阅读说明：本技术 一种石榴酸的制备方法 (A kind of preparation method of punicic acid ) 是由 姚倩 郭晓强 赵琦 杨萍 申元福 李小红 周闯 于 2019-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种石榴酸的制备方法,具体制备过程是：取石榴籽油混合脂肪酸,加入有机溶剂溶解,在-30～-10℃下冷冻0.5～2h,若全部冻结为固态,则取固态冷冻物,室温下放置,分段收集熔化物,靠后熔出的部分为富含石榴酸的片段,将富含石榴酸的片段除去有机溶剂即得高纯度石榴酸。本发明利用石榴酸与其他脂肪酸熔点的差异达到分离目的,具有生产周期短、收率高、成本低、操作简便等优点。(The invention discloses a kind of preparation methods of punicic acid, specific preparation process is: taking granada seed oil fatty acid mixed, organic solvent dissolution is added, 0.5~2h is freezed at -30~-10 DEG C, if all freezing to take solid-state frozen material for solid-state, it places at room temperature, Fractional Collections melt, the part melted out rearward are the segment rich in punicic acid, and the segment that will be enriched in punicic acid removes organic solvent up to high purity punicic acid.The present invention, which is reached using punicic acid with the difference of other fatty acid fusing points, separates purpose, has many advantages, such as with short production cycle, high income, at low cost, easy to operate.)

一种石榴酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种石榴酸的制备方法，特别是高纯度石榴酸的制备方法。

背景技术

石榴酸为石榴籽油中所含的主要脂肪酸，占到脂肪酸总重的60％以上。石榴酸具有降血脂、降血压、预防心脑血管疾病、抗菌和抗炎等多种功效，是石榴籽油发挥药理作用的最重要组分。将石榴酸从石榴籽油中分离纯化出来，有助于提高活性和疗效，降低服用剂量，方便制剂成型。

石榴酸在石榴籽油中以甘油酯和磷脂的形式存在，需要先经皂化反应将石榴籽油中的脂肪酸酯分解为脂肪酸，再进一步从混合脂肪酸中分离出高纯度的石榴酸。常用的分离技术为柱色谱分离，混合物经过不同极性的色谱柱，经洗脱和分段收集，可以获得高纯度的目标化合物，缺点为耗时长，目标化合物常被色谱柱吸附，导致产率低；过柱的有机溶剂用量大，常需回收后再利用。专利“一种生产高纯度石榴酸的方法”(专利号ZL200510012802.5)采用尿素包合法制备高纯度石榴酸，首先通过超临界二氧化碳萃取技术得到石榴籽油，再将石榴籽油经皂化、酸化及提取等步骤处理后得到石榴籽油混合脂肪酸；将尿素溶解在甲醇中加至混合脂肪酸内，冷冻10h以上，抽滤，沉淀为含尿素的饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸，滤液为石榴酸甲醇溶液，去除甲醇后，石榴酸含量可达92％。尿素包合法的原理为：尿素易与饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸结合，经冷冻后，分成固液二态，固体里主要含尿素与饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸的结合物，滤液中富集了含二个或二个以上双键的多不饱和脂肪酸，除去尿素和有机溶剂后，多不饱和脂肪酸的含量显著提高。此法的缺点为：在滤液中实际也含有少量溶解的尿素，需要经过酸化和提取处理方可除去尿素(赵萍,等.尿素包合法对葵花籽油中亚油酸的富集研究.油脂工程,2015,12,31-34.)，操作较为繁琐，提取过程中石榴酸损失较大，导致最后收率不高。此外，冷冻时间在10h以上，生产周期长，效率偏低。

目前还未见采用冷冻结晶方法从石榴籽油混合脂肪酸中分离石榴酸的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耗时短、成本低、收率高且操作简单的高纯度石榴酸的制备方法。

本发明提供的石榴酸的制备方法是：取石榴籽油混合脂肪酸，加入有机溶剂溶解，在-30～-10℃下冷冻0.5～2h，若全部冻结为固态，则取固态冻结物，室温下放置，分段收集熔化物，靠后熔出的部分为富含石榴酸的片段，将富含石榴酸的片段除去有机溶剂即得高纯度石榴酸。

