阅读说明：本技术 个性化肺癌pdo模型及其制备方法与检测试剂盒 (personalized lung cancer PDO model, preparation method thereof and detection kit ) 是由 李瑞宾 杨晓栋 于 2019-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种个性化肺癌PDO模型及其制备方法与检测试剂盒。本发明将肺癌细胞和海藻酸钠溶液混合形成混合液,以氯化钙溶液为凝胶浴,在电场脉冲作用下将所述混合液制备成个性化肺癌PDO模型。本发明的个性化肺癌PDO模型粒径可控,粒径可以在50-2000微米之间调控,且大小均匀；细胞培养成活率高,无需更换培养基；本发明基质刚度控制范围为0.1-100KPa；本发明细胞回收率高,基本实现无损释放细胞,其细胞回收率高达90％,对后续的实验帮助巨大；本发明检测耗时短,整个检测过程一般耗时2天左右,不超过3天,与现有产品相比检测过程缩短了2-4天,且兼容高通量检测。(The invention discloses a personalized lung cancer PDO model, a preparation method thereof and a detection kit. According to the invention, lung cancer cells and a sodium alginate solution are mixed to form a mixed solution, a calcium chloride solution is used as a gel bath, and the mixed solution is prepared into a personalized lung cancer PDO model under the action of electric field pulse. The personalized lung cancer PDO model has controllable particle size which can be regulated and controlled between 50 and 2000 microns and is uniform in size; the survival rate of cell culture is high, and the culture medium does not need to be replaced; the rigidity control range of the matrix is 0.1-100 KPa; the cell recovery rate is high, the cells can be basically released without damage, the cell recovery rate is up to 90 percent, and the method is greatly helpful for subsequent experiments; the method has short detection time, the whole detection process generally takes about 2 days, and does not exceed 3 days, compared with the existing product, the detection process is shortened by 2-4 days, and the method is compatible with high-throughput detection.)

个性化肺癌PDO模型及其制备方法与检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种个性化肺癌PDO模型及其制备方法与检测试剂盒，属于生物医疗技术领域。

背景技术

化疗在癌症治疗中具有手术、放疗和免疫治疗不可替代的地位。但化疗的临床治疗的效率仍然很低，这主要是因为：

1、现行化疗的盲目性。抗癌药物敏感性研究表明，即使是相同组织学类型的个体肿瘤，对同一抗癌药物的反应也不尽一致，对不同脏器或不同组织学类型的肿瘤采用相同的方案，效果更是千差万别，然而，现有化疗多以不变应万变，以“共性”化治疗施加于众多个体，无法针对个体采用个性化对策。

2、化疗的抗药性：抗药性是癌症化疗中无法回避的现实，研究表明，在化疗的不同阶段检测抗药性随时因时制宜采取不同对策，将大大提高化疗的水平。

3、抗癌药物的选择与毒性避免，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤正常的组织细胞，由于化疗的盲目性和抗药性，当医生试图通过大剂量、联用和药、延长化疗时间等方法改善疗效时，将会进一步加重毒性作用，使病人机体受到严重甚至是致命的损伤。

肿瘤细胞药物敏感性的检测其特点是直接从患者体内获取新鲜的肿瘤细胞进行化疗前培养(初诊病人)，由于肿瘤细胞未接触化疗药物，其耐药性和抗药性等生物学性状尚处于体内环境的原始状态，能较真实地反映整个肿瘤细胞群体的特性及不同供体的个体差异，能够比较确切地代表体内状态，为不同的病人准确筛选敏感的化疗药物，并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药。

