阅读说明：本技术 一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法 (A method of low-viscosity konjac glucomannan is efficiently prepared using the thick enzyme of abalone internal organ ) 是由 孙乐常 文嘉欣 曹敏杰 张凌晶 章骞 陈玉磊 于 2019-08-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于魔芋胶酶解技术领域,公开了一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法,包括以下步骤：取鲍鱼内脏,用缓冲液抽提、离心后冷冻干燥制成粗酶,再加入魔芋胶溶液中,在一定条件下进行酶解反应,得到不同程度的低黏度魔芋胶酶解产物。本发明采用鲍鱼内脏为原料提取粗酶,并用该粗酶降解魔芋胶,以此得到低黏度目标产物,反应可控性强、条件温和、对设备无腐蚀。本发明利用低值的鲍鱼内脏,不仅减少资源浪费和环境污染,还可大幅降低生产成本。(The invention belongs to konjac glucomannan zymolysis technique fields, disclose a kind of method for efficiently preparing low-viscosity konjac glucomannan using the thick enzyme of abalone internal organ, the following steps are included: taking abalone internal organ, thick enzyme is made with freeze-drying after buffer extractions, centrifugation, it adds in konjaku sol solution, enzyme digestion reaction is carried out under certain condition, obtains different degrees of low-viscosity konjac glucomannan enzymolysis product.The present invention uses abalone internal organ to extract thick enzyme for raw material, and with the thick enzyme degraded konjak, obtains low-viscosity target product with this, and reaction controllability is strong, mild condition, corrosion-free to equipment.The present invention utilizes the abalone internal organ of low value, not only reduces the wasting of resources and environmental pollution, production cost can also be greatly reduced.)

一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法

技术领域

本发明涉及魔芋胶酶解技术领域，特别涉及一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法。

背景技术

魔芋胶的主要活性成分魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan，KGM)，是一种水溶性非离子型的高分子多糖，它是由D-葡萄糖和D-甘露糖按1：1.6的摩尔比通过β-1，4和少量的β-1，3吡喃糖苷键结合形成的线性无规则共聚物，拥有5％至10％的乙酰基取代残基。大约每19个糖残基上有一个以酯键结合的乙酰基附着在C-6位置上。魔芋胶不能被人体消化道的消化酶水解，是一种非热量不可消化的膳食纤维。 KGM已被证明能够疏通肠道，促进肠道活动，增强免疫力，且具有降低血液中胆固醇、血糖水平和脂肪含量的功效。

魔芋葡甘聚糖几乎是目前研究的多糖中黏度最高的一种天然多糖，可吸水膨胀80～100倍，具有良好的增稠性能。天然魔芋胶由于黏度过大、稳定性差、易降解，不易存放等缺点，限制了其在食品工业中的应用。目前，降解多糖的主要方法是酸降解法和酶降解法。

现有技术中，陈运忠开发出一种魔芋葡甘聚糖的酸降解制备方法(CN 103665182A)其生产周期短，其中的溶剂酒精，限制了葡甘聚糖的溶胀，不成糊、黏度低、便于回收，但生产过程中使用了大量的乙醇、浓盐酸和氢氧化钠，生产成本较高，生产过程中产生大量工业废水造成环境污染。姚静等人开发了一种低粘度纯化魔芋微粉的制备方法(CN103734645 A)，虽然用酒精浸泡和高温处理的方法降低了魔芋胶的粘度，但是高温高压处理能耗较高，使用了大量乙醇，生产成本较高，产生工业废水造成环境污染。

生物酶降解法是目前运用最广的方法。酶降解法以其清洁、可控性强、条件温和、对设备无腐蚀等优点被广泛应用于天然植物多糖的降解中。而魔芋胶降解使用的酶是需能够切断β-1,4吡喃糖苷键的内切糖苷酶。目前，这类酶主要是β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶。钟耕等人开发出一种利用β-甘露聚糖酶制备低粘度辛烯基琥珀酸魔芋葡甘聚糖酯的方法(CN 109355332 A)，虽然在1wt％浓度条件下的粘度可低至2700mPa.s，但是微波处理增加了能耗，生产成本较高，反复使用乙醇洗涤造成了资源浪费和环境污染。

