诱导蝴蝶兰2n花粉的时机及诱导方法
阅读说明：本技术 诱导蝴蝶兰2n花粉的时机及诱导方法 (Time for inducing phalaenopsis 2n pollen and induction method ) 是由 贾瑞冬 吴婷 葛红 杨树华 赵鑫 寇亚平 李秋香 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：本申请公开了一种确定利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的时机的方法,包括：(a)天然2n花粉得率统计；(b)2n花粉诱导,包括：选择各个减数分裂时期的花粉,利用0.01％-0.1％的秋水仙素溶液处理花蕾进行2n花粉诱导；(c)诱导后2n花粉率统计；和(d)将诱导后2n花粉率与天然2n花粉率进行比较,从而确定诱导2n花粉的时机。还提供了一种利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的方法。本发明确定了利用秋水仙素诱导2n花粉的时机,以及相应的秋水仙素浓度,为多倍体诱导获得2n花粉、培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新品种奠定基础。(The application discloses a method for determining the time for inducing phalaenopsis to generate 2n pollen by using colchicine, which comprises the following steps: (a) counting the yield of natural 2n pollen; (b)2n pollen induction comprising: selecting pollen in each meiosis period, and treating flower buds with 0.01-0.1% colchicine solution for 2n pollen induction; (c) counting the 2n pollen rate after induction; and (d) comparing the post-induction 2n pollen rate with the native 2n pollen rate, thereby determining the timing of induction of 2n pollen. Also provides a method for inducing phalaenopsis to generate 2n pollen by using colchicine. The invention determines the time for inducing 2n pollen by colchicine and the corresponding colchicine concentration, and lays a foundation for obtaining 2n pollen by polyploid induction and cultivating a new butterfly orchid variety with large and bright flowers and high ornamental value.)
技术领域
本发明属于多倍体育种技术领域，尤其涉及秋水仙素诱导蝴蝶兰产生 2n花粉的时机及诱导方法。
背景技术