目前，主流的细胞培养方法是二维培养(平板培养)，因此多数细胞实验也是基于二维培养的细胞进行的。但是二维细胞培养得到的细胞形态多为片状且单层生长，其基因和蛋白的表达与体内细胞相比差异大，对药物也更加敏感，所以基于二维细胞培养的实验所得到的信息往往不够准确。用传统二维培养筛选出来的药物，通过动物实验后，能通过三期临床实验的只有10％，并且最终被证明有效的药物只有5％，实验成本过高，耗时过长。近年来，三维细胞培养逐渐成为热点，三维培养下细胞的形态更接近体内真实情况，对药物的耐受性强，筛选结果可以更有效的指导体内用药，使药物实验的成本降低，周期缩短。但是，由于技术的限制，目前三维细胞培养也存在着明显的缺陷，如难以控制三维球的大小，细胞成活率低，细胞回收率低等。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种个性化肺癌PDO模型及其制备方法与个性化肺癌PDO模型检测试剂盒，利用海藻酸钠溶液作为细胞支架材料在电场脉冲作用下快速包封肺癌细胞成三维微球，可以包被不同肺癌患者的癌细胞代表相应的肺器官细胞所生长的细胞外基质环境，对外源性刺激物而引发的肺癌细胞活性可以进行高通量的检测。

本发明的第一个目的是提供一种个性化肺癌PDO模型的制备方法，包括如下步骤：将肺癌细胞和海藻酸钠溶液混合形成混合液，以氯化钙溶液为凝胶浴，在电场脉冲作用下将所述混合液制备成个性化肺癌PDO模型。

进一步地，所述的肺癌细胞和海藻酸钠溶液按照1×10⁴～1×10⁵个细胞/1ml海藻酸钠溶液的比例进行混合。

进一步地，所述的混合液在电场脉冲作用下，通过注射器以液滴状注射至氯化钙溶液中，制备成个性化肺癌PDO模型。

进一步地，所述注射器的针头与氯化钙液面的距离为1～2cm。

进一步地，所述氯化钙溶液的浓度为1～10％。

进一步地，所述的注射器注射速度为2～3mm/min。

进一步地，所述的电场脉冲作用是基于个性化肺癌PDO模型制备仪，电压为30～50kV，频率为1～250Hz，脉冲为4～5ms。

进一步地，所述的个性化肺癌PDO模型制备仪的正极与注射器的针头连接，负极与氯化钙溶液连接，在注射器的针头与氯化钙溶液之间形成电场脉冲作用。

进一步地，所述方法具体包括如下步骤：

(1)将肺癌细胞与海藻酸钠溶液按照1×10⁴～1×10⁵个细胞/1ml海藻酸钠溶液的比例进行混合，得到混合液；

(2)采用注射器吸取步骤(1)的混合液，静置去除气泡，并设置注射器的注射速度为2～3mm/min；

(3)以1～10％氯化钙溶液为凝胶浴，设置注射器的针头与氯化钙溶液液面之间的距离为1～2cm；

(4)基于个性化肺癌PDO模型制备仪，将个性化肺癌PDO模型制备仪的正极与注射器的针头连接，负极与氯化钙溶液连接，在注射器的针头与氯化钙溶液之间形成电场脉冲作用；其中，设置电压为30～50kV，频率为1～250Hz，脉冲为4～5ms；

(5)在电场脉冲作用下，将步骤(2)的混合液以液滴状注射至步骤(3)的氯化钙溶液中，形成个性化肺癌PDO模型。

进一步地，所述方法还包括在个性化肺癌PDO模型制备结束后，将个性化肺癌PDO模型静置沉淀，去除上清液，加入培养基对所述个性化肺癌PDO模型进行清洗的步骤。

本发明的第二个目的是提供一种所述方法制备得到的个性化肺癌PDO模型。

本发明的第三个目的是提供一种包含所述的个性化肺癌PDO模型的检测试剂盒，所述的试剂盒用于肺癌细胞活性药敏检测。

进一步地，所述的试剂盒中还包括细胞活性检测培养基和四唑盐化合物MTS。

本发明进一步提供了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)将含有个性化肺癌PDO模型的培养基转移至细胞培养板中，去除其中的培养基，加入细胞活性检测培养基；

(2)将待检测的药物按不同浓度梯度加入到含有肺癌PDO三维微球的细胞培养板中，进行培养，然后进行观察，并对细胞活力进行检测；

(3)根据细胞活力检测结果，进一步对检测药物进行分析。

本发明的有益效果是：

1、尺寸可控，且大小均一，其粒径可以在50-2000微米之间调控，且大小均匀，而现有产品的粒径可调控范围窄，甚至无法调控；

2、本发明制备的微球结构稳定，不易溶解，营养物质与代谢产物有效交换，细胞培养成活率高，无需更换培养基；

3、基质刚度控制可控，其控制范围为0.1-100KPa，而现有产品的基质刚度控制可控性较差，甚至不可控；

4、本发明制备的微球结构稳定，所有细胞及后期增值的细胞都处于微球内无损失，裂解后细胞回收率高，基本实现无损释放细胞，其细胞回收率高达90％，远远高于现有产品，对后续的实验帮助巨大；

