阅读说明：本技术 一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离纯化方法 (Separation and purification method of acetylcysteine enantiomer ) 是由 李敬 黄蕾 杨磊 梅雪臣 何韺 刘珍 吕凡林 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离纯化方法。该分离纯化方法包括下述步骤：采用高效液相色谱法对N-乙酰半胱氨酸对映异构体进行分离,即可；所述的高效液相色谱法中的流动相为烷烃类溶剂-异丙醇,所述烷烃类溶剂和所述异丙醇的体积比为(70～83):(17～30)；所述的高效液相色谱法中的色谱柱的填料为涂覆有如式I所示的纤维素类衍生物的填料。本发明所提供的分离纯化方法可以将N-乙酰-L-半胱氨酸及其对映异构体进行有效分离,进一步实现了对N-乙酰-L-半胱氨酸及其对映异构体的定性、定量分析,对药品生产和质量提升有重要指导意义。<Image he="333" wi="629" file="DDA0002209194840000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses a method for separating and purifying acetylcysteine enantiomer. The separation and purification method comprises the following steps: separating N-acetylcysteine enantiomer by high performance liquid chromatography; the mobile phase in the high performance liquid chromatography is alkane solvent-isopropanol, and the volume ratio of the alkane solvent to the isopropanol is (70-83) to (17-30); the filler of the chromatographic column in the high performance liquid chromatography is coated with cellulose derivatives shown in a formula I. The separation and purification method provided by the invention can separate N-acetylThe effective separation of the L-cysteine and the enantiomer thereof further realizes the qualitative and quantitative analysis of the N-acetyl-L-cysteine and the enantiomer thereof, and has important guiding significance for the production and quality improvement of medicines.)

一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及药物分析检测领域，具体涉及一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离纯化方法。

背景技术

N-乙酰-L-半胱氨酸(Acetylcysteine,Ac-Cys)，分子式：C₅H₉NO₃S，分子量：163.19。本品为白色结晶性粉末；有类似蒜的臭气，味酸；有引湿性。易溶于水，溶于乙醇，不溶于二氯甲烷和***；其结构式如下所示。

N-乙酰-L-半胱氨酸为粘液溶解剂，适用于大量粘痰阻塞引起的呼吸困难，及咯痰困难的疾患，也可用于术后咯痰困难，急、慢性支气管炎，支气管扩张，肺炎、肺结核、肺气肿等引起痰液粘稠和咯痰困难者，现也多用于特发性间质肺的治疗。近年来研究发现，这种药品3％的水溶液可作眼药水(阿西丁)治疗角膜炎，随着精细化妆品的研究开发，最近的光医学，光生物学研究表明，N-乙酰-L-半胱氨酸可还原皮下黑色素，消除已经沉着的黑色素，作为美白化妆品已日益受到人们的重视。

N-乙酰-L-半胱氨酸广泛应用于医药，农药，化学工业等领域，目前通常只对N-乙酰-L-半胱氨酸的常规理化指标进行检测，但在生产过程中会产生副产物——N-乙酰-D-半胱氨酸这一对映异构体，从而影响产品质量。

HPLC在拆分氨基酸外消旋体时通常有三种方法：一是利用手性试剂与被拆分物进行衍生化反应生成非对映异构体，从而可被传统的非手性色谱柱所拆分；二是在流动相中加入手性添加剂，利用非手性固定相色谱柱进行拆分；三是利用手性固定相色谱柱进行拆分。其中衍生化反应操作复杂，衍生试剂和反应介质有可能干扰色谱分离和检测；手性流动相添加剂法拆分机理较复杂，方法的建立较困难，更换流动相时系统较长时间才能平衡。

目前，对具有手性特征的药物越来越多地采用ee值来表征对映异构体的绝对含量，而N-乙酰半胱氨酸对映异构体的手性分析一般采用衍生化的方法进行分离，操作复杂，且衍生化过程中反应程度难以准确控制，导致N-乙酰-L-半胱氨酸与N-乙酰-D-半胱氨酸的含量难以准确测定，重现性差。

