阅读说明：本技术 一种基于微生物互养互作与电发酵耦合梯级产氢产乙醇的方法 (A method of step hydrogen-producing and ethanol-producing is coupled with electricity fermentation based on microorganism syntrophism interaction ) 是由 邢德峰 李�真 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：一种基于微生物互养互作与电发酵耦合梯级产氢产乙醇的方法,属于发酵产氢技术领域。本发明为了解决现有生物发酵制氢和生物发酵产乙醇过程中发酵细菌受代谢产物抑制,产氢效率低、产乙醇纯度低等问题。本发明将发酵产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3和电活性细菌地杆菌PCA在微生物电发酵MEF反应器中进行共培养,通过细菌代谢互作及微生物电发酵系统两步法梯级制取氢气和乙醇。与传统方法相比,本发明大大提高了氢气产率和乙醇纯度,降低了微生物电发酵系统内的细菌代谢产物抑制,提高了产氢效率及产物中氢气和乙醇的比例,同时并具有操作简便的优点。(A method of step hydrogen-producing and ethanol-producing is coupled with electricity fermentation based on microorganism syntrophism interaction, belongs to fermentation and hydrogen production technical field.The problems such as present invention inhibits to solve during existing fermentative hydrogen production and biofermentation producing and ethanol zymogenous bacteria by metabolite, and hydrogen generation efficiency is low, producing and ethanol purity is low.The present invention co-cultures fermentative hydrogen-producing bacteria Harbin producing and ethanol bacillus YUAN-3 and electroactive bacterium ground bacillus PCA in microorganism electricity fermentation MEF reactor, passes through bacterial metabolism interaction and microorganism electricity fermentation system two-step method step hydrogen making and ethyl alcohol.It is compared with the traditional method, the present invention substantially increases hydrogen yield and purity of alcohol, and the opsonigenous substance reduced in microorganism electricity fermentation system inhibits, and improves the ratio of hydrogen and ethyl alcohol in hydrogen generation efficiency and product, while and having the advantages that easy to operate.)

一种基于微生物互养互作与电发酵耦合梯级产氢产乙醇的 方法

技术领域

本发明涉及一种基于微生物互养互作与电发酵耦合梯级产氢产乙醇的方法，属于发酵产氢技术领域。

背景技术

氢能被认为是最具发展潜力的、可替代化石燃料的清洁能源，具有热值高、燃烧性能好、清洁无污染、可持续等诸多优点。但传统工业制取氢气的方法成本高，消耗大量资源和能源，并产生严重环境污染。

发酵法生物制氢技术作为一种可持续的制氢技术，在消耗有机废物的同时产生清洁高效的氢气能源，与传统制氢工艺相比，具有产氢率高、生态友好、能耗低、成本低等优点，因此在实际和商业应用中极具吸引力。根据液体最终产物的不同，发酵法生物制氢可分为乙醇型发酵和丁酸型发酵等类型。其中，乙醇型发酵产氢耐酸性更强，产氢效率更高，在产氢的同时，主要代谢产物乙醇还可作为生物资源进行回收利用。现有生物发酵制氢和生物发酵产乙醇过程中由于发酵细菌受代谢产物抑制，存在产氢效率低、产乙醇纯度低等问题。

发明内容

本发明为解决现有生物发酵制氢和生物发酵产乙醇过程中发酵细菌受代谢产物抑制，产氢效率低、产乙醇纯度低等问题，提供了一种基于微生物互养互作与电发酵耦合梯级产氢产乙醇的方法。

本发明的技术方案：

一种基于微生物互养互作与电发酵耦合梯级产氢产乙醇的方法，该方法的具体操作步骤如下：

步骤一，在恒温摇床内使用液体EGC培养基厌氧培养自聚集哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3至形成白色球状颗粒，离心收集菌体，获得哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的接种物；

步骤二，在恒温摇床内使用液体EGC培养基厌氧培养地杆菌PCA至形成粉红色浑浊菌液，离心收集菌体，获得地杆菌PCA的接种物；

步骤三，组装微生物电发酵MEF反应器，首先将碳纤维阳极和活性炭热压氢还原阴极插装在反应器中，然后将液体EGC培养基注入反应器中，经纯度为99.99％的高纯N₂曝气后密封并高温高压灭菌，反应器使用一次性静脉输液针连接体气体收集袋，碳纤维阳极和活性炭热压氢还原阴极之间外接电阻后与直流电源连接；

步骤四，将步骤一和步骤二哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的接种物和地杆菌PCA的接种物接种至灭菌后的MEF反应器中，连通电路，35℃恒温培养，并使用多通道磁力搅拌器搅拌培养，培养1小时～10小时产生氢气和乙醇。