蝴蝶兰是世界盆栽和切花市场上最重要的经济作物之一，其花形似蝴蝶，花色鲜艳而丰富，有“兰花皇后”的美誉。多倍体植株通常具有更大的器官和在逆境条件下更强的适应能力，多倍体兰花通常具有植株粗壮、花色艳丽、抗逆性强等优点。事实上，目前市场上流行的蝴蝶兰品种多是多倍体，蝴蝶兰属原生种的染色体数目为2n＝2x＝38，而栽培种的染色体大多不固定，主要为四倍体、三倍体和非整倍体。庄东红等(庄东红等，2007) 对38个蝴蝶兰品种或品系进行染色体计数及形态分析，认为四倍体占 82％。此外，大多数品种都是通过种间杂交或属间杂交产生的，由于倍性的差异，很难将原生种二倍体的优良基因转入商品杂交种，且蝴蝶兰的染色体大小差异也很大，不同染色体大小物种间杂交产生的后代大多不育，诱导蝴蝶兰加倍能克服杂种不育性。
自然界中多倍体植株的产生主要归因与2n配子的产生(Eng and Ho, 2019；Baduel et al.,2018；Van de Peer et al.,2017；Can et al.,2012)，与体细胞多倍体化相比，有性多倍体化具有遗传多样性和杂种优势(Lai et al., 2015；Younis et al.,2014；Brownfield and Kohler,2011；Ramanna and Jacobsen,2003)。前人报道的有未减数配子的植物科有34个以上(Dewitte et al.,2012；Sora et al.,2016)，其中柑橘(Ahmedet al.,2020；Sora et al.,2016) 等植物已经成功利用天然2n配子获得了多倍体后代。
2n花粉诱导是植物多倍体育种的重要途径。植物多倍体形成主要是通过体细胞加倍和2n配子产生。由于蝴蝶兰组织培养技术比较成熟，目前大多数研究是利用秋水仙素、安磺灵等化学试剂在组织培养条件下诱导外植体获得无性多倍化植株，但诱导后可能会产生大量嵌合体、非整倍体植株，而2n配子产生能很好的克服以上缺点。
前人在探究不同倍性蝴蝶兰产生后代的倍性时发现，二倍体与二倍体杂交能产生三倍体和四倍体，二倍体和三倍体杂交能产生五倍体，四倍体和四倍体杂交能产生五倍体和六倍体，这些现象均说明杂交亲本产生了 2n配子。朱娇等(朱娇等，2014)统计了部分二倍体、三倍体和四倍体蝴蝶兰天然2n花粉率，发现三倍体蝴蝶兰天然2n花粉率为2.39％，二倍体、四倍体较三倍体低分别为0.59％、0.67％。2n花粉相比于n花粉的竞争力较弱，自然条件下产生多倍体后代的几率较低，因此通过人工诱导增加2n花粉的比率是非常必要的(周晴等,2020；Younis et al.,2014)。
然而，现有技术中鲜有对蝴蝶兰采用2n花粉诱导来获得加倍植株，而且不能获得理想的2n花粉诱导率。此外，蝴蝶兰品种繁多，倍性及遗传背景复杂，为2n花粉诱导的研究增加了难度。
因此，为了培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新种质，亟需提供一种改进的2n花粉诱导方法来提高蝴蝶兰2n花粉诱导率。同时，还需要对更多的蝴蝶兰品种进行研究，为蝴蝶兰有性多倍化育种提供理论基础。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种确定利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的时机的方法、利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的方法。
在本发明的第一方面中，提供了一种确定利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的时机的方法，包括以下步骤：
(a)天然2n花粉率统计，包括：统计蝴蝶兰成熟花粉中二分体、三分体、四分体个数，计算2n花粉率；