5、检测耗时短，整个检测过程一般耗时2天左右，不超过3天，与现有产品相比检测过程缩短了2-4天；

6、兼容高通量检测；

本发明的个性化肿瘤PDO模型检测试剂盒可以对于外援刺激物(药物)进行准确快速的生物检测，以及临床肺瘤患者的高通量药敏测试，达到精准用药。

附图说明

图1为紫杉醇对A549三维细胞微球的细胞毒性；

图2为不同粒径的A549细胞微球的光镜图；

图3为不同细胞的回收率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

海藻酸钠溶液配制：1、称取海藻酸钠粉末1g，加入装有100ml纯净水的烧杯中；2、烧杯中放入磁石，磁力搅拌器搅拌6h以上；3、用注射器吸取搅拌好后的海藻酸钠，依次用0.8μm、0.45μm的滤膜过滤，最后在无菌环境下用0.22μm滤膜(无菌)过滤。

收集细胞：1、从培养箱中取出培养皿镜检，确保细胞处于健康的对数生长期状态；2、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞2次(1ml/次)；3、加1ml胰酶细胞消化液(0.25％胰酶，含酚红)于培养皿中，置于37℃培养箱中消化1-2min，镜检消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，拿回安全柜后加2ml培养基终止消化；4、用移液枪轻轻吹打、洗脱后吸出于50ml离心管中，离心机1000rpm×5min，弃去上清液，保留瓶底部的细胞，加入适量DMEM培养基，用1ml移液枪吹打分散细胞。

细胞计算方法：1、取10μL(2.4)中制备好的细胞悬浮液至1.5ml离心管中，再加入80μl PBS，台盼蓝(0.4％)10μl，室温染色5min；2、将上述染色后的细胞悬浮液混合均匀后，取10μl注入细胞计数板，在显微镜下累计左上、左下、右上、右下四个区域(每个区域有16个大格子)中的细胞总数和死细胞数(死细胞被染成蓝色)。

细胞存活率＝(总细胞数-死细胞数)/总细胞数。(当存活率>95％才可进行后续实验)

细胞密度＝(总细胞数-死细胞数)/4×10⁴×10个细胞/ml，(其中10为细胞悬浮液稀释倍数)

实施例1：A549细胞三维微球的制备

1、将收集的状态良好的A549细胞与海藻酸钠溶液以4*10^{^4}个细胞+1ml海藻酸钠的比例进行混合。

2、用注射器吸取混合液，静置至无明显气泡，将注射器针头换成已灭菌的点胶针(针头型号为25G)，然后将其固定于匀速缓降设备上，并调整注射速度为2mm/min。

3、在不小于150ml的烧杯中加入铁圈，并加入1.1％氯化钙溶液，然后将烧杯至于升降台上，放在个性化肺癌PDO模型制备仪上。

4、调整点胶针针头与烧杯中溶液液面的距离为2厘米。

5、将个性化肺癌PDO模型制备仪的正极(红色铁夹)与点胶针连接，负极(黑色铁夹)与铁圈连接。调整电压为36kV，频率为125Hz，脉冲为5ms，然后打开脉冲开关，启动设备，观察滴球情况。正常情况下混合液成线性滴出，在溶液中可以观察到颗粒沉淀。

6、打开匀速缓降设备开关开始自动注射，开始静电液滴法制备三维细胞。

7、制备结束之后，关闭仪器设备开关，将烧杯取下置于生物安全柜桌面上静置。

8、当观察到三维细胞沉至烧杯底部时(一般静置5min)，吸弃上清，并加入不含血清的的培养基适量以洗去残余氯化钙溶液，此步骤重复一次，然后加入适量含血清的培养基，在适宜温度下保存(37℃、5％CO2)。

