nm(>400nm高透)，发射波长：420nm(>420nm高透)；激发波长460-490nm，分光镜500nm(>500nm高透)，发射波长510nm(>510nm高透))；
一台恒温烤片机使用时温度控制在(36.5℃左右)；
2.配套耗材：病理切片(后度要求0.8～1.2mm)，载玻片(厚度要求0.17mm)，采样管。
3.操作方法：
①标本制片
取材后应立刻检测，避免因放置时间太久影响滴虫的活动性或虫体受到破坏使检测结果受到影响。向塑料试管滴加1-2mL生理盐水，棉拭子被浸润后在同一张载玻片左右两次各涂一份标本，晾干或烤干。宫颈脱落细胞标本直接用吸管在细胞保存液里吸取底物浑浊液50ul涂在载玻片上，左右各涂一份标本，晾干或烤干处理。
②试剂的使用操作
制作好的载玻片，左侧标本滴加40mLA液试剂，右侧标本滴加40mL B液试剂，持续染色数分钟；制片要薄，且注意A液试剂和B液试剂不能混在一起。盖上盖玻片，用纸摁压吸去多余染液，放置于荧光显微镜下进行观察。
②显微镜的使用操作
采用含UV波段和B波段双激发滤镜的LED荧光显微镜。LED光源为长效冷光源，使用寿命长，效能稳定，明场下即可观察，无需暗视野。打开荧光光源，需保证明场光源处于关闭状态，否则会出现光路冲突。A液标本在UV波段下观察是否有真菌，B液标本切换B波段下观察是否有线索细胞和滴虫。在10倍镜下先观察是否有荧光信号，在40倍镜下再观察具体的形态结构进行判断。
4.白带免疫荧光检验报告的结果判读
①A波段下观察有无亮蓝色的真菌荧光信号，观察到带荧光的真菌，说明标本中有真菌，未观察荧光信号说明标本中无真菌。阴道真菌感染主要为念珠菌，80％以上为白色念珠菌，其他还包括光滑念珠菌，近平滑念珠菌，热带念珠菌。
真菌荧光形态主要为假菌丝：有分隔，分隔处有明显缩窄，呈藕节状；孢子：圆形或卵圆形酵母型真菌；
芽生孢子：孢子呈出芽状态葫芦形生长。
②B波段下观察镜下有无线索细胞，滴虫，链球菌，以及白细胞数量。
线索细胞：为致病性加特纳菌附着在阴道上皮细胞形成的特异性结构，是临床确诊细菌性阴道炎的必备指标，通过观察有无线索细胞结合患者其他表征来判断是否为细菌性阴道炎；荧光显微镜下观察线索细胞，为绿色的上皮细胞上附着大量的橙红色的短杆状细菌，而乳酸杆菌为长杆状，形态有所差异。
滴虫：属厌氧寄生原虫，荧光显微镜下观察滴虫典型形态，呈广梨形或椭圆形，比白细胞略大，头部可见鞭毛。虫体1/3处可见一条黄色竖杆或斜杆。
白细胞：阴道内炎性细胞，荧光显微镜下呈黄色的荧光，和细胞核大小类似。
链球菌:球形或卵圆形，直径0.6-1.0um，呈链状排列，短者4-8个细菌组成，长者有20-30个细菌组成。
图1-9是在同一张载玻片的两处间隔一定位置各涂一份标本，第一个标本滴加一滴A液试剂，另一个标本滴加B液试剂，盖上盖玻片，吸取多余染色液，置于荧光显微镜下观察的图片。图1-4用于判断标本是否存在真菌阳性，图5是判断标本是阴性标本有少量白细胞；图6-7是滴虫阳性感染标本，图8是线索细胞阳性感染标本，图9是线索细胞和滴虫混合感染标本。
结论：
图1-4为荧光染色液A对真菌感染标本的荧光染色图，结论是该病人患有真菌阴道炎；
图5为阴性正常标本，其中从上到下标记处依次为杆菌、白细胞、上皮细胞。
图6-9为荧光染色液B对线索阳性标本、滴虫阳性标本、以及二者混合感染标本的荧光染色图。
图6图7标记处为线索细胞，结论是该病人患有细菌性阴道炎；
图8标记处为滴虫，结论是该病人患有滴虫性阴道炎；
图9为线索细胞阳性和滴虫阳性标本，结论是滴虫和线索混合感染性阴道炎。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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