所述的微生物电发酵MEF反应器的阳极为碳纤维，阴极为活性炭热压氢还原阴极，外接电阻为10Ω～50Ω，直流电源的电压为0.5V～1.0V或恒定阴极电位0.1～0.5mV。

所述的步骤一中厌氧培养法培养哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3接种物的过程为；首先将液体EGC培养基经高温煮沸、纯度为99.99％的高纯N₂曝气和高温高压蒸汽灭菌，然后接种哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3，并放置在恒温摇床中震荡培养12小时～48小时，得到底部沉积为白色球状凝集颗粒的浑浊菌液，10000r/h离心2分钟，弃上清液，得到哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3接种物。

所述的步骤二中厌氧培养法培养地杆菌PCA接种物的过程为：首先，液体EGC培养基经N₂和CO₂混合气曝气并高温高压蒸汽灭菌，然后接种地杆菌PCA，并放置在恒温摇床中震荡培养6小时～24小时，得到粉红色浑浊菌液，10000r/h离心2分钟，弃上清液，得到地杆菌PCA接种物。

所述的步骤四中每1L所述的EGC培养基中接入0.005g～0.01g的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3和0.02g～0.04g的地杆菌PCA。

每1L所述的EGC培养基由10g的葡萄糖，1.0g的蛋白胨，2.0g的NaCl，1.8g的K₂HPO₄，0.1g的MgCl₂·6H₂O，0.3g的KCl，1.6g的NaH₂PO₄，1.5g的NaHCO₃，0.2g的CH₃COONa，0.2g～1.0g的L-半胱氨和0.3ml体积分数为0.1％的刃天青组成。

所述的液体EGC培养基的配置方法如下，先加入除L-半胱氨酸外的所有药品并煮沸10分钟，冷却至室温后加入L-半胱氨酸并溶解，继续煮沸定容至1L，然后装到250mL厌氧瓶中，每瓶150mL。

所述的步骤四中每1L所述的EGC培养基中接入0.005g～0.01g的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3和0.02g～0.04g的地杆菌PCA。每1L液体EGC培养基中接入0.005g～0.01g哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3接种物和0.02g～0.04g地杆菌PCA接种物接货中，开始产氢时间最短；按照每1L液体EGC培养基中接入0.001g～0.03g哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3接种物和0.005g～0.05g地杆菌PCA接种物进行接种，两种菌可以在上述范围内任意取值组合进行产氢产乙醇，均能获得较好的产氢产乙醇效果。

所述的磁力搅拌器得磁力搅拌子为2cm，转速为100rpm。

所述的高压蒸汽灭菌的条件为120℃，维持时间为30分钟。

本发明具有以下有益效果：本发明一种基于微生物互养互作与电发酵耦合梯级产氢产乙醇的方法，本发明利用发酵产氢细菌和电活性细菌在微生物电发酵MEF反应器中共培养，通过细菌代谢互作及微生物电发酵系统两步法梯级制取氢气和乙醇，与传统方法相比，由于微生物电发酵共培养体系中的地杆菌PCA能够利用哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3代谢产生的乙酸和CO₂生长，将化学能转化为电能，并在微生物电发酵MEF反应器阳极产氢；同时，代谢产物的消耗降低了发酵产氢菌的代谢抑制，促进其高效产氢，并使产物中H₂和乙醇比例大幅提升，因此制取的氢气产率更大，氢气和乙醇纯度更高，并具有操作简便，兼具产电的优势。以10g/L～20g/L葡萄糖为碳源，在微生物电发酵MEF反应器运行1～10小时后后即开始产生氢气，60h左右达到最大产氢速率为80mL/L-培养基·h，最终可获得的氢气产率为2.1mol-氢气/mol-葡萄糖，乙醇终浓度为2000mg/L，占液体发酵产物的72％。

附图说明

图1为本发明的微生物电发酵MEF反应器；

图中1-直流电源，2-电阻，3-气体收集袋，4-碳纤维阳极，5-活性炭热压氢还原阴极。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

下述具体实施例中涉及的哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)是2005年邢德峰等分离获得的乙醇型发酵的主要产氢功能细菌，其中菌株YUAN-3是从生物制氢反应器中分离得到的一株严格厌氧的高效产氢菌株，它是已报道的唯一一株具有自凝聚能力的产氢细菌，保藏编号为CGMCC No.1152。

地杆菌(Geobacter sulfurreducens)PCA是常见于微生物电化学系统，是一种能够利用乙酸生长并进行胞外电子传递的电活性细菌。Bond DR和Lovley DR等人在文章Electricity production by Geobacter sulfurreducens attached to electrodes中有关于这株菌种的记载。

具体实施方式1：本实施方式中提供了一种基于哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens)YUAN-3和地杆菌(Geobacter sulfurreducens)PCA代谢互作与电发酵耦合梯级产氢产乙醇的方法，该方法的具体操作步骤如下：