因此，建立一种能快速、准确测定乙酰半胱氨酸对映异构体含量的分离纯化方法，对药品生产和质量提升有重要指导意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中N-乙酰半胱氨酸对映异构体的分离纯化方法复杂、衍生化反应程度难以精确控制导致定量不准确及重现性差的缺陷，而提供了一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离纯化方法。本发明所提供的分离纯化方法可以将N-乙酰-L-半胱氨酸及其对映异构体进行有效分离，进一步实现了对N-乙酰-L-半胱氨酸及其对映异构体的定性、定量分析。基于此，本发明的方法能简单、快速、准确地分析N-乙酰-L-半胱氨酸合成过程中产生的对映异构体杂质N-乙酰-D-半胱氨酸，对药品生产和质量提升有重要指导意义。

发明人在研发过程中发现，采用纤维素类取代衍生化的涂覆型手性色谱柱，以正相混合溶剂为流动相对乙酰半胱氨酸的对映异构体进行分离检测，可以将N-乙酰-L-半胱氨酸及其对映异构体进行有效分离。

本发明提供了一种N-乙酰半胱氨酸对映异构体的分离纯化方法，其包括下述步骤：采用高效液相色谱法对N-乙酰半胱氨酸对映异构体进行分离，即可；

所述的高效液相色谱法中的流动相为烷烃类溶剂-异丙醇，所述烷烃类溶剂和所述异丙醇的体积比为(70～83):(17～30)；

所述的高效液相色谱法中的色谱柱的填料为涂覆有如式I所示的纤维素类衍生物的填料；

其中，R为

R₁、R₂、R₃、R₄和R₅独立地为H或C₁～C₃的烷基。

本发明中，所述R₁优选为H。

本发明中，所述R₂优选为C₁～C₃的烷基，更优选为甲基或乙基，例如甲基。

本发明中，所述R₃优选为H。

本发明中，所述R₄优选为C₁～C₃的烷基，更优选为甲基或乙基，例如甲基。

本发明中，所述R₅优选为H。

本发明中，所述R优选为

本发明中，所述如式I所示的纤维素类衍生物优选为纤维素-三(3,5)二甲基苯基氨基甲酸酯。

本发明中，所述n是指纤维素的聚合度，一般为正整数。

本发明中，所述填料的基质可为本领域常规的填料基质，例如球形硅胶。

本发明中，所述填料的粒径可为本领域常规的粒径，例如4～6μm，再例如5μm。

本发明中，根据填料的性质，所述色谱柱可称之为涂覆型手性色谱柱。

本发明中，所述烷烃类溶剂可为本领域常规的、可在色谱分离中作为正相溶剂的烷烃类溶剂，例如正己烷、正戊烷、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种，优选为正己烷。

本发明中，优选地，所述异丙醇中含有酸和/或四氢呋喃。

其中，所述酸的种类可为乙酸。

其中，所述酸的用量可为本领域常规的用量，例如0.1～0.5％，再例如0.1％或0.5％，百分比是指在所述异丙醇中的体积百分比。

其中，所述四氢呋喃的用量优选为0.05～0.3％，例如0.05～0.15％，再例如0.1％，百分比是指在所述异丙醇中的体积百分比。

本发明中，所述流动相优选为烷烃类溶剂-含0.1～0.5％酸的异丙醇或烷烃类溶剂-含0.05～0.3％四氢呋喃的异丙醇，例如烷烃类溶剂-含0.1％酸的异丙醇、烷烃类溶剂-含0.5％酸的异丙醇或烷烃类溶剂-含0.1％四氢呋喃的异丙醇；更优选为烷烃类溶剂-含0.1～0.5％酸、0.05～0.3％四氢呋喃的异丙醇，例如烷烃类溶剂-含0.5％酸、含0.1％四氢呋喃的异丙醇；百分比是指在所述异丙醇中的体积百分比。