进一步地，将所得高纯度石榴酸进行含量检测，若含量未达到要求，则将经一次冷冻结晶处理所得高纯度石榴酸再进行一次或二次冷冻结晶处理，直至石榴酸含量达到要求。

进一步地，所述靠后熔出的部分是指最后30％～60％熔出物。

进一步地，若石榴籽油混合脂肪酸溶于有机溶液并经冷冻处理后，仅部分冻结为固态，则滤过，收集滤器上的残留物即得石榴酸。

进一步地，所述有机溶剂为丙酮、无水乙醇、甲醇、正己烷、石油醚中的一种或一种以上的组合。

进一步地，所述有机溶剂的加入量为石榴籽油混合脂肪酸重量的8～20 倍。

进一步地，所述石榴籽油混合脂肪酸由石榴籽油经皂化、酸化、提取及除去有机溶剂后制得，具体步骤是：取石榴籽油，按1:10至1:20的比例加入浓度为3％至10％的KOH-95％乙醇溶液，在70-90℃水浴下加热回流 1-2h，加适量温水溶解皂化物，冷至室温，用酸调节pH至2-4，搅拌10-30 min，使脂肪酸充分游离，再用有机溶剂提取其中的脂肪酸；取有机溶剂层，用温水洗涤至洗液为中性，加入无水硫酸钠干燥，滤过，于旋转蒸发仪上蒸发除去有机溶剂，即得混合脂肪酸。所述提取脂肪酸的有机溶剂，为石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、环己烷中的一种或一种以上的组合。

石榴籽油中所含的不饱和脂肪酸主要包括油酸、亚油酸及石榴酸，它们均为十八碳烯酸，分别含有一、二和三个双键，烯键引起分子间的结合力增大，凝固点下降，与有机溶剂在-10℃以下冷冻后，经室温放置，饱和脂肪酸因熔点较高，最先随有机溶剂熔化，随后为含一个双键的油酸及含二个双键的亚油酸，最后熔化的为含三个双键的石榴酸，通过分段收集混合脂肪酸与有机溶剂的熔化物，并将靠后熔出的富含石榴酸片段除去有机溶剂,即可获得石榴酸。

本发明利用石榴酸与其他脂肪酸熔点的差异达到分离目的，仅包含冷冻、熔化和除溶剂三个步骤，冷冻时间在2h以下，具有生产周期短、收率高、成本低、操作简便等优点。实验证明经一次冷冻结晶，石榴酸纯度可由78％提高至85％以上，经二次冷冻结晶，石榴酸纯度可达到89％以上(所采用的石榴籽油为自制的，其石榴酸含量为75％以上)。

附图说明

图1为实施例1中经一次冷冻结晶后最后熔出片段的GC图。

图2为实施例1中经二次冷冻结晶后最后熔出片段的GC图。

图3为实施例1中经三次冷冻结晶后最后熔出片段的GC图。

图中：1、癸酸(内标)；2、棕榈酸；3、亚油酸；4、油酸；5、硬脂酸；6、石榴酸；7-9、石榴酸异构体。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

(1)混合脂肪酸的制备

A.取自制石榴籽油，加入石榴籽油重量18倍的浓度为3％的KOH-95％乙醇溶液，在70℃水浴下加热回流2h；

B.加适量温水溶解沉淀(皂化物)，并用盐酸调节pH值至2，搅拌20min；

C.加等体积正己烷提取，静置分层，取上层有机相；用水少量多次地洗涤有机层，至洗液为中性；

D.加入无水硫酸钠，边加边搅拌，至不结块，静置30min；滤过，收集滤液，旋转蒸发除去正己烷，得石榴籽油混合脂肪酸；经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为78.47％。