(b)2n花粉诱导，包括：选择各个减数分裂时期的花粉，利用秋水仙素进行诱导，其中所述减数分裂时期包括小孢子母细胞时期、细线期-偶线期、粗线期-终变期、减I中期-减I末期和减Ⅱ前期-减Ⅱ末期，并且所述诱导包括利用浓度为0.01％-0.1％的秋水仙素溶液处理花蕾；
(c)诱导后2n花粉率统计，包括：当花蕾达到成熟花粉状态时，采集花蕾，统计二分体、三分体、四分体个数，计算2n花粉率；和
(d)确定诱导2n花粉的时机：将诱导后2n花粉率与天然2n花粉率进行比较，从而确定诱导2n花粉的时机。
在一些实施方案中，其中步骤(b)包括：测量并记录待处理的花蕾直径，随后将浸泡过秋水仙素溶液的脱脂棉包裹在花蕾上进行处理(例如3天)，其中所述秋水仙素溶液的浓度为0.01％-0.1％，例如0.01-0.05％。在一些实施方案中，其中步骤(b)还包括：根据测量的花蕾直径判断所述减数分裂时期。
在一些实施方案中，所述步骤(d)包括确定诱导2n花粉的时机为细线期-偶线期、粗线期-终变期或减I中期-减I末期。在一些实施方案中，所述步骤(d)包括对获得的数据进行统计和分析，包括：进行方差分析和采用 LSD多重比较方法，其中数据变动范围值均为所有处理数据值的标准差。具体而言，采用Excel2016进行数据分析，SPSS2.0进行方差分析，采用LSD多重比较方法，表中数据变动范围值(±)为均值±标准差，百分数进行多重比较时均将百分数进行反正弦转换后再进行分析。
本发明的第二方面提供了一种利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的方法，包括以下步骤：基于花蕾直径与花粉减数分裂时期的对应关系，根据花蕾直径选择减数分裂时期中的一个时期，用秋水仙素溶液处理所述花蕾从而诱导2n花粉产生，其中所述减数分裂时期包括：细线期-偶线期、粗线期-终变期或减I中期-减I末期。在一些实施方案中，所述秋水仙素溶液的浓度为0.01％-0.1％。
在一些实施方案中，其中用秋水仙素溶液处理所述花蕾包括：将脱脂棉浸没在秋水仙素溶液中，然后将浸泡过秋水仙素溶液的脱脂棉包裹在花蕾上进行处理(例如3天)，其中所述秋水仙素溶液的浓度为0.01％-0.1％，例如0.01-0.05％。
在一些实施方案中，通过如下步骤建立花蕾直径与减数分裂时期的对应关系：
(i)花蕾直径测量：测量并记录花蕾直径；
(ii)小孢子母细胞发育时期观察：采集步骤(i)的花蕾，对其中的花粉进行染色体压片分析，以确定小孢子母细胞发育时期；以及
(iii)对步骤(i)和(ii)获得的数据进行统计和分析，从而建立减数分裂时期与花蕾直径的对应关系。
在一些实施方案中，在细线期-偶线期、粗线期-终变期或减I中期-减 I末期进行2n花粉诱导。
本发明的第三方面提供了一种利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的方法包括以下步骤：
(a)天然2n花粉率统计，包括：观察和/或统计蝴蝶兰成熟花粉中二分体、三分体、四分体个数，计算2n花粉率；
(b)用秋水仙素诱导2n花粉，包括：将脱脂棉浸没在秋水仙素溶液中，然后将浸泡过秋水仙素溶液的脱脂棉包裹在花蕾上进行处理(例如3天)，其中所述秋水仙素溶液的浓度为0.01％-0.1％；和
(c)诱导后2n花粉率统计，包括：当花蕾达到成熟花粉状态时，采集花蕾，统计二分体、三分体、四分体个数，计算2n花粉率。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤(d)对获得的数据进行统计和分析，包括：进行方差分析和采用LSD多重比较方法，其中数据变动范围值均为所有处理数据值的标准差。具体而言，采用Excel2016进行数据分析，SPSS2.0进行方差分析，采用LSD多重比较方法，表中数据变动范围值(±)为均值±标准差，百分数进行多重比较时均将百分数进行反正弦转换后再进行分析。
