阅读说明：本技术 二氢青蒿素含羧基酚/酯基酚/酰胺基酚偶联物、合成方法及应用 (Dihydroartemisinin carboxyl-containing phenol/esterphenol/amido phenol conjugate, synthetic method and application ) 是由 杨大成 潘建芳 范莉 刘建 唐雪梅 周福委 杨龙 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种二氢青蒿素含羧基酚/酯基酚/酰胺基酚偶联物,该偶联物或其消旋体、立体异构体和互变异构体及其药学上可接受的盐具有式I的结构通式：<Image he="280" wi="700" file="DDA0002183202360000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>n＝2或3,X为烷氧基、羟基、胺基或-O(CH<Sub>2</Sub>)<Sub>b</Sub>-DHA,Y为-H或烷氧基,Z为烯基、烷基或无基团,b＝2或3,DHA代表二氢青蒿素。本发明还公开了其合成方法,以及所述偶联物在抗结核、抗糖尿病、降脂和抑制白细胞介素-17药物中的应用。(The invention discloses a dihydroartemisinin carboxyl-containing phenol/ester-based phenol/amido phenol conjugate, wherein the conjugate or racemate, stereoisomer and tautomer thereof and pharmaceutically acceptable salt thereof have a structural general formula shown in a formula I: n is 2 or 3, X is alkoxy, hydroxy, amino or-O (CH) 2 ) b -DHA, Y is-H or alkoxy, Z is alkenyl, alkyl or nothing, b ═ 2 or 3, DHA represents dihydroartemisinin. The invention also discloses a synthetic method of the conjugate and application of the conjugate in anti-tuberculosis, anti-diabetes, lipid-lowering and interleukin-17 inhibition drugs.)

二氢青蒿素含羧基酚/酯基酚/酰胺基酚偶联物、合成方法及 应用

技术领域

本发明涉及化学医药技术领域，具体涉及一种二氢青蒿素含羧基酚/酯基酚/酰胺基 酚偶联物、合成方法及应用。

背景技术

青蒿素是从植物青蒿中发现的萜类化合物，是一种无色针状晶体。二氢青蒿素(DHA)是青蒿素的第一代衍生物，不仅结构独特，而且显示了比青蒿素更为优良的药 学性质，是重要的临床抗疟药物。基于DHA的特殊结构和优异活性，DHA的研究持续 不断，目前主要集中在DHA新型衍生物的设计合成、DHA的旧分子或新分子的新活性 探索。至今，众多DHA新型衍生物被合成出来，部分青蒿素衍生物已用于抗乳腺癌、 结直肠癌、非小细胞肺癌等的临床试验中。研究还发现，某些DHA衍生物在抗病毒、 抗菌增敏、抗艾滋病毒、抗巨细胞病毒及抗结核等疾病中表现出非常好的活性，显示了 多靶点分子的潜质，值得进一步研究开发。

水杨酸是植物柳树皮提取物,是一种天然的消炎药。常用的感冒药阿司匹林就是水 杨酸的衍生物乙酰水杨酸钠；水杨酸在皮肤科常用于治疗各种慢性皮肤病如痤疮、癣等。 对氨基水杨酸钠是一种常用的临床抗结核药物。间羟基苯甲酸主要用作杀菌剂、防腐剂、 离子交换剂、增塑剂及医药的中间体等。对羟基苯甲酸是用途广泛的有机合成原料，还广泛用于食品、化妆品、医药的防腐、防霉剂和杀菌剂等,也用作染料、农药的中间体。 对羟基苯乙酸是重要有机合成中间体,用于β-受体阻滞药阿替洛尔和葛根黄豆甙元有效 成分－4,7-二羟基异黄酮的合成。阿魏酸是桂皮酸的衍生物之一,其钠盐具有抗血小板 聚集、抑制血小板5-羟色胺释放、抑制血小板血栓素A2的生成、增强***素活性、 镇痛、缓解血管痉挛等作用,是生产心脑血管疾病及白细胞减少等症药品如心血康、利 脉胶囊、太太口服液等等的基本原料,它同时可起到健美和保护皮肤的作用。含有羧基 的苯酚本身多数具有广泛的生物活性,如水杨酸和阿魏酸直接作为上市药物用于临床。

羧酸酯与羧酸相比,水溶性变差但脂溶性变强。羧酸酯在体内可以被水解酶水解.基于此点,药物分子设计中有时要避免设计羧酸酯作为药物分子,但有时又利用此点设 计前药。羧酸酯在有机合成中也是非常重要的中间体,通过羧酸酯可以得到酰胺、羧酸 等目标分子。

众多的含酚羟基羧酸酯,如水杨酸甲酯、尼泊酸甲酯、阿魏酸甲酯等,在医药、食品、化工领域具有重要用途。水杨酸甲酯具有局部刺激作用,可促进局部血液循环,外 用或局部涂擦可产生皮肤血管扩张、肤色发红等刺激反应,并反射性地影响相应部位的 皮肤、肌肉、神经及关节,起消肿、消炎和镇痛作用,亦有止痒之效。尼泊金甲酯属酚 类防腐剂,对各种霉菌、酵母菌、细菌有效,在医药工业中用作药剂的防腐杀菌剂；尼泊 金甲酯也用作食品、香料、胶片等的防腐添加剂。阿魏酸甲酯具有抗氧化、美白、消炎 等功效,主要用化妆品中。此外阿魏酸甲酯还具有抗衰老、调节免疫能力、杀线虫剂、 抗肿瘤等生物活性。简单的含酚羟基羧酸酯,既有广泛的生物活性,共存的酚羟基又可 作为进一步衍生的反应位点。