(2)石榴酸的制备

A.取石榴籽油混合脂肪酸，称重，加入混合脂肪酸重量8倍的丙酮，充分搅拌使混合脂肪酸溶解，然后-30℃冷冻1h；

B.将上述混合脂肪酸溶解液冷冻后从冷冻室取出，置于室温下使其缓慢熔化，收集最后40％的熔出物，即得富含石榴酸片段；

C.将富含石榴酸片段旋转蒸发除去丙酮，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为85.24％；

D.将经第一次冷冻结晶处理获得的脂肪酸混合物称重，加入其重量8倍的丙酮，进行第二次冷冻结晶处理，冷冻温度和时间与第一次冷冻结晶处理相同；

E.取固态冷冻物，室温下熔化，收集后50％的熔出物，旋转蒸发除去丙酮，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为89.26％；

F.将经第二次冷冻结晶处理获得的脂肪酸混合物称重，加入其重量8倍的丙酮，进行第三次冷冻结晶处理，冷冻温度和时间与第一次冷冻结晶处理相同；

G.取固态冷冻物，室温下熔化，收集后60％的熔出物，旋转蒸发除去丙酮，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为90.71％；

用GC检测熔出物中石榴酸含量的测定条件为：固定相为HP-5毛细管柱 (30m×0.32mm×0.25μm)，载气为高纯氮气，柱流量1.2mL/min，分流比 20:1，进样口温度270℃，FID检测器温度310℃。毛细管柱程序升温：90℃开始，保持3min，以15℃/min的速度升到180℃，保持10min，再以2.5℃ /min的速度升到250℃。进样量1μL。

原混合脂肪酸中，按峰面积比计算，石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为78.47％，与内标比值为7.47。经一次冷冻结晶后，石榴酸及其C18 共轭三烯酸异构体的总含量为85.24％，与内标的比值为7.97(见图1)；经二次冷冻结晶后，石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体的总含量升至89.26％，与内标的比值9.67(见图2)；经第三次冷冻结晶处理后，石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体的总含量为90.71％，与内标的比值为9.98(见图3)。由图可知，饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸峰高随冷冻结晶处理次数的增加略有下降，而石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体的峰高在逐步升高，表明其百分含量及纯度在提高。

实施例2

(1)混合脂肪酸的制备

A.取市售石榴籽油，加入石榴籽油重量10倍的浓度为8％的KOH-95％乙醇溶液，在80℃水浴下加热回流1.5h；

B.加适量温水溶解沉淀(皂化物)，并用稀硫酸调节pH值至3，搅拌 30min；

C.加等体积石油醚提取，静置分层，取上层有机相；用水少量多次地洗涤有机层，至洗液为中性；

D.加入无水硫酸钠，边加边搅拌，至不结块，静置20min；滤过，收集滤液，旋转蒸发除去石油醚，得石榴籽油混合脂肪酸；经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为67.37％；

(2)石榴酸的制备

A.取石榴籽油混合脂肪酸，称重，加入混合脂肪酸重量12倍的无水乙醇，充分搅拌使混合脂肪酸溶解，然后-10℃冷冻2h；

B.将上述混合脂肪酸溶解液冷冻后从冷冻室取出，混合脂肪酸溶解液仅部分冷冻为固态，滤过，取滤层上的固态冷冻物，即得富含石榴酸片段；

C.将富含石榴酸片段旋转蒸发除去乙醇，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为75％。

本实施例中GC检测的测定条件与实施例1相同。

实施例3

(1)混合脂肪酸的制备

A.取自制石榴籽油，加入石榴籽油重量15倍的浓度为5％的KOH-95％乙醇溶液，在60℃水浴下加热回流2h；

B.加适量温水溶解沉淀(皂化物)，并用盐酸调节pH值至2，搅拌10min；

C.加等体积二氯甲烷提取，静置分层，取上层有机相；用水少量多次地洗涤有机层，至洗液为中性；

D.加入无水硫酸钠，边加边搅拌，至不结块，静置30min；滤过，收集滤液，旋转蒸发除去二氯甲烷，得石榴籽油混合脂肪酸；经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为79.2％；