当所述异丙醇中含有四氢呋喃时，可以抑制乙酰半胱氨酸自身环化物(2甲基-2噻唑啉-4羧酸，详见欧洲药典7.0)自发形成，降低环化物对定量造成影响。

本发明中，所述流动相优选为正己烷-异丙醇，更优选为正己烷-含0.1～0.5％酸的异丙醇、正己烷-含0.05～0.3％四氢呋喃的异丙醇或正己烷-含0.1～0.5％酸、0.05～0.3％四氢呋喃的异丙醇，例如正己烷-含0.1％乙酸的异丙醇、正己烷-含0.5％乙酸的异丙醇、正己烷-含0.1％四氢呋喃的异丙醇或正己烷-含0.5％酸、含0.1％四氢呋喃的异丙醇，百分比是指在所述异丙醇中的体积百分比。

本发明中，优选地，所述流动相为所述烷烃类溶剂和所述异丙醇的混合溶液。

当所述流动相为所述烷烃类溶剂和所述异丙醇的混合溶液时，所述异丙醇中含有的酸和/或四氢呋喃，也可按照百分比换算后加入所述烷烃类溶剂中，再和所述异丙醇混合。

本发明中，所述烷烃类溶剂和所述异丙醇的体积比优选为(75～83):(17～25)，例如77:23、80:20或83:17。

本发明中，所述流动相的流速优选为0.8～1.2ml/min，例如1.0ml/min。

本发明中，所述高效液相色谱法的进样量可参考本领域HPLC检测分析的常规进样量，例如15～25μL，再例如20μL。

本发明中，所述色谱柱的长度可为100～250mm，例如250mm。

本发明中，所述色谱柱的温度优选为25～40℃，例如25℃或30℃。

本发明中，优选地，所述高效液相色谱法的检测器可为紫外检测器。所述紫外检测器的检测波长可为220nm。

本发明中，所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪可采用本领域的常规高效液相色谱仪，例如日立L2420液相色谱仪。

本发明还提供了一种所述的N-乙酰半胱氨酸对映异构体的分离纯化方法在N-乙酰-L-半胱氨酸和N-乙酰-D-半胱氨酸含量测定中的应用。

其中，所述含量测定中，可将待测溶液进行稀释。所述稀释液可为色谱级无水乙醇。

其中，所述N-乙酰-L-半胱氨酸和N-乙酰-D-半胱氨酸含量测定的方法可参考本领域常规的含量测试方法，例如标准曲线法。

优选地，所述的标准曲线法包括以下步骤：

(1)取N-乙酰-L-半胱氨酸对照品溶液和/或N-乙酰-D-半胱氨酸对照品溶液，在与待测溶液相同的色谱条件下，等体积进样；测量各对照品溶液在不同浓度下的峰面积，得到浓度-峰面积标准曲线；

(2)根据测得的待测溶液的峰面积，计算待测溶液中N-乙酰-L-半胱氨酸和/或N-乙酰-D-半胱氨酸的浓度，即可。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明提供的分离纯化方法操作简单，可以将N-乙酰-L-半胱氨酸及其对映异构体进行有效分离，进一步实现了对N-乙酰-L-半胱氨酸及其对映异构体的定性、定量分析。

(2)本发明提供的分离纯化方法除了可以对N-乙酰-DL-半胱氨酸进行分离之外，还能简单、快速、准确地分离N-乙酰-L-半胱氨酸合成过程中产生的杂质。此外，本发明的分离纯化方法在流动相中添加四氢呋喃有效地抑制了N-乙酰-L-半胱氨酸生成自身环化物2甲基-2噻唑啉-4羧酸，环化物的百分比≤0.33％。