本发明的第四方面提供了一种利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的方法，包括以下步骤：
(1)基于花蕾直径与花粉减数分裂时期的对应关系，根据花蕾直径选择减数分裂时期中的一个时期，用于进行2n花粉诱导，其中所述减数分裂时期包括小孢子母细胞时期、细线期-偶线期、粗线期-终变期、减I中期-减I末期、减Ⅱ前期-减Ⅱ末期；以及
(2)在选定的减数分裂时期，用秋水仙素溶液处理所述花蕾从而诱导2n 花粉产生，其中，所述秋水仙素溶液的浓度为0.01％-0.1％。
在一些实施方案中，其中步骤(1)包括：
(1a)花蕾直径测量：测量并记录花蕾直径；
(1b)小孢子母细胞发育时期观察：采集步骤(a)的花蕾，对其中的花粉进行染色体压片分析，以确定小孢子母细胞发育时期；以及
(1c)对步骤(1a)和(1b)获得的数据进行统计和分析，从而建立小孢子母细胞发育时期与花蕾直径的对应关系。
在一些实施方案中，步骤(2)中用秋水仙素溶液处理所述花蕾包括：将脱脂棉浸没在秋水仙素溶液中，然后将浸泡过秋水仙素溶液的脱脂棉包裹在花蕾上处理例如3天，其中所述秋水仙素溶液的浓度为0.01％-0.1％，例如0.01-0.05％。
在一些实施方案中，当花粉处于细线期-偶线期、粗线期-终变期或减I 中期-减I末期时，用秋水仙素溶液处理所述花蕾。
在本发明各个方面的一些实施方案中，所述秋水仙素溶液的浓度为 0.01-0.05％、0.02-0.05％、0.03-0.05％、0.04-0.05％、0.02-0.1％、0.05-0.1％、 0.03-0.07％、0.04-0.06％或0.01％、0.05％、0.1％，例如0.05％。
在本发明各个方面的一些实施方案中，在步骤(a)和(c)中，所述2n花粉率利用下式计算：2n花粉率＝(2Dy+Tr)/(2Dy+3Tr+4Te)，其中， Dy为二分体个数，Tr为三分体个数，Te为四分体个数。
在本发明各个方面的一些实施方案中，在步骤(a)和(c)中，所述2n花粉率统计包括：
将花蕾放入卡诺氏固定液中固定12-24h后转入70％乙醇中，于4℃保存；
用蒸馏水洗涤从保存的花蕾中取出的花药，用改良苯酚品红溶液染色 10-15min，轻轻压片后迅速经过火焰6-7次，然后用OLYMPUS DP73显微镜观察拍照，
由此记录二分体、三分体、四分体个数，
其中所述卡诺氏固定液由体积比为3:1的无水乙醇和冰乙酸组成。
在本发明各个方面的一些实施方案中，其中步骤(b)包括：测量并记录待处理花梗上花蕾直径，随后将浸泡过秋水仙素溶液的脱脂棉包裹在花蕾上处理例如3天(例如，每个浓度处理6-7个花梗，每个花梗不低于4个花蕾)。
在本发明各个方面的一些实施方案中，对花蕾拍照(例如上午10:00拍照)，采用Image J图像处理软件测量所述花蕾直径。
在本发明各个方面的一些实施方案中，步骤(b)包括：当花粉处于选自以下的减数分裂时期时进行2n花粉诱导(例如用秋水仙素溶液处理花蕾3 天)：小孢子母细胞时期、细线期-偶线期、粗线期-终变期、减I中期-减I 末期或减Ⅱ前期-减Ⅱ末期。在一些实施方案中，根据测量的花蕾直径判断所述减数分裂时期。在一些实施方案中，所述步骤(b)包括当花粉处于细线期-偶线期、粗线期-终变期或减I中期-减I末期时，用秋水仙素溶液处理花蕾3天(即，进行2n花粉诱导)。
在本发明各个方面的一些实施方案中，天然2n花粉率为约 0.68～1.78％。在本发明各个方面的一些实施方案中，诱导后2n花粉率为至少6.5％，例如至少10％，例如10.04％。