(2)石榴酸的制备

A.取混合脂肪酸，称重，加入混合脂肪酸重量18倍的正己烷，充分搅拌使混合脂肪酸溶解，然后-20℃冷冻1.5h；

B.将上述混合脂肪酸溶解液冷冻后从冷冻室取出，置于室温下使其缓慢熔化，收集最后30％的熔出物，即得富含石榴酸片段；

C.将富含石榴酸片段旋转蒸发除去正己烷，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为87％；

D.将经第一次冷冻结晶处理获得的脂肪酸混合物称重，加入其重量10 倍的正己烷，进行第二次冷冻结晶处理，冷冻温度和时间与第一次冷冻结晶处理相同；

E.取固态冷冻物，室温下熔化，收集最后60％的熔出物，旋转蒸发除去正己烷，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18 共轭三烯酸异构体总含量为91％。

本实施例中GC检测的测定条件与实施例1相同。

实施例4

(1)混合脂肪酸的制备

制备过程与实施例1相同

(2)石榴酸的制备

A.取混合脂肪酸，称重，加入混合脂肪酸重量5倍的丙酮和4倍的甲醇，充分搅拌使混合脂肪酸溶解，然后-30℃冷冻1h；

B.将上述混合脂肪酸溶解液冷冻后从冷冻室取出，置于室温下使其缓慢熔化，收集最后50％的熔出物，即得富含石榴酸片段；

C.将富含石榴酸片段旋转蒸发除去丙酮和甲醇，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为78.1％；

D.将经第一次冷冻结晶处理获得的脂肪酸混合物称重，加入其重量5倍的丙酮和4倍的甲醇，进行第二次冷冻结晶处理，冷冻温度和时间与第一次冷冻结晶处理相同；

E.取固态冷冻物，室温下熔化，收集最后50％的熔出物，旋转蒸发除去丙酮和甲醇，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其 C18共轭三烯酸异构体总含量为84％；

F.将经第二次冷冻结晶处理获得的脂肪酸混合物称重，加入其重量5倍的丙酮和4倍的甲醇，进行第三次冷冻结晶处理，冷冻温度和时间与第一次冷冻结晶处理相同；

G.取固态冷冻物，室温下熔化，收集最后60％的熔出物，旋转蒸发除去丙酮和甲醇，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其 C18共轭三烯酸异构体总含量为90％。

本实施例中GC检测的测定条件与实施例1相同。

实施例5

(1)混合脂肪酸的制备

制备过程与实施例1相同

(2)石榴酸的制备

A.取混合脂肪酸，称重，加入混合脂肪酸重量5倍的石油醚、4倍的正己烷及3倍的丙酮，充分搅拌使混合脂肪酸溶解，然后-20℃冷冻2h；

B.将上述混合脂肪酸溶解液冷冻后从冷冻室取出，置于室温下使其缓慢熔化，收集最后60％的熔出物，即得富含石榴酸片段；

C.将富含石榴酸片段旋转蒸发除去石油醚、正己烷和丙酮，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为79.2％；

D.将经第一次冷冻结晶处理获得的脂肪酸混合物称重，加入其重量3.5 倍石油醚、2.8倍正己烷及2.1倍丙酮，进行第二次冷冻结晶处理，冷冻温度和时间与第一次冷冻结晶处理相同；

E.取固态冷冻物，室温下熔化，收集最后60％的熔出物，旋转蒸发除去石油醚、正己烷和丙酮，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为85％；

F.将经第二次冷冻结晶处理获得的脂肪酸混合物称重，加入其重量3.5 倍石油醚、2.8倍正己烷及2.1倍丙酮，进行第三次冷冻结晶处理，冷冻温度和时间与第一次冷冻结晶处理相同；

G.取固态冷冻物，室温下熔化，收集最后60％的熔出物，旋转蒸发除去石油醚、正己烷和丙酮，得富含石榴酸的脂肪酸混合物，经GC检测其中石榴酸及其C18共轭三烯酸异构体总含量为89％。

本实施例中GC检测的测定条件与实施例1相同。

以上所述仅是本发明优选的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何基于本发明所提供的技术方案和发明构思进行的改造和替换都应涵盖在本发明的保护范围内。