酰胺类化合物具有广泛的生物活性，许多具有特定活性的多肽药物、β-内酰胺抗生 素(青霉素类、头孢菌素类等)、氯霉素类抗生素以及某些抗结核药物都含有酰胺键结构， 更多药物先导分子或候选药物都力图引入酰胺结构。

虽然将含酚羟基羧酸衍生物和含有羧基的苯酚结构引入DHA母体中已有报道,但是得到的化合物数量少且不够系统。所以合成系列DHA酚羟基羧酸衍生物,考察生物 活性及构效关系,具有药学意义。基于此,本发明将含羧基酚/酯基酚/酰胺基酚通过简单Linker与DHA连接,形成芳基醚类化合物,此即目标分子。

发明内容

本发明提供一种二氢青蒿素含羧基酚/酯基酚/酰胺基酚偶联物、合成方法及应用。

本发明提供了一种二氢青蒿素与含羧基酚/酯基酚/酰胺基酚偶联物，或其消旋体、 立体异构体、互变异构体以及其药学上可接受的盐，具有式I的结构通式：

其中，n＝2或3，Y为H或烷氧基，Z为烯基、烷基或无基团，且当X为羟基或-O(CH₂)_b-DHA、b＝2或3时，用TM5表示，当X为烷氧基或胺基时，用TM6表示； 其中DHA为二氢青蒿素。

较佳地，n＝2或3，Y为-H或-OMe，Z为-(CH₂)-_m或-CH＝CH-，m＝0、1或2，X为 -OH、-O(CH₂)_b-DHA、-OMe或-NH₂，b＝2或3。

本发明还提供了上述衍生物的合成方法，所述TM5的合成按以下反应方程式进行，包括以下步骤：

其中，n＝2或3，Y为-H或-OMe，Z为-(CH₂)-_m或-CH＝CH-，X为-OH或-O(CH₂)_b-DHA， m＝0、1或2，b＝2或3；

加入原料含羧基取代苯酚B1、IM1、K₂CO₃和溶剂二甲基甲酰胺,加热、搅拌溶解， 反应1～15h，反应结束后，进行后处理，得到二氢青蒿素含羧基酚的偶联物，即TM5。

较佳地，原料IM1和原料含羧基取代苯酚B1的物质的量比为1：1～2，反应温度为40～85℃。

TM6的合成按以下反应方程式进行，包括以下步骤：

其中，n＝2或3，Y为-H或-OMe，X为-OMe或-NH₂，Z为-(CH₂)-_m或-CH＝CH-，m＝0、 1或2；

加入原料含酯基或酰胺基取代苯酚B2、IM1、K₂CO₃和溶剂二甲基甲酰胺,加热、 搅拌溶解，反应1～10h，反应结束后，进行后处理，得到二氢青蒿素含酯基或酰胺基酚 偶联物，即TM6。

较佳地，原料IM1和原料含酯基或酰胺基取代苯酚B2的物质的量比为1：1～2，反应温度为40～85℃。

本发明还提供了一种二氢青蒿素含羧基酚/酯基酚/酰胺基酚偶联物或其消旋体、立 体异构体、互变异构体及其药学上可接受的盐在抗结核、抗糖尿病、降脂和抑制白细胞介素-17药物中的应用。

较佳地，当n＝2，Y为-OMe，Z为-CH＝CH-，X为-OH(用TM5-5表示)在抗结核 药物中的应用；

n＝3，Y为H，Z为无基团，X为-O(CH₂)_b-DHA，b＝3(用TM5-6表示)在降脂药物 中的应用；

n＝3，Y为H，Z为-CH₂CH₂-，X为-OH(用TM5-10表示)在抑制白细胞介素-17药 物中的应用。

较佳地，当n＝2、X为-OMe、Y为-H、Z为-CH₂-，n＝2、X为-OMe、Y为-OMe、 Z为-CH＝CH-，n＝3、X为-OMe、Y为-OMe、Z为-CH＝CH-，n＝2、X为-NH₂、Y为-H、 Z为-CH₂-(分别用TM6-3、TM6-5、TM6-11、TM6-12表示)在抗结核药物中的应用；

n＝3，X为-NH₂，Y为-H，Z为-CH₂-(用TM6-13表示)在抗糖尿病药物中的应用；

n＝2、X为-OMe、Y为-H、Z为无基团(用TM6-2表示)，n＝3、X为-OMe、Y为-H、 Z为无基团(邻、对位，分别用TM6-6、TM6-8表示)，n＝3、X为-OMe、Y为-H、Z为 -CH₂CH₂-(用TM6-10表示)，n＝3、X为-NH₂、Y为-H、Z为-CH₂-(用TM6-13表示)在 抑制白细胞介素-17药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了二氢青蒿素与含羧基酚/酯基 酚/酰胺基酚偶联物，该类衍生物通过合适的连接结构将二氢青蒿素及羧基酚/酯基酚/酰 胺基酚药物的药效团相互连接，合成方法简单，合成收率较高；经过生物活性实验测试，发现本发明的衍生物具有抗结核活性、抗糖尿病、良好的降血脂活性、抑制白细胞介素 -17等多种生物活性，具有很好的应用前景。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受 具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、二氢青蒿素含羧基酚偶联物的制备

(1)中间体IM1的制备方法如下：

加入二氢青蒿素、***以及溴代醇，在冰浴冷却下加入三氟化硼-***(BF₃.Et₂O)，搅拌下反应5～20h，反应完成后，加入饱和NaHCO₃终止反应，静置分层，水层用乙酸 乙酯(EA)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水MgSO₄干燥，抽滤，滤液减压 旋蒸除去溶剂得粗品，粗品用石油醚-EA混合溶剂重结晶即得中间体IM1。