在本发明各个方面的一些实施方案中，所述蝴蝶兰是蝴蝶兰品种，例如小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris)、小兰屿蝴蝶兰蓝白色变种 (Phalaenopsis equestrisvar.coerulea)、‘安娜’蝴蝶兰(Phalaenopsis Anna-Larati soekardi)、‘小茴紫’蝴蝶兰(Phalaenopsis Tzu Chiang Sapphire)、‘满天红’蝴蝶兰(Phalaenopsis Queen Beer‘RedSky’)和/或‘紫水晶’蝴蝶兰(Phalaenopsis Purple Crystal)。
在本发明各个方面的一些实施方案中，所述蝴蝶兰品种是小兰屿蝴蝶兰，所述小孢子母细胞时期、细线期-偶线期、粗线期-终变期、减I中期- 减I末期、减Ⅱ前期-减Ⅱ末期与花蕾直径的对应关系为0-3.30、3.30-4.72、 4.72-5.40、5.40-5.62、5.62-6.20mm，例如0-小于3.30、大于3.30-小于4.72、大于4.72-小于5.40、大于5.40-小于5.62、大于5.62-小于6.20mm，由此可以根据测量的花蕾直径判断所述减数分裂时期。
在本发明各个方面的一些实施方案中，所述蝴蝶兰品种是小兰屿蝴蝶兰蓝白色变种，所述对应关系为0-3.07、3.07-4.37、4.37-5.64、5.64-5.83、 5.83-6.46mm。例如0-小于3.07、大于3.07-小于4.37、大于4.37-小于5.64、大于5.64-小于5.83、大于5.83-小于6.46mm。
在本发明各个方面的一些实施方案中，所述蝴蝶兰品种是‘安娜’蝴蝶兰，所述对应关系为0-4.06、4.06-5.16、5.16-5.54、5.54-5.90、5.90- 6.57mm。例如为0-小于4.06、大于4.06-小于5.16、大于5.16-小于5.54、大于5.54-小于5.90、大于5.90-小于6.57mm。
在本发明各个方面的一些实施方案中，所述蝴蝶兰品种是‘小茴紫’蝴蝶兰，所述对应关系为0-4.21、4.21-6.53、6.53-7.36、7.36-7.60、7.60- 7.89mm。例如0-小于4.21、大于4.21-小于6.53、大于6.53-小于7.36、大于7.36-小于7.60、大于7.60-小于7.89mm。
在本发明各个方面的一些实施方案中，所述蝴蝶兰品种是‘满天红’蝴蝶兰，所述对应关系为0-4.37、4.37-7.96、7.96-10.76、10.76-11.18、 11.18-12.74mm。例如0-小于4.37、大于4.37-小于7.96、大于7.96-小于 10.76、大于10.76-小于11.18、大于11.18-小于12.74mm。
在本发明各个方面的一些实施方案中，所述蝴蝶兰品种是‘紫水晶’蝴蝶兰，所述对应关系为0-8.24、8.24-10.20、10.20-12.00、12.00-12.84、 12.84-13.55mm。例如0-小于8.24、大于8.24-小于10.20、大于10.20-小于12.00、大于12.00-小于12.84、大于12.84-小于13.55mm。在本发明各个方面的一些实施方案中，所述花蕾直径是花蕾横径。
在本发明各个方面的一些具体实施方案中，当提及“根据测量的花蕾直径判断所述减数分裂时期”或类似表述时，指的是基于本发明所述的花蕾直径与减数分裂时期的对应关系，通过花蕾的直径来判断减数分裂时期。在一些实施方案中，本发明所述的“减数分裂时期”指的是花粉减数分裂时期，属于小孢子母细胞发育时期。
在本发明各个方面的一些具体实施方案中，步骤(a)或(c)包括：
(a/c1)每个蝴蝶兰品种随机取3-5个花粉块置于载玻片，用镊子碾碎，随机统计三个视野，重复3次；