附图说明

图1为实施例2中溶剂无水乙醇的色谱图。

图2为实施例2中N-乙酰-DL-半胱氨酸标准品混合溶液第1次进样的色谱图，其中，峰1是指N-乙酰-L-半胱氨酸，峰2是指N-乙酰-D-半胱氨酸。

图3为实施例2中N-乙酰-DL-半胱氨酸标准品混合溶液第2次进样的色谱图，其中，峰1是指N-乙酰-L-半胱氨酸，峰2是指N-乙酰-D-半胱氨酸，峰3为杂质峰。

图4为实施例2中N-乙酰-DL-半胱氨酸标准品混合溶液第3次进样的色谱图，其中，峰1是指N-乙酰-L-半胱氨酸，峰2是指N-乙酰-D-半胱氨酸，峰3为杂质峰。

图5为实施例2中N-乙酰-DL-半胱氨酸标准品混合溶液第4次进样的色谱图，其中，峰1是指N-乙酰-L-半胱氨酸，峰2是指N-乙酰-D-半胱氨酸，峰3为杂质峰。

图6为实施例2中N-乙酰-DL-半胱氨酸标准品混合溶液第5次进样的色谱图，其中，峰1是指N-乙酰-L-半胱氨酸，峰2是指N-乙酰-D-半胱氨酸，峰3为杂质峰。

图7为实施例3中经消旋处理的N-乙酰-DL-半胱氨酸的色谱图，其中，峰1是指N-乙酰-L-半胱氨酸，峰2是指N-乙酰-D-半胱氨酸，峰3为杂质峰。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

1.仪器与条件：

高效液相色谱仪：日立L2420；

色谱柱：纤维素类涂覆型手性色谱柱(型号：Cellu-DR，5μm，4.6*250mm)，该型号色谱柱的填料硅胶涂覆的是：纤维素-三(3,5)二甲基苯基氨基甲酸酯；

流动相：正己烷-含0.5％乙酸的异丙醇＝80:20，百分比为在异丙醇中体积百分比；

流速：1ml/min；

柱温：25℃；

进样体积：20μL；

检测波长：220nm。

2.实验方法和结果：

(1)对照品溶液的制备包括：精密称取标准品N-乙酰-L-半胱氨酸、N-乙酰-D-半胱氨酸，用稀释液(色谱级无水乙醇)分别配制成浓度为每1ml含0.1、0.2、0.5、1.0mg N-乙酰-L-半胱氨酸和0.1、0.2、0.5、1.0mg N-乙酰-D-半胱氨酸的对照品溶液。

分别取N-乙酰-L-半胱氨酸和N-乙酰-D-半胱氨酸的对照品溶液，按1中的条件进行检测，其浓度-峰面积关系如表1所示。

表1乙酰半胱氨酸两种对映异构体浓度-峰面积线性关系

注：“/”表示未检测或未计算。

由表1可知：

(1)N-乙酰-L-半胱氨酸和N-乙酰-D-半胱氨酸在实施例1中的检测条件下线性响应良好；

(2)N-乙酰-L-半胱氨酸的保留时间小于N-乙酰-D-半胱氨酸。

此外，发明人还发现，在对N-乙酰-L-半胱氨酸进行检测时，随着N-乙酰-L-半胱氨酸标准品溶液浓度的增加、放置时间的延长，在保留时间为13.30～13.80min会出现一个杂质峰，根据欧洲药典7.0提供的信息判断该杂质峰为N-乙酰-L-半胱氨酸的自身环化物2甲基-2噻唑啉-4羧酸。

实施例2

供试品溶液1的制备：精密称取标准品N-乙酰-L-半胱氨酸、N-乙酰-D-半胱氨酸，用稀释液(色谱级无水乙醇)配制成浓度为每1ml含有0.5mg N-乙酰-L-半胱氨酸和0.5mgN-乙酰-D-半胱氨酸的混合溶液，作为供试品溶液1。

取供试品溶液1，按实施例1中的条件进行检测，5次重复进样，其峰面积如表2所示。

表2供试品1五次进样重复性

注：“/”表示未检测或未计算。

由表2可知，本申请中的检测方法重复性良好。

图1为本实施例中溶剂无水乙醇的色谱图，图2～6为供试品溶液1第1次～第5次进样时色谱图。

由图2可知，N-乙酰-L-半胱氨酸的保留时间为14.29min，N-乙酰-D-半胱氨酸的保留时间为15.23min；分离度为1.51，峰形良好，不拖尾，不前伸。

由图2～图6可知，随着供试品溶液1放置时间的延长，在13.35min(图3)、13.55min(图4)、13.55min(图5)、13.44min(图6)出现了一个杂质峰，这一结果也和实施例1中所观察到的现象相符，根据欧洲药典提供的信息判断该杂质峰为N-乙酰-L-半胱氨酸的自身环化物2甲基-2噻唑啉-4羧酸。