鲍鱼是一种名贵的海产品，以褐藻、红藻、马尾藻和裙带菜等为食，其内脏约占鲍鱼体重的20％-30％。在鲍鱼加工过程中，鲍鱼内脏是常见的加工副产物，通常被直接丢弃或做为动物饲料使用。但是鲍鱼内脏中富含能高效降解多糖的各类糖苷酶，是天然的糖苷酶库。曹敏杰等人开发出一种以鲍鱼内脏为原料制备纤维素酶的方法(CN 103589703 A)和一种以鲍鱼内脏为原料制备褐藻胶裂解酶的方法(CN 104774827 A)，利用鲍鱼内脏提取粗酶液，再经过活性炭处理后过滤除去活性炭，滤液经过柱层析、膜处理制备了高纯度、高活力的酶制剂。张志山开发出一种鲍鱼内脏b-葡萄糖苷酶及其用于合成红景天苷的方法(CN104404013 A)，虽然利用鲍鱼内脏制备的b-葡萄糖苷酶合成的红景天苷的活性很高，但是过程中使用了大量的有机试剂产生工业废水，对环境造成了污染。目前利用生物酶降解法制备低黏度魔芋胶的方法并不多见，因此，开发具有高效率的鲍鱼内脏粗酶用于制备低黏度魔芋胶具有极大地市场应用价值。本发明中所涉及的工具酶来源于鲍鱼加工下脚料，成本低、酶解效率高，还可以减少资源浪费和环境污染。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法，其环保、稳定且高效。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法，包括如下步骤：

(1)制取鲍鱼内脏粗酶：将鲍鱼内脏用清水洗净，与20mM磷酸盐缓冲液混合后放置在组织捣碎机中匀浆，在4℃条件下，10000×g离心20min取上清，3％活性炭在25℃条件下，180rpm混合均匀30min 除杂除腥后冷冻干燥获得鲍鱼内脏粗酶；

(2)制备魔芋胶粉：将步骤(1)制备的鲍鱼内脏粗酶均匀加入到2％魔芋胶溶液中，充分混匀后50℃条件下加热反应一定时间，反应完毕后，沸水浴中灭酶10min，冷冻干燥，得到酶解魔芋胶粉；

(3)将步骤(2)制备得到的酶解魔芋胶粉均匀分散在蒸馏水中形成酶解魔芋胶水溶液，测其黏度。

作为优选的，所述的鲍鱼内脏为新鲜鲍鱼内脏或冻存的鲍鱼内脏。

作为优选的，所述的鲍鱼内脏包括皱纹盘鲍、杂色鲍、九孔鲍等常见鲍鱼的内脏。

作为优选的，在步骤(1)中，所用的20mM磷酸盐缓冲液的pH为5.0-7.0，最优pH为6.0。

作为优选的，在步骤(1)中，所用的鲍鱼内脏与磷酸盐缓冲液的比例为1:3-1:5(w/v)，最优比例为1:4(w/v)。

作为优选的，在步骤(1)中，制备的鲍鱼内脏粗酶的酶活为2000U/g以上。

作为优选的，在步骤(2)中，所用的鲍鱼内脏粗酶液与魔芋胶的用量比为100U：1g。

作为优选的，在步骤(2)中，酶解的时间为30-120min。

作为优选的，在步骤(3)中，制出的酶解魔芋胶水溶液浓度为1％。

本发明的有益效果为：采用鲍鱼内脏为原料提取粗酶，并用该粗酶降解魔芋胶，以此得到低黏度目标产物，反应可控性强、条件温和、对设备无腐蚀，不仅拓宽了传统魔芋胶的应用范围，且能有效利用鲍鱼内脏，减少资源浪费和环境污染，具有显著的环保效应。