(a/c2)将花蕾放入卡诺氏固定液(无水乙醇：冰乙酸＝3:1)固定12-24h，然后转入70％乙醇中，于4℃冰箱内保存备用；蒸馏水洗涤2-3次后，将花药放置在载玻片上，用镊子捣碎，除去残渣，加入1滴改良苯酚品红溶液染色10-15min，轻轻压片后迅速经过火焰6-7次，用带有橡皮的铅笔轻敲，使染色体分布均匀，OLYMPUS DP73显微镜观察拍照；以及
(a/c3)利用下式计算2n花粉率：2n花粉率＝(2Dy+Tr)/(2Dy+3Tr +4Te)，其中，Dy为二分体个数，Tr为三分体个数，Te为四分体个数。
在本发明各个方面的一些具体实施方案中，步骤(b)包括：
(b1)将脱脂棉分成大小相等、边长约为2cm的小块，并将其浸没在已配好的秋水仙素溶液中备用，秋水仙素溶液浓度为0.01％、0.05％或 0.1％；
(b2)于上午10:00拍照并测量待处理花梗上花蕾直径，其中采用 Image J图像处理软件测量花蕾直径；
(b3)将浸泡过秋水仙素溶液的脱脂棉包裹在花蕾上，处理3天，其中每个浓度处理6-7个花梗，每个花梗不低于4个花蕾。
本发明利用秋水仙素对小兰屿蝴蝶兰、小兰屿蝴蝶兰蓝白色变种、‘安娜’蝴蝶兰、‘小茴紫’蝴蝶兰、‘满天红’蝴蝶兰、‘紫水晶’蝴蝶兰等6个蝴蝶兰品种(种、变种)进行2n花粉诱导，发现秋水仙素浓度和处理时期对蝴蝶兰品种，尤其是小兰屿蝴蝶兰2n花粉诱导都有较大的影响。对上述6个蝴蝶兰品种的天然2n花粉得率进行统计，其2n花粉率为约 0.68～1.78％。用浓度为0.01％和0.05％的秋水仙素诱导减Ⅰ时期花蕾时，均能获得不低于6.5％的2n花粉率；用0.05％秋水仙素在细线期-偶线期处理3天，诱导率最高，可达10.04％。
利用秋水仙素诱导蝴蝶兰2n花粉时，现有技术缺乏对秋水仙素的适宜浓度和处理时期的相关探讨。这主要是因为秋水仙素的处理时期和浓度不好把握，处理时期太早或者处理浓度过高会使花蕾凋落，处理时间不适宜或处理浓度较低则2n花粉诱导率较低。本研究通过用不同浓度秋水仙素处理不同减数分裂时期的蝴蝶兰品种(例如小兰屿蝴蝶兰)花蕾，发现了能产生更多2n花粉的秋水仙素诱导的适宜浓度和适宜处理的减数分裂时期，2n花粉诱导率达10％以上。因此，本发明的方法为获得更多蝴蝶兰2n花粉及培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新种质提供了支持，在蝴蝶兰多倍体新品种的培育中具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明的实施方案的、利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n 花粉的方法流程图。
图2是照片，显示根据本发明的实施方案的、小兰屿蝴蝶兰花朵形态 (2A)、小兰屿蝴蝶兰蓝白色变种花朵形态(2B)、‘安娜’蝴蝶兰花朵形态(2C)、‘小茴紫’蝴蝶兰花朵形态(2D)、‘满天红’蝴蝶兰天然花朵形态(2E)、‘紫水晶’蝴蝶兰花朵形态(2F)。
图3是显微镜照片，显示根据本发明的实施方案的、小兰屿蝴蝶兰天然未减数雄配子发生(3A)、小兰屿蝴蝶兰蓝白色变种天然未减数雄配子发生(3B)、‘安娜’蝴蝶兰天然未减数雄配子发生(3C)、‘小茴紫’蝴蝶兰天然未减数雄配子发生(3D)、‘满天红’蝴蝶兰天然未减数雄配子发生(3E)、‘紫水晶’蝴蝶兰天然未减数雄配子发生(3F)。
图4是显微镜照片，显示根据本发明的实施方案的、秋水仙素处理后小兰屿蝴蝶兰未减数雄配子发生(4A)以及秋水仙素处理前小兰屿蝴蝶兰未减数雄配子发生(4B)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的方法。