(一)采用厌氧培养法培养哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3：将接种哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的液体EGC培养基放置在35℃恒温摇床里震荡培养，48小时后在厌氧瓶底部形成白色球状凝集颗粒，10000r/h离心2分钟，弃上清液，得到哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3接种物；

(二)采用厌氧培养法培养地杆菌PCA：将接种地杆菌PCA的液体EGC培养基放置在35℃恒温摇床里震荡培养，18小时后得到粉红色浑浊菌液，10000r/h离心2分钟，弃上清液，得到地杆菌PCA接种物；

(三)组装微生物电发酵MEF反应器：首先将碳纤维阳极4和活性炭热压氢还原阴极5插装在厌氧瓶中，然后将液体EGC培养基注入反应器中，多通道曝气针将高纯N₂(99.99％)曝入反应器中，持续半小时后将气针取出，反应器口封死。厌氧瓶口使用一次性静脉输液针连接体气体收集袋3，碳纤维阳极4和活性炭热压氢还原阴极5之间外接电阻2后与直流电源1连接；

其中，电阻2的电阻值为20Ω；直流电源1的电压为0.8V或恒定阴极电位0.4mV。

(四)使用微生物电发酵MEF反应器共培养哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3与地杆菌PCA：将上述步骤的到的0.01g哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3接种物和0.02g地杆菌PCA接种物接种在液体EGC培养基中，35℃恒温培养，用多通道磁力搅拌器100rpm搅拌，连通电路，运行2小时后开始产氢，60小时左右达到最大产氢速率为80mL/L-培养基·h，最终可获得的氢气产率为2.1mol-氢气/mol-葡萄糖，乙醇终浓度为2000mg/L，占液体发酵产物的72％；

每1L液体EGC培养基由10g的葡萄糖，1.0g的蛋白胨，2.0g的NaCl，1.8g的K₂HPO₄，0.1g的MgCl₂·6H2O，0.3g的KCl，1.6g的NaH₂PO₄，1.5g的NaHCO₃，0.2g的CH₃COONa，0.6g的L-半胱氨酸，0.3ml刃天青(0.1％)组成；

液体EGC培养基的配置方法为：先加入除L-半胱氨酸外的所有药品并煮沸10分钟，冷却至室温后加入L-半胱氨酸并溶解，继续煮沸定容至1L，然后装到250mL厌氧瓶或MEF反应器中，每瓶150mL，并用多通道曝气针将高纯氮气(99.99％)曝入培养液中，直到培养液由粉红色变为啤酒色，稳定五分钟后将气针取出，瓶口用胶塞封死，最后经过120℃高压蒸汽灭菌，持续时间为30分钟。

每1L的液体EGC培养基均提供微量元素溶液和维生素溶液各6ml。其中，微量元素溶液含有3.0g/L的MgSO₄·7H₂O，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.1g/L的ZnSO₄·7H₂O，0.01g/L的H₃BO₃，1.5g/L的N(CH₂COOH)₃，0.1g/L的CaCl₂·2H₂O，0.01g/L的Na₂MoO₄·2H₂O，0.1g/L的CoCl₂·6H₂O，0.024g/L的NiCl₂·6H₂O，0.025g/L的Na₂WO₄·2H₂O，0.5g/L的MnSO₄·H₂O，0.01g/L的CuSO₄·5H₂O，0.01g/L的KAl(SO₄)₂·12H₂O，1.0g/L的NaCl。维生素溶液的组成为0.2g/L的维生素H，0.5g/L的维生素B₁，0.5g/L的维生素B₂，0.5g/L的维生素B₅，1g/L的维生素B₆，0.001g/L的维生素B₁₂，0.025g/L的核黄素，0.02g/L的柠檬酸，0.01g/L的叶酸，0.5g/L的硫辛酸，0.5g/L的对氨基苯甲酸。

并且本实施例中摇床培养的方式还可以采用恒温室内的多通道磁力搅拌器搅拌培养的方式替代，培养条件为35℃、170r/min(2cm磁力搅拌子)。

具体实施方式2：本实施方式中提供了哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3产氢产乙醇的方法，该方法的操作步骤与具体实施方式1的主要区别为在步骤(四)中仅接种哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的接种物，其余培养条件及步骤均相同，培养1小时后开始产气，30小时达到最大产氢速率26.62mL/L-培养基·h，最终可获得的氢气产率为1.02mol-氢气/mol-葡萄糖。

具体实施方式1与具体实施方式2的产氢产乙醇效果对比如下表，

由上表可知，哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3和地杆菌PCA的两菌共培养显著缩短产气时长，最大产氢速率明显增加，对底物利用率没有不利影响；同时电发酵系统进一步缩短反应时间，提高产氢效率，在微生物电发酵MEF反应器中共培养可以获得更高的氢气产率和乙醇纯度。