(2)DHA与含羧基酚偶联物，在此申请中我们用TM5表示，其制备方法如下：

在100mL圆底烧瓶中依次加入含羧基取代苯酚B11.2mmol、溶剂二甲基甲酰胺(DMF)2mL、K₂CO₃(2.5mmol)和IM1(1mmol)，45-80℃水浴搅拌反应，TLC监 测反应进程。反应完全后，加入水20mL和EA 15mL，分液，水层用EA 10mL萃取， 合并有机相，饱和NaHCO₃洗(5mL×2)，再将pH调节至3-4，水洗(20mL×2)，无 水MgSO₄干燥，抽滤，减压旋蒸除去EA，多数得到浅黄色粘液，柱层析得纯品TM5。

实施例2、二氢青蒿素含羧基酚偶联物TM5-1～TM5-11的制备

依照实施例1所述的制备方法当n＝2或3，Y为-H或-OMe，Z为-(CH₂)-_m或-CH＝CH-，X为-OH或-O(CH₂)_b-DHA，m＝0、1或2，b＝2或3，制备出TM5-1～TM5-11一系列产 物，各自的反应条件、产量、产物得率、产物熔点如表1所示。

表1 TM5系列化合物合成实验结果

实施例3、二氢青蒿素含酯基/酰胺基酚偶联物的制备

在100mL圆底烧瓶中依次加入含酯基/酰胺基酚B2(1.2mmol)、DMF 2mL、K₂CO₃(2.5mmol)和IM1(1mmol)，45-80℃水浴搅拌反应，TLC监测反应进程。反应完全后, 加入水20mL和EA 15mL,1NHCl调节pH至7左右,继续搅拌5min,分液，水层用EA 10mL萃取，合并有机相，1NNaOH洗涤(5mL×2)，水洗(20mL×2)。无水Na₂SO₄干燥，抽滤，减压旋蒸除去EA,柱层析即得到产品TM6。

实施例4、二氢青蒿素与含酯基/酰胺基酚偶联物TM6-1～TM6-13的制备

依照实施例3所述的制备方法当n＝2或3，X为-OMe或-NH₂，Y为-H或-OMe，Z 为-(CH₂)-_m或-CH＝CH-，m＝0、1或2，制备出TM6-1～TM6-13一系列产物，各自的反应 条件、产量、产物得率、产物熔点如表2所示。

表2 TM6系列化合物合成实验结果

实施例5、TM5-1～TM5-11和TM6-1～TM6-13的测试与表征

对实施例2和实施例4得到的TM5-1～TM5-11和TM6-1～TM6-13系列产物进行了¹HNMR(AV-300)、¹³C NMR(AV-75)和HR MS(Varian 7.0T)测试和表征，数据如下所 示：

(1)TM5-1～TM5-11

TM5-12-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2]di oxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethyl 2-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimet hyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)benzoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.77(1H,d,J＝7.5Hz),7.52-7.42(1H,m),7.04-6.93(2H, m),5.47(1H,s),5.41(1H,s),4.90-4.86(2H,m),4.54-4.36(2H,m),4.22-4.15(4H,m),3.94- 3.67(2H,m),2.69-2.55(2H,m),2.42-2.30(2H,m),2.05-1.13(20H,m),1.43(6H,s),0.97-0.82(12H, m).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:165.58,158.71,133.41,131.56,120.57,120.33,113.73, 104.09,104.07,102.28,101.77,87.96,87.88,81.22,81.14,68.38,66.81,65.58,63.65,52.61, 52.48,44.49,44.44,37.26,37.19,36.50,36.45,34.72,34.61,30.91,30.87,26.23,24.74, 24.69,24.46,24.39,20.44,13.02,12.99.HR MScalcd for C₄₁H₅₈O₁₃[M+Na]⁺781.3775, found 781.3777.

TM5-22-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2]di oxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethyl 3-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trim ethyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)benzoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.64(1H,J＝8.4Hz),7.56(1H,s),7.33(1H,t,J＝7.8Hz), 7.11(1H,dd,J＝1.8 and 7.8Hz),5.48(1H,s),5.40(1H,s),4.91(1H,d,J＝3.0Hz),4.87(1H,d, J＝3.0Hz),4.68-4.36(2H,m),4.24-4.14(4H,m),4.01-3.70(2H),2.65-2.60(2H,m), 2.43-2.29(2H,m),2.10-1.12(20H,m),1.45(3H,s),1.44(3H,s),0.97-0.80(12H,m).¹³C NMR (75MHz,CDCl₃)δ:166.21,159.03,131.51,129.47,122.18,120.36,114.60,104.18,104.16, 102.23,101.97,87.98,87.93,81.17,81.11,67.61,66.45,65.74,63.91,52.62,52.49,44.49, 44.42,37.54,37.28,36.49,36.47,34.70,34.58,30.94,30.87,26.26,24.78,24.68,24.50, 24.46,20.41,20.36,13.01.

TM5-32-(4-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy [1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)phenyl)aceticacid

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.13(2H,d,J＝8.1Hz),6.77(2H,d,J＝8.4Hz),5.43(1H,s),4.78(1H,d,J＝3.3Hz),4.30-4.19(2H,m),4.02-3.95(1H,m),3.68-3.60(1H,m),3.55(2H, s),2.64-2.59(1H,m),2.37(1H,td,J＝3.9 and 14.4Hz),2.10-1.19(10H,m),1.44(3H,s,H-15), 0.95(3H,d,J＝5.7Hz),0.86(3H,d,J＝7.5Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:172.37, 155.37,130.43,125.35,115.62,104.34,102.19,88.02,81.21,66.09,64.12,52.54,44.39, 40.44,37.58,36.43,34.63,30.86,26.15,24.74,24.45,20.43,12.93.