参考图1，在根据本发明的一些实施方案的方法中，本发明的利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的方法包括以下步骤：
S101，统计蝴蝶兰天然2n花粉率：每个蝴蝶兰品种随机将3-5个花粉块置于载玻片，用镊子碾碎，随机统计三个视野，重复3次；
S102，将脱脂棉分成大小相等、边长约2cm的小块，并将其浸没在已配好的秋水仙素溶液中备用，浓度分别为0.01％、0.05％、0.1％；
S103，秋水仙素处理：于上午10:00左右拍照记录待处理花梗上花蕾直径，随后将带有不同浓度秋水仙素溶液的脱脂棉包裹在花蕾上处理3 天，每个浓度处理6-7个花梗，每个花梗不低于4个花蕾；
S104，秋水仙素诱导后2n花粉率统计：当花粉成熟时，采集花蕾，统计二分体、三分体、四分体个数，计算2n花粉率。
S105，数据统计：采用Excel2016做数据记录和数据分析，SPSS2.0进行方差分析，采用LSD多重比较方法，数据变动范围值均为所有处理数据值的标准差。
本发明用不同浓度秋水仙素对不同减数分裂阶段蝴蝶兰花蕾进行诱导处理，显著提高了蝴蝶兰2n花粉率。本发明探讨了秋水仙素处理花蕾的适宜浓度及处理时期，为多倍体诱导培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新品种奠定基础。下面结合实施例对本发明的进一步的描述。
实施例
1.试验材料
以小兰屿蝴蝶兰、小兰屿蝴蝶兰蓝白色变种、‘安娜’蝴蝶兰、‘小茴紫’蝴蝶兰、‘满天红’蝴蝶兰、‘紫水晶’蝴蝶兰为材料，统计蝴蝶兰天然2n 花粉率，以小兰屿蝴蝶兰为材料进行秋水仙素诱导2n花粉。试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行，所有材料种植于温室。花朵形态如图2 所示。
2.数据统计
采用Excel2016进行数据分析，SPSS2.0进行方差分析，采用LSD多重比较方法，表中数据变动范围值(±)均为均值±标准差，百分数进行多重比较时均将百分数进行反正弦转换后再进行分析。
实施例1：天然2n花粉得率统计
蝴蝶兰花粉成熟后以四分体的形式存在，观察并记录蝴蝶兰成熟花粉中二分体、三分体、四分体个数，计算天然2n花粉率，每个蝴蝶兰品种随机将3-5个花粉块置于载玻片，用镊子碾碎，随机统计三个视野，重复 3次。2n花粉比例＝(2Dy+Tr)/(2Dy+3Tr+4Te)，其中，Dy为二分体个数，Tr为三分体个数，Te为四分体个数。
结果发现，除满天红(图3E)由于联会紊乱无法产生正常花粉外，其他五种蝴蝶兰中均有观测到二分体、三分体的存在(图3A-D、图3F)。对五种蝴蝶兰天然2n花粉率进行统计，结果如表1所示，发现天然2n 花粉率差异显著，其2n花粉率从0.68％到1.78％不等。小兰屿蝴蝶兰、小兰屿蝴蝶兰变种、‘小茴紫’蝴蝶兰和‘紫水晶’蝴蝶兰4个二倍体品种天然2n花粉产生率均未超过1％，而二倍体蝴蝶兰‘安娜’天然2n花粉率为 1.78％。
表1：蝴蝶兰未减数雄配子的发生频率
注：表中“－”表示数据缺失，同列不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
实施例2：利用秋水仙素诱导2n花粉
将脱脂棉分成大小相等、边长约2cm的小块，并将其浸没在已配好的秋水仙素溶液中备用，浓度分别为0.01％、0.05％、0.1％。于上午10:00 左右拍照记录待处理花梗上花蕾直径，随后将带有不同浓度秋水仙素溶液的脱脂棉包裹在花蕾上处理3天，每个浓度处理6-7个花梗，每个花梗不低于4个花蕾，主要考察减数分裂时期、秋水仙素浓度对蝴蝶兰2n花粉诱导率的影响。当花蕾达到成熟花粉状态时，采集花蕾，采用与实施例1 相同的方式统计二分体、三分体及四分体个数，计算2n花粉率。