附图说明

图1为利用不同的酶分解魔芋胶的效率的结果图。

具体实施方式

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法，包括如下步骤：

(1)制取鲍鱼内脏粗酶：将鲍鱼内脏用清水洗净，与20mM磷酸盐缓冲液混合后放置在组织捣碎机中匀浆，所用磷酸盐缓冲液的pH为5.0-7.0，最优pH为6.0；

鲍鱼内脏与磷酸盐缓冲液的比例为1:3-1:5(w/v)，最优比例为1:4(w/v)；

然后在4℃条件下，10000×g离心20min取上清，3％活性炭在25℃条件下，180rpm混合均匀30min 除杂除腥后冷冻干燥获得鲍鱼内脏粗酶，制备的鲍鱼内脏粗酶的酶活为2000U/g以上；

(2)制备魔芋胶粉：将步骤(1)制备的鲍鱼内脏粗酶均匀加入到2％魔芋胶溶液中，鲍鱼内脏粗酶液与魔芋胶的用量比为100U：1g，充分混匀后50℃条件下加热反应，酶解30-120min，反应完毕后，沸水浴中灭酶10min，冷冻干燥，得到酶解魔芋胶粉；

(3)将步骤(2)制备得到的酶解魔芋胶粉均匀分散在蒸馏水中形成酶解魔芋胶水溶液，制出的酶解魔芋胶水溶液浓度为1％，最后测其黏度。

作为优选的，鲍鱼内脏为新鲜鲍鱼内脏或冻存的鲍鱼内脏，包括皱纹盘鲍、杂色鲍、九孔鲍等福建地区常见鲍鱼的内脏；鲍鱼鲍鱼内脏是鲍鱼加工的下脚料，通常被直接丢弃或做为动物饲料使用，但含有丰富的营养成分，是天然的多类型糖苷酶库，具有成本低、酶解效率高的特点。

酶活定义为：在37℃的条件下，每min分解1％羧甲基纤维素钠产生1mmol/L还原性糖所需的酶量定义为1个酶活力单位。

实施例一：

一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法，包括如下步骤：

(1)将鲍鱼内脏用清水洗净，切割成1-3cm的窄条状，与20mM磷酸盐缓冲液混合后放置在组织捣碎机中匀浆，在4℃条件下，10000×g离心20min取上清，3％活性炭在25℃条件下，180rpm混合均匀 30min除杂除腥后冷冻干燥获得鲍鱼内脏粗酶；

(2)将200U/g的鲍鱼内脏粗酶水溶液均匀加入到100mL魔芋胶溶液(2％)中，充分混匀后50℃条件下加热反应30min，反应完毕后，沸水浴中灭酶10min，冷冻干燥，得到酶解魔芋胶粉；

(3)干燥后经粉碎得到的白色粉末即为低黏度魔芋胶粉，在25℃条件下检测其1wt％浓度的黏度为 4865mPa.s，重均分子量为1655kDa。

实施例二：

一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法，包括如下步骤：

(1)将鲍鱼内脏用清水洗净，切割成1-3cm的窄条状，与20mM磷酸盐缓冲液混合后放置在组织捣碎机中匀浆，在4℃条件下，10000×g离心20min取上清，3％活性炭在25℃条件下，180rpm混合均匀30min除杂除腥后冷冻干燥获得鲍鱼内脏粗酶；

(2)将200U/g的鲍鱼内脏粗酶水溶液均匀加入到100mL魔芋胶溶液(2％)中，充分混匀后50℃条件下加热反应60min，反应完毕后，沸水浴中灭酶10min，冷冻干燥，得到酶解魔芋胶粉；

(3)干燥后经粉碎得到的白色粉末即为低黏度魔芋胶粉，在25℃条件下检测其1wt％浓度的黏度为 3775mPa.s，重均分子量为1621kDa。

实施例三：

一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法，包括如下步骤：

(1)将鲍鱼内脏用清水洗净，切割成1-3cm的窄条状，与20mM磷酸盐缓冲液混合后放置在组织捣碎机中匀浆，在4℃条件下，10000×g离心20min取上清，3％活性炭在25℃条件下，180rpm混合均匀 30min除杂除腥后冷冻干燥获得鲍鱼内脏粗酶；