TM5-43-(4-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy [1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)phenyl)propanoic acid

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.12(2H,d,J＝8.4Hz),6.83(2H,d,J＝8.4Hz),5.48(1H,s),4.90(1H,d,J＝3.0Hz),4.18-4.05(3H,m),3.80-3.75(1H,m),2.90(2H,t,J＝7.5Hz),2.67-2.62(3H,m),2.37(1H,td,J＝3.6 and 14.1Hz),2.06-1.19(12H,m),1.45(3H,s),0.94-0.89(6H,m).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:178.66,157.50,132.51,129.31,114.77,104.20,102.18,88.01,81.25,67.44,66.59,52.62,44.51,37.49,36.50,35.96,34.70,30.97, 29.85,26.26,24.79,24.49,20.46,13.06.

TM5-5(E)-3-(3-Methoxy-4-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3 H-3,12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)phenyl)acrylic acid

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.63(1H,d,J＝15.9Hz),7.09-7.05(2H,m), 6.94-6.88(1H,m),6.30(1H,d,J＝15.9Hz),5.46(1H,s),4.88-4.87(1H,m),4.48-4.08(3H,m), 4.07-3.69(4H,m),2.66-2.61(1H,m),2.41-2.31(1H,m),2.05-1.19(10H,m),1.45(3H,s), 0.93-0.83(6H,m).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:167.03,150.74,149.74,144.98,127.51, 122.58,115.53,112.88,110.25,104.15,101.99,87.96,81.14,66.41,65.87,55.99,52.52,44.41,37.51,36.45,34.61,30.87,26.24,24.70,24.46,20.34,13.00.HR MS calcd forC₂₇H₃₆O₉[M+Na]⁺527.2257,found 527.2258.

TM5-63-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2] dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propyl 2-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9- trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy) benzoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.87(1H,d,J＝7.5Hz),7.44(1H,t,J＝7.5Hz), 6.99-6.94(2H,m),5.38(1H,s),5.27(1H,s),4.81(2H,d,J＝3.0Hz),4.39(2H,t,J＝6.6Hz),4.20-4.01(4H,m),3.59-3.47(2H,m),2.65-2.57(2H,m),2.40-2.27(2H,m),2.18-1.09(24H,m), 1.42(3H,s),1.41(3H,s),0.92-0.80(12H,m).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:166.17,158.72, 133.52,132.16,120.08,112.75,103.97,103.91,102.02,101.69,87.81,87.61,81.10,81.03, 65.41,64.70,63.85,62.08,52.51,52.39,44.39,44.33,37.33,37.07,36.41,34.56,34.51, 30.91,30.89,29.02,28.85,26.16,24.58,24.54,24.51,24.48,20.33,20.31,13.01,12.99.HR MS calcd for C₄₃H₆₂O₁₃[M+Na]⁺809.4088,found809.4085.

TM5-73-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2] dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)benzoic acid

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.61(1H,d,J＝7.5Hz),7.51(1H,s),7.32(1H,t,J＝7.8Hz), 7.08(1H,dd,J＝1.8 and 8.1Hz),5.48(1H,s),4.84(1H,d,J＝3.3Hz),4.57-4.49(1H,m), 4.34-4.26(1H,m),4.15-4.08(1H,m),3.53-3.45(1H,m),2.68-2.60(1H,m),2.41-2.31(1H,m), 2.05-1.12(12H,m),1.45(3H,s),0.92(3H,d,J＝7.5Hz),0.87(3H,d,J＝5.7Hz).¹³C NMR (75MHz,CDCl₃)δ:166.50,156.28,131.50,129.92,121.79,120.45,116.34,104.61,102.18, 88.09,81.25,64.27,61.78,52.51,44.47,37.52,36.45,34.59,31.00,28.64,26.16,24.67, 24.64,20.39,13.09.HR MS calcd for C₂₅H₃₄O₈[M+Na]⁺485.2151,found 485.2151. TM5-84-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2] dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)benzoic acid

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.95(2H,d,J＝8.7Hz),6.88(2H,d,J＝8.7Hz),5.40(1H,s),4.81(1H,d,J＝3.3Hz),4.37(2H,t,J＝6.3Hz),4.07-4.00(1H,m),3.59-3.46(1H,m),2.66-2.61(1H,m),2.41-2.30(1H,m),2.07-1.20(12H,m),1.42(3H,s),0.92-0.90(6H,m).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:166.82,160.83,131.98,122.12,115.42,104.37,102.26,88.08,81.27,64.79,61.84,52.56,44.43,37.47,36.48,34.61,31.04,28.99,26.17,24.68,24.59, 20.42,13.08.HR MS calcd for C₂₅H₃₄O₈[M+Na]⁺485.2151,found 485.2150.

TM5-92-(4-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy [1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)phenyl)aceticacid

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.14(2H,d,J＝8.4Hz),6.79(2H,J＝8.4Hz),5.36(1H,s),4.71(1H,d,J＝3.0Hz),4.16(2H,t,J＝6.3Hz),3.91-3.84(1H,m),3.55(2H,s),3.39-3.32 (1H,m),2.63-2.55(1H,m),2.37(1H,td,J＝3.6 and 14.1Hz),2.06-1.19(12H,m),1.45(3H,s), 0.94(3H,d,J＝6.0Hz),0.86(3H,d,J＝7.2Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:172.56, 155.34,130.47,125.62,115.69,104.36,102.19,88.03,81.25,64.65,61.97,52.57,44.40, 40.58,37.49,36.47,34.61,30.96,28.85,26.18,24.71,24.54,20.43,13.01.HR MS calcd for C₂₆H₃₆O₈[M+Na]⁺499.2308,found 499.2311.