实施例3

供试品溶液2的制备：精密称取N-乙酰-DL-半胱氨酸(由DL盐酸半胱氨酸合成而来，并按AJI92标准测试比旋度为0)，用稀释液(色谱级无水乙醇)的溶液，作为供试品溶液2。

取供试品溶液2，按实施例1中的仪器与条件进行检测，记录色谱图。如图7所示。

由图7可知：

(1)N-乙酰-L-半胱氨酸的保留时间为14.28min，峰面积为617334，高度为35513，面积％为47.568％；N-乙酰-D-半胱氨酸的保留时间为15.21min，峰面积为666171，高度为35225，面积％为51.331％；杂质峰的保留时间为13.41min，峰面积为14298，高度为1100，面积％为1.102％；N-乙酰-L-半胱氨酸和N-乙酰-D-半胱氨酸的分离度大于1.5，峰形良好，不拖尾，不前伸；

(2)在旋光度为0的条件下，检测得到N-乙酰-L-半胱氨酸和N-乙酰-D-半胱氨酸的比例基本为1:1，反向验证了本申请的方法检测得到的定量结果真实可靠。

实施例4

取实施例2中的供试品溶液1，改变流动相的组成比例，其余条件同实施例1。其中，乙酸的百分比是指体积百分比。

具体分离效果可见表3。

表3流动相中不同乙酸比例的分离效果

编号	流动相	拖尾因子	分离度
				实施例4-1	正己烷：异丙醇＝70：30	1.45	0.92
实施例4-2	正己烷：异丙醇＝80：20	1.44	1.44
				实施例4-3	正己烷：异丙醇＝80：20(0.1％乙酸)	1.24	1.34
实施例4-4	正己烷：异丙醇＝80：20(0.5％乙酸)	1.03	1.51
				实施例4-5	正己烷：异丙醇＝77：23	1.48	0.85
实施例4-6	正己烷：异丙醇＝83：17	1.53	1.46

由表3可知，正己烷和异丙醇的比例为80：20时，N-乙酰-L-半胱氨酸和N-乙酰-D-半胱氨酸分离度可达1.44，异丙醇中含0.5％乙酸峰形最佳，分离度可达1.51。

实施例5

取实施例2中的供试品溶液1，改变流动相的组成比例，其余条件同实施例1。其中，四氢呋喃和乙酸的百分比是指在异丙醇中的体积百分比。

具体分离效果见表4。

表4流动相中添加四氢呋喃的供试品稳定性效果

由表4可知，四氢呋喃的添加有利于抑制N-乙酰-L-半胱氨酸生成自身环化物2甲基-2噻唑啉-4羧酸，样品溶液放置180min，环化物的百分比≤0.33％。其中，在不影响检测的前提下，以异丙醇中0.1％四氢呋喃效果最佳。

对比例1

取实施例2中的供试品溶液1，改变色谱柱类型，其余条件同实施例1。

对比例1-1：选用硅胶表面涂覆有直链淀粉-三(5-氯-2甲基苯基甲酸酯)的涂覆柱(AY，广州研创，5μm，4.6*250mm)。

对比例1-2：选用纤维素类手性色谱柱(

Opti-Chiral C3，5μm，4.6*250mm)，色谱柱中硅胶表面涂覆的是纤维素-三-(4-甲基苯甲酸酯)。

对比例1-3：选用硅胶表面涂覆有直链淀粉-三((S)-α苯乙基氨基甲酸酯)的涂覆柱(AS-H，大赛璐，5μm，4.6*250mm)。

具体分离效果可见表5。

表5不同手性柱的分离效果

由表5可知，色谱柱的种类改变后，即使在本申请的流动相条件下仍然无法获得本申请的分离效果。

对比例2

取实施例2中的供试品溶液1，改变流动相种类或比例，其余条件同实施例1。

具体分离效果可见表6。

表6流动相不同组成比例、不同种类的分离效果

由表6可知：

(1)流动相的比例改变后，即使采用本申请中的色谱柱、流动相种类等分离条件仍然无法获得本申请的分离效果，如对比例2-1～2-3所示；

(2)流动相的种类改变后，即使采用本申请中的色谱柱、流动相比例等分离条件仍然无法获得本申请的分离效果，如对比例2-4～2-5所示。