(2)将200U/g的鲍鱼内脏粗酶水溶液均匀加入到100mL魔芋胶溶液(2％)中，充分混匀后50℃条件下加热反应90min，反应完毕后，沸水浴中灭酶10min，冷冻干燥，得到酶解魔芋胶粉；

(3)干燥后经粉碎得到的白色粉末即为低黏度魔芋胶粉，在25℃条件下检测其1wt％浓度的黏度为3135mPa.s，重均分子量为1403kDa。

实施例四：

一种利用鲍鱼内脏粗酶高效制备低黏度魔芋胶的方法，包括如下步骤：

(1)将鲍鱼内脏用清水洗净，切割成1-3cm的窄条状，与20mM磷酸盐缓冲液混合后放置在组织捣碎机中匀浆，在4℃条件下，10000×g离心20min取上清，3％活性炭在25℃条件下，180rpm混合均匀 30min除杂除腥后冷冻干燥获得鲍鱼内脏粗酶；

(2)将200U/g的鲍鱼内脏粗酶水溶液均匀加入到100mL魔芋胶溶液(2％)中，充分混匀后50℃条件下加热反应120min，反应完毕后，沸水浴中灭酶10min，冷冻干燥，得到酶解魔芋胶粉；

(3)干燥后经粉碎得到的白色粉末即为低黏度魔芋胶粉，在25℃条件下检测其1wt％浓度的黏度为 2755mPa.s，重均分子量为1243kDa。

在上述四个实施例中，只有步骤(2)中的混合加热反应时间不同，分别为30min、60min、90min、 120min，由上述实施例可知，本发明制得的目标产物酶解魔芋胶黏度低，在25℃条件下1wt％浓度酶解产物的黏度最低为2755mPa.s，重均分子量最低为1243kDa；

对比四个实施例可知，酶解的时间越长，在25℃条件下1wt％浓度的黏度越低，重均分子量为越小。

实施例五：

对鲍鱼内脏粗酶、市售纤维素酶酶以及市售甘露聚糖酶对魔芋胶的酶解效率进行比较分析，步骤如下：

(1)制取鲍鱼内脏粗酶：将鲍鱼内脏用清水洗净，切割成1-3cm的窄条状，与20mM磷酸盐缓冲液混合后放置在组织捣碎机中匀浆，在4℃条件下，10000×g离心20min取上清，3％活性炭在25℃条件下，180rpm混合均匀30min除杂除腥后冷冻干燥获得鲍鱼内脏粗酶；

(2)使用魔芋胶溶液检测酶活：在2mL离心管中依次加入600μL魔芋胶溶液(1％)和50μL鲍鱼内脏粗酶水溶液(10mg/mL)和市售纤维素酶(20mg/mL)，市售β-甘露聚糖酶(10mg/mL)，充分混匀后在37℃条件下反应30min，反应完毕后，在沸水浴灭酶15min，经10000×g离心10min，取上清200 μL加到600μL DNS试剂中，混合均匀后，在95℃条件下显色15min，立即用冰水冷却，加蒸馏水定容至5mL，与波长540nm处测其吸光度值，结果如图1所示。酶活定义为：在37℃的条件下，每min分解1％底物产生1mmol/L还原性糖所需的酶量定义为1个酶活力单位。

由图1可知，在鲍鱼内脏粗酶、市售纤维素酶和β-甘露聚糖酶酶活相同的条件下利用三种酶分解魔芋胶，与市售纤维素酶和β-甘露聚糖酶相比，鲍鱼内脏粗酶酶解效率分别是市售纤维素酶和市售β-甘露聚糖酶的273％和631％。

本发明的有益效果为：采用鲍鱼内脏为原料提取粗酶，并用该粗酶降解魔芋胶，以此得到低黏度目标产物，反应可控性强、条件温和、对设备无腐蚀，不仅拓宽了传统魔芋胶的应用范围，且能有效利用鲍鱼内脏，减少资源浪费和环境污染，具有显著的环保效应。

以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。