TM5-103-(4-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy [1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)phenyl)propanoic acid

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.61(1H,d,J＝15.9Hz),7.10-7.05(2H,m),6.92(1H,d,J＝8.1Hz),6.30(1H,d,J＝15.9Hz),5.40(1H,s),4.82(1H,d,J＝3.3Hz),4.28(2H,t,J＝6.3 Hz),4.06-3.99(1H,m),3.94(3H,s),3.53-3.45(1H,m),2.66-2.61(1H,m),2.36(1H,td,J＝3.6 and 14.4Hz),2.05-1.17(12H,m),1.43(3H,s),0.94-0.90(6H,m).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃) δ:178.79,157.62,132.30,129.30,114.55,104.17,101.93,87.89,81.19,64.64,64.35,52.55, 44.47,37.21,36.51,35.95,34.64,31.00,29.86,29.35,26.30,24.68,24.58,20.48,13.14.HR MS calcd for C₂₇H₃₈O₈[M+Na]⁺513.2464,found 513.2468.

TM5-11(E)-3-(3-Methoxy-4-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro- 3H-3,12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)phenyl)acrylic acid

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.12(2H,d,J＝8.4Hz),6.83(2H,d,J＝8.4Hz),5.32(1H,s),4.81(1H,d,J＝3.0Hz),4.13-4.06(1H,m),4.02(2H,t,J＝6.0Hz),3.54-3.47(1H,m),2.90(2H,t,J＝7.5Hz),2.67-2.59(3H,m),2.34(1H,td,J＝3.6 and 14.4Hz),2.08-1.12(12H, m),1.44(3H,s),0.88(3H,d,J＝7.2Hz),0.84(3H,d,J＝6.0Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃) δ:167.37,148.09,146.88,145.02,127.04,123.25,115.45,114.81,109.40,104.18,102.20, 88.01,81.21,64.77,61.59,56.05,52.63,44.48,37.51,36.51,34.68,31.00,29.04,26.31, 24.73,24.60,20.45,13.12.HR MS calcd for C₂₈H₃₈O₉[M+Na]⁺541.2414,found 541.2412.

(2)TM6-1～TM6-13

TM6-1 Methyl 2-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3H-3,12- epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)benzoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.84-7.76(1H,m),7.52-7.41(1H,m),7.06-6.96(2H),5.46(1H,s),4.90(1H,d,J＝3.3Hz),4.25-4.18(3H,m),3.93-3.80(4H,m),2.66-2.61(1H,m), 2.42-2.31(1H,m),2.05-1.19(10H,m),1.44(3H,s),0.93(3H,d,J＝6.0Hz),0.88(3H,d,J＝ 7.5Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:166.83,158.42,133.33,131.71,121.37,120.48,113.65,104.13,102.46,88.02,81.24,68.47,66.93,52.64,52.06,44.51,37.26,36.53,34.73, 30.95,26.29,24.75,24.42,20.44,12.99.HR MS calcd for C₂₅H₃₄O₈[M+Na]⁺485.2151, found 485.2150.

TM6-2 Methyl 3-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3H-3,12-ep oxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)benzoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.64(1H,d,J＝7.5Hz),7.56(1H,s),7.34(1H,t,J＝7.8Hz),7.11(1H,d,J＝8.1Hz),5.48(1H,s),4.90(1H,d,J＝3.3Hz),4.21-4.13(3H),3.92(3H,s), 3.83-3.75(1H,m),2.67-2.62(1H,m),2.43-2.32(1H,m),2.07-1.17(10H,m),1.45(3H,s), 0.93(3H,d,J＝6.0Hz),0.90(3H,d,J＝7.5Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:166.98,158.93,131.48,129.51,122.19,120.04,114.93,104.17,102.21,87.98,81.20,67.62,66.46, 52.60,52.29,44.48,37.52,36.49,34.67,30.95,26.28,24.76,24.48,20.41,13.03.

TM6-3 Methyl 2-(4-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3H-3,12- epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)phenyl)acetate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.19(2H,d,J＝7.8Hz),6.85(2H,d,J＝8.4Hz),5.48(1H,s),4.93-4.86(1H,m),4.17-4.10(3H,m),3.79-3.78(1H,m),3.69(3H,s),3.57(2H,s),2.72-2.54(1H,m),2.42-2.32(1H,m),2.07-1.18(10H,m),1.45(3H,s),0.94-0.89(6H,m).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:172.46,158.11,130.36,126.25,114.79,104.17,102.21,88.00,81.24,67.46,66.55,52.64,52.13,44.52,40.37,37.51,36.51,34.70,30.98,26.30,24.79, 24.50,20.45,13.07.

TM6-4 Methyl 3-(4-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3H-3,12- epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)phenyl)propanoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.00(2H,d,J＝8.7Hz),6.82(2H,d,J＝8.4Hz),5.48(1H,s),4.90(1H,d,J＝3.3Hz),4.18-4.05(3H,m),3.80-3.74(1H,m),3.67(3H,s),2.89(2H,t,J＝ 7.5Hz),2.66-2.57(3H,m),2.43-2.32(1H,m),2.06-1.17(10H,m),1.45(3H,s),0.93(3H,d,J＝ 6.0Hz),0.90(3H,d,J＝7.2Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:173.51,157.46,132.80, 129.29,114.73,104.15,102.19,87.99,81.23,67.44,66.59,52.63,51.70,44.52,37.49,36.51, 36.07,34.71,30.97,30.17,26.28,24.79,24.48,20.45,13.05.