9、A549细胞三维微球制备完成。

在A549细胞三维微球制备后保存5天、10天、14天、21天、30天时分别以下参数：包被的活细胞数量、三维微球的个数、三维微球的直径，结果如表1所示：

表1

天数	5	10	14	21	30
						包被活细胞存活率(％)	100	97.12	95.57	91.45	88.62
三维微球个数(个/mL)	496	496	496	496	496
						三维微球直径(um)	425	425	425	425	425

从表1数据可得出：随着时间的增加三维微球内的细胞活性会缓慢降低，但是三维微球的个数和微球的直径并不会改变，结构稳定。

实施例2：A549细胞三维微球检测试剂盒用于药敏测试检验

试剂盒各组分为：

试剂1主要组分为含A549细胞微球的液体，无板结，无絮状物；

试剂2主要组分为供个性化肿瘤患者细胞微球生长和维持的培养基，性状为粉红色透明液体，无沉淀，无悬浮，无絮状物；

试剂3主要组分为四唑盐化合物MTS，性状为粉色透明液体，无沉淀，无悬浮，无絮状物。

未开封的试剂盒在常温下保存，避免过度震荡，有效期15天。试剂1开封后保存在37℃，5％CO₂培养箱中，24小时；试剂2开封后保存在4℃冰箱中，24小时；试剂3开封后避光保存在4℃冰箱中，24小时.

药敏测试检验：

(1)试剂1包被于96孔板

将试剂1取出后，放置于15mL离心管中，自然沉淀后去除多余的上清，然后添加10mL的试剂2，进行梯度分装至另外的15mL离心管中，最终按100μL/孔依次将其接种于96孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱过夜。

(2)A549细胞微球药物刺激

a、取出96孔培养板，小心的将细胞上清去除。

b、用试剂2稀释紫杉醇药物至需求浓度(3.125ug/mL、6.25ug/mL、12.5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL)，按120μL/孔直接加入至包被好的96孔板中，每个浓度设置5个复孔，混匀，放置37℃、5％CO₂培养箱培养至所需时间。

c、设置阴性对照组：具有完全培养基、细胞。

注意：去除上清时，如用真空泵，其吸力要适当控制，吸液枪头不要触及孔底部以防堵塞并造成A549细胞微球的破坏，药物配制相应浓度时，请尽量节省试剂2，原则上不可超过20mL。

(3)细胞活性测试

a、取出96孔培养板，将A549细胞微球进行细胞活性检测。

b、取出试剂3，倒入加样槽中，按120μL/孔直接加入到96孔培养板，置于培养箱中孵育2-4小时。

d、待形成明显的色差后，将培养板取出用排枪按100μL/孔取上清溶液到新的96孔板中进行MTS的检测(吸光，波长490nm)，并保存数据进行处理。

A1＝OD(具有完全培养基、细胞、药物溶液、MTS溶液)

A2＝OD(具有完全培养基、细胞、MTS溶液)

细胞活性(％)＝[A1/A2]*100％

检测结果如图1所示。由图1数据可得：用不同浓度的紫杉醇处理A549三维细胞微球，随着浓度的增加，细胞活性总体呈下降趋势。在低浓度(3μg/mL到6μg/mL的区间内)细胞活性未受明显影响而大于10μg/mL的紫杉醇作用下，细胞活性收到明显抑制，呈下降趋势

实施例3：不同规格A549细胞微球制备

按照实施例1的制备方法，针头型号分别采用34G、30G和25G，制备了3种不同规格的A549细胞微球，经显微镜标尺测量所得细胞微球的大小，随机检测十组数据，结果如表2所示：

表2

由表2中数据可知，采用本发明的方法制备得到的细胞微球尺寸可控，且大小均一，不同规格的细胞微球的光镜图片如图2所示。

实施例4：细胞回收率测定

(1)将裂解液试剂分别与不同肺癌PDO细胞微球(A549细胞微球、BEAS-2B细胞微球、WI-38细胞微球)按照10：1的比例裂解5min,至显微镜下看不到微球结构即可，如裂解不充分，可适当增加裂解时间。

(2)裂解后的细胞经1000rpm，5min离心进行收集。

(3)进行细胞计数。

结果如图3所示，三种肺组织来源的细胞系回收率均达到了90％以上。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。