TM6-5(E)-Methyl 3-(3-methoxy-4-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldeca hydro-3H-3,12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)phenyl)acrylate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.64(1H,d,J＝15.9Hz),7.09-7.05(2H,m),6.89(1H,d,J＝8.4Hz),6.31(1H,d,J＝15.9Hz),5.48(1H,s),4.88(1H,d,J＝3.0Hz),4.26-4.15(3H,m), 3.90-3.80(1H,m),3.88(3H,s),3.80(3H,s),2.66-2.61(1H,m),2.42-2.32(1H,m),2.05-1.16(10H,m),1.45(3H,s),0.92(3H,d,J＝6.0Hz),0.89(3H,d,J＝7.2Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:167.77,150.67,149.75,144.87,127.59,122.49,115.52,112.95,110.25, 104.11,102.22,87.98,81.21,68.19,66.48,55.99,52.58,51.73,44.50,37.32,36.50,34.74, 30.93,26.26,24.78,24.45,20.45,12.97.HR MS calcd for C₂₈H₃₈O₉[M+Na]⁺541.2414, found 541.2413.

TM6-6 Methyl 2-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3H-3,12-ep oxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)benzoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.83(1H,d,J＝7.8Hz),7.44(1H,t,J＝7.5Hz),7.00-6.93(2H,m),5.27(1H,s),4.82(1H,d,J＝3.0Hz),4.25-4.11(3H),3.91(3H,s),3.57-3.50(1H, m),2.62-2.57(1H,m),2.37-2.26(1H,m),2.14-0.95(12H,m),1.42(3H,s),0.86(3H,d,J＝7.2 Hz),0.81-0.78(3H,m).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:166.96,158.59,133.52,132.05,120.20, 120.13,112.81,103.99,101.78,87.70,81.11,65.27,63.77,52.48,52.20,44.41,37.12,36.49, 34.57,30.99,29.08,26.27,24.62,24.59,20.43,13.10.HRMS calcd for C₂₆H₃₆O₈[M+Na]⁺ 499.2308,found499.2306.

TM6-7 Methyl 3-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3H-3,12-ep oxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)benzoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.63(1H,d,J＝7.5Hz),7.55(1H,s),7.34(1H,t,J＝8.1Hz),7.11(1H,d,J＝8.1Hz),5.28(1H,s),4.82(1H,d,J＝3.3Hz),4.18-4.08(3H),3.91(3H,s), 3.55-3.45(1H,m),2.64-2.59(1H,m),2.38-2.28(1H,m),2.11-1.10(12H,m),1.44(3H,s), 0.88(3H,d,J＝7.5Hz),0.81(3H,d,J＝5.2Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:166.93,158.95, 131.37,129.39,121.98,119.99,114.38,104.00,101.82,87.73,81.02,64.70,63.99,52.40, 52.17,44.32,37.12,36.39,34.46,30.87,29.08,26.20,24.52,20.30,13.01.HR MS calcd for C₂₆H₃₆O₈[M+Na]⁺499.2308,found 499.2306.

TM6-8 Methyl 4-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3H-3,12-ep oxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)benzoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.99(2H,d,J＝8.7Hz),6.92(2H,d,J＝9.0Hz),5.28(1H,s),4.81(1H,d,J＝3.3Hz),4.18-4.09(3H),3.88(3H,s),3.54-3.48(1H,m),2.64-2.59(1H,m), 2.39-2.28(1H,m),2.11-1.10(12H,m),1.44(3H,s),0.88(3H,d,J＝7.5Hz),0.85-0.80(3H,m). ¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:166.93,162.88,131.69,122.62,114.09,104.14,101.94,87.83, 81.09,64.85,64.02,52.49,51.97,44.39,37.20,36.46,34.58,30.94,29.06,26.29,24.65, 24.58,20.32,13.10.HR MS calcd for C₂₆H₃₆O₈[M+Na]⁺499.2308,found499.2306. TM6-9 Methyl 2-(4-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3H-3,12- epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)phenyl)acetate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.18(2H,d,J＝8.4Hz),6.85(2H,d,J＝8.4Hz),5.33(1H,s),4.81(1H,d,J＝2.7Hz),4.13-4.01(3H,m),3.68(3H,s),3.56(2H,s),3.53-3.48(1H,m), 2.64-2.59(1H,m),2.40-2.29(1H,m),2.08-1.13(12H,m),1.44(3H,s),0.88(3H,d,J＝7.5Hz), 0.84(3H,d,J＝6.0Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:172.43,158.16,130.32,126.05, 114.56,104.11,101.93,87.86,81.14,64.63,64.34,52.54,52.10,44.45,40.38,37.22,36.49, 34.61,30.98,29.31,26.30,24.66,24.56,20.39,13.12.HR MS calcd forC₂₇H₃₈O₈[M+Na]⁺ 513.2464,found 513.2462.

TM6-10 Methyl 3-(4-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3H-3, 12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)phenyl)propanoate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.10(2H,d,J＝8.4Hz),6.82(2H,d,J＝8.7Hz),5.32(1H,s),4.81(1H,d,J＝3.3Hz),4.13-4.00(3H,m),3.67(3H,s),3.54-3.47(1H,m),2.89(2H,t,J＝ 7.5Hz),2.62-2.57(3H,m),2.39-2.29(1H,m),2.08-1.12(12H,m),1.45(3H,s),0.88(3H,d,J＝ 7.2Hz),0.84(3H,d,J＝6.0Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:173.52,157.53,132.59, 129.26,114.47,104.09,101.90,87.84,81.13,64.59,64.32,52.53,51.69,44.44,37.17,36.49, 36.06,34.62,30.97,30.17,29.32,26.29,24.65,24.55,20.45,13.11.HR MS calcd for C₂₈H₄₀O₈[M+Na]⁺527.2621,found 527.2623.

TM6-11(E)-Methyl 3-(3-methoxy-4-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldec ahydro-3H-3,12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)phenyl)acrylate

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.63(1H,d,J＝15.9Hz),7.08-7.05(2H,m),6.85(1H,d,J＝8.1Hz),6.31(1H,d,J＝15.9Hz),5.27(1H,s),4.81(1H,d,J＝3.0Hz),4.16-4.12(3H,m), 3.90(3H,s),3.80(3H,s),3.55-3.45(1H,m),2.64-2.59(1H,m),2.39-2.29(1H,m),2.13-1.11 (12H,m),1.43(3H,s),0.88(3H,d,J＝7.5Hz),0.81(3H,d,J＝5.4Hz).¹³C NMR(75MHz, CDCl₃)δ:167.79,150.72,149.58,144.94,127.38,122.54,115.41,112.16,109.80,104.05, 101.90,87.84,81.09,65.68,64.06,55.96,52.47,51.73,44.41,37.24,36.50,34.58,30.93, 29.08,26.31,24.70,24.56,20.49,13.11.HR MS calcd for C₂₉H₄₀O₉[M+Na]⁺555.2570, found 555.2569.

TM6-122-(4-(2-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy [1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)ethoxy)phenyl)acetamide

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.19(2H,d,J＝8.1Hz),6.89(2H,d,J＝8.1Hz),5.47(1H,s),4.90(1H,d,J＝3.0Hz),4.18-4.11(3H),3.81-3.76(1H,m),3.54(2H,s),2.67-2.62(1H,m), 2.43-2.32(1H,m),2.06-1.11(10H,m),1.45(3H,s),0.94(3H,d,J＝5.7Hz),0.91(3H,d,J＝ 7.5Hz).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:174.31,158.27,130.60,127.06,115.22,104.19,102.21,88.00,81.22,67.47,66.44,52.61,44.49,42.50,37.54,36.49,34.70,30.95,26.28, 24.80,24.50,20.46,13.06.HR MS calcd for C₂₅H₃₅NO₇[M+Na]⁺484.2311,found484.2311. TM6-132-(4-(3-(((3R,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-Trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy [1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)propoxy)phenyl)acetamide

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.18(2H,d,J＝8.4Hz),6.89(2H,d,J＝8.1Hz),5.34(1H,s),4.81(1H,d,J＝3.0Hz),4.12-4.02(3H),3.56-3.45(3H,m),2.63-2.59(1H,m),2.40-2.30(1H, m),2.09-1.11(12H,m),1.44(3H,s),0.90-0.85(6H,m).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:174.39, 158.37,130.54,126.86,114.99,104.13,101.96,87.86,81.12,64.73,64.41,52.51,44.41, 42.47,37.27,36.46,34.61,30.95,29.32,26.27,24.67,24.55,20.42,13.11.HR MS calcd for C₂₆H₃₇NO₇[M+Na]⁺498.2468,found 498.2466.

实施例6、TM5和TM6目标分子抗结核活性测试

美国礼来制药公司(Eli Lilly and Company)对实施例2制备出的TM5-1～TM5-11样 品、实施例4制备出的TM6-1～TM6-13样品的抗结核活性进行了测试，首先测试单浓度样品对结核分枝杆菌的百分抑制率；其次筛选出高活性分子进行多浓度测试；最后对多 种细胞进行测试。测试结果如表3所示。

表3 TM5和TM6系列目标分子对结核分枝杆菌H₃₇Rv的抑制率

表3结果表明，在20μM样品测试浓度下，比DHA抗结核活性好的化合物有6个， 其中TM6-3(含4-羟基苯乙酸酯结构)达到了50.8％；结构分析发现，含羧基酚、含酯 基酚和含酰胺基酚在结构适当时都可拥有较好抗结核活性，其中，含阿魏酸(TM5-5)、 阿魏酸甲酯(TM6-5,TM6-11)结构的分子几乎都具有较好的抗结核活性。本发明首次发 现，DHA的含羧基酚、含酯基酚和含酰胺基酚偶联物具有抗结核活性。

实施例7、TM5和TM6目标分子的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)活性测试

目标分子的GLP-1活性是由美国礼来制药公司进行测试的。本研究测试的是目标分 子的GLP-1分泌结果。实验操作如下：

实验之前，先把人源NCI-H716细胞的培养基换成分化培养基。实验当天，首先用含有BSA和DPP-IV抑制剂(终浓度分别为0.1％和1％)的HBSS缓冲液洗细胞2遍， 然后用该缓冲液(含有终浓度分别为0.1％和1％的BSA和DPP-IV抑制剂的HBSS缓冲 液)重悬细胞。接下来，把细胞按照10000个细胞/50μL/孔的密度接种到包被了多聚D- 赖氨酸的透明底黑色384孔板中。

待测化合物配制：待测化合物起始浓度为40μM，按照3倍梯度往下稀释。

化合物量效曲线确定：将上面配制好的化合物加到之前已经接种好细胞的384孔板 孔中，然后37℃培养2小时。在化合物刺激下，细胞分泌GLP-1到培养基中。细胞分 泌的GLP-1用384孔板格式的Alpha LISA assay试剂盒来定量。信号采集用的是Perkin Elmer公司的全功能酶标仪Envision。采集到的信号再通过GLP-1标准曲线拟合计算出 细胞合成的GLP-1多肽的量。

相对激动百分比的计算：以能激起细胞分泌最多GLP-1的化合物为标准，其余待测化合物的每个数据点得到的信号和标准化合物的最高信号(Maximum response)相除得出相对激动百分比。激动率(stimulation(％))和抑制率(inhibition(％))的计算公式如下所示：

其中，Max和Min的定义根据每个实验的最高信号和最低信号来定。IC₅₀或EC₅₀的计算是通过把计算出来的激动率或抑制率用standard 4parameter logistic andnon-linear regression拟合方程拟合算出。实验结果如表4、表5所示：

表4 TM5和TM6目标化合物的GLP-1百分激动活性

表5 TM6-13目标化合物GLP-1激动活性的EC₅₀值

从表4可以看出，当样品浓度为20μM时，DHA没有GLP-1激动活性，TM5系列 有3个目标化合物的GLP-1激动活性大于20％，活性最好为TM5-10(含4-羟基苯丙酸 结构单元)，达到了32.7％；TM6系列有1个目标化合物的GLP-1激动活性大于20％， 活性最好为TM6-13(含4-羟基苯乙酰胺结构单元)。从表5可知，所测分子TM6-13的 EC₅₀为13.9μM，具有一定的活性。

实施例8、TM5和TM6对降血脂靶点PCSK9抑制活性的研究

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9)是 2003年发现的一个脂质代谢调节蛋白，属于前蛋白转化酶(proproteinconvertase，PC)家 族,由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域组成，在肝脏、小肠和肾脏中 表达量较多，皮肤、神经系统中少量表达。大量研究发现，PCSK9能介导低密度脂蛋 白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)降解，调节血浆低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平。因此，抑制或降低PCSK9水平的治 疗方法可有效治疗高胆固醇血症，目前PCSK9作为一个新的治疗靶点已成为高胆固醇 血症研究的热点。

美国礼来制药公司公司对TM5和TM6系列分子进行了PCSK9抑制活性测试，活 性结果见表6。

表6部分TM5目标化合物的PCSK9的抑制活性结果

由表6可知，在第一轮单浓度活性筛选中，部分目标化合物的Basal_PCSK9 HepG2SP抑制活性较好，当样品浓度为5μM时，有12个目标化合物的PCSK9抑制率超过40％， 最高为98.0％，且除TM5-2和TM5-3，其他目标化合物的细胞毒性很低(百分抑制率低 于±6％)；多浓度筛选，在测试的11个目标化合物中有5个化合物的IC₅₀值低于4μM， 其中TM5-5和TM5-6的IC₅₀值分别低至0.39和0.83μM；同时，所测试分子的细胞毒 性很低，多数IC₅₀值大于50μM；在最后一轮活性筛选(confirmation)中，TM5-6、TM5-10 和TM6-6对PCSK9 ELISA RPH的抑制率都超过90％，TM5-6抑制活性最好，为101.4％， 相关的IC₅₀值也较低。本发明首次发现DHA与含羧基酚/酯基酚/酰胺基酚偶联物具有降 血脂活性，且活性较好。

实施例9、TM5和TM6对白细胞介素IL-17抑制活性研究

白细胞介素17(Interleukin 17，IL-17)主要由Th17细胞分泌，能作用于T细胞、巨噬细胞、粒细胞、皮细胞、纤维原细胞等多种细胞。迄今为止已发现六个IL-17家族 成员，分别是IL-17A、B、C、D、E、F。IL-17是一种重要的炎症因子，其通过与细胞 表面相应的受体IL-17RA/IL-17RC结合后刺激靶细胞分泌多种炎性细胞因子、趋化因 子及抗菌蛋白等，从而在机体的抗感染特别是抗胞外菌及真菌感染中发挥重要作用。同 时，IL-17的炎症特性使其与多种自身免疫性疾病如类风湿关节炎(RA)、多发性硬化 (MS)、系统性红斑狼疮(SLE)及银屑病等密切相关。因此，开发IL-17小分子抑制剂 是非常具有前景的研究课题。

IL-17的抑制活性测定：对培养的基因重组IL-17A刺激细胞通过目标化合物10μM单浓度(SP)抑制活性测试和多浓度(CRC)抑制活性测试，通过(基于微 珠的化学发光的均相免疫检测试剂盒，PerkinElmer)测定目标化合物的IL-17抑制活性。

美国礼来制药公司对我们的化合物进行了IL-17的生物活性测试，结果见表7。

表7部分目标化合物的IL-17的活性结果

表7活性结果显示：TM5和TM6系列的目标分子在10μM的样品浓度下对IL-17 具备一定的抑制作用，绝大多数分子的IL-17分泌抑制活性超过50％，细胞毒性很低 (％stim<20％)，且和IL-5分泌抑制活性存在差别，显示一定的选择性；测试过的分子， 其IL-17和IL-5分泌抑制活性存在差别(2倍甚至10倍以上)，活性有高有低，低者IC₅₀ <1μM；测试过的分子，对antiCD3/antiCD28/IL23_PBMC的细胞毒性很低(IC₅₀>30 μM)。对HEK-293细胞的第二轮测试中，两种测试结果都有差别，且IC₅₀有高有低，最 低者达到0.134μM。总体来说，有6个目标化合物进行了两轮活性测试，说明这几个化 合物有进一步研究的价值和应用的潜力。本发明首次发现DHA与含羧基酚/酯基酚/酰胺 基酚偶联物具有免疫病方面的生物活性。

本发明中涉及的未说明部分与现有技术相同或采用现有技术加以实施。