对小兰屿蝴蝶兰不同减数时期(根据花蕾直径判断)的花蕾进行秋水仙素处理，待花蕾长到分体时期时采集花粉，2n花粉统计结果如表2所示。施加秋水仙素处理后(图4A)的二分体、三分体比例较未处理(图 4B)的比例明显增大。2n花粉诱导率的显著性分析表明，两因素即减数分裂时期、秋水仙素处理浓度和他们之间的交互效应均对蝴蝶兰2n花粉诱导率具有极显著影响(表3)。从表2可以看出，并非所有处理组合都能收获花粉，有的处理可能因为浓度过高或者花蕾太嫩等因素导致处理后的花蕾提早脱落、干枯死亡，没有收集到花粉。小孢子母细胞时期处理得到的2n花粉率较低，减Ⅰ前期进行处理可以得到较高的诱导率，其中0.05％秋水仙素在细线期～偶线期处理3天得到2n花粉率最高，可达10.04％；当处理浓度不同时，2n花粉诱导率也随之发生变化，其中0.05％的秋水仙素诱导效果较好，诱导率可达10.04％，当浓度为0.1％时，2n花粉诱导率有所下降，且对小花蕾有较强的毒性。
表2 不同处理条件下诱导蝴蝶兰花粉染色体加倍的2n花粉率
注：表中“－”表示数据缺失，同列不同小写字母代表差异显著(P<0.05)；以及小孢子母细胞时期、细线期-偶线期、粗线期-终变期、减I中期-减I末期、减Ⅱ前期- 减Ⅱ末期对应的花蕾直径分别为0-3.30、3.30-4.72、4.72-5.40、5.40-5.62、5.62-6.20mm。
表3 不同处理组合小兰屿蝴蝶兰2n花粉诱导率的方差分析
可见，在本发明中，采用秋水仙素脱脂棉包裹花蕾诱导获得2n花粉时，秋水仙素浓度及小孢子母细胞减数分裂时期等因素对能否成功诱导 2n花粉以及获得理想的2n花粉率至关重要。
在春剑(范彬,2012)和石斛(王爱华等,2017)2n花粉诱导研究中，主要是通过对小孢子母细胞减数分裂时期进行观察，并对减Ⅰ前期的花蕾进行秋水仙素注射处理，分别得到了最高为2.65％和6.22％的2n花粉率。报道显示桉树花粉染色体加倍的最佳诱导时期为双线期-终变期，减Ⅰ中期- 减Ⅰ末期(Yang et al.,2016)；银白杨花粉染色体加倍最佳诱导时期为细线末期-粗线期(李赟等,2014)；银灰杨2n花粉诱导的最佳时期在粗线期(周晴等,2020)。在本实施例中，小兰屿蝴蝶兰小孢子母细胞减数分裂发生的细线期-偶线期是最有效的时期。
除减数分裂时期外，秋水仙素的浓度对于诱导也是十分重要的。报道显示1000mg/l(0.1％)的秋水仙素诱导Phalaenopsis amabilis幼嫩花蕾效果最好(Azmi et al.,2016a)。而发明人却发现，在本实施例中，用0.05％秋水仙素包裹处于细线期-偶线期的花蕾的诱导效果最好，2n花粉诱导率最高为10.04％。
另外，石斛兰(王爱华等,2017)、春剑(范彬,2012)、杨树(周晴等,2020) 等花粉染色体加倍诱导研究主要采用的是注射法。本发明也尝试过采用注射法诱导蝴蝶兰，但花蕾基本都未能正常生长，均在2-3天后枯萎、凋落。原因可能是蝴蝶兰花蕾较嫩且未张开，注射时伤害了细胞组织致使其死亡。
实施例3：建立蝴蝶兰花蕾直径和花粉减数分裂时期之间的对应关系
2020年5月底-8月底，每个品种随机选择三个较小的花蕾观察花蕾生长变化，于上午10：00左右，拍照记录花蕾直径，每天记录一次，持续记录至花蕾开花为止。
同时于晴天10:00-14:00采摘不同大小的6种蝴蝶兰花蕾(每种采摘不同大小花蕾10-20朵，重复3次)，拍照记录花蕾直径，放入卡诺氏固定液(无水乙醇：冰乙酸＝3:1)固定12-24h，然后转入70％乙醇中，于4℃冰箱内保存备用。蒸馏水洗涤2-3次后，将花药放置在载玻片上，用镊子捣碎，除去残渣，加入1滴改良苯酚品红溶液染色10-15min，轻轻压片后迅速经过火焰6-7次，用带有橡皮的铅笔轻敲，使染色体分布均匀， OLYMPUS DP73显微镜观察拍照。
通过对处于不同小孢子发育时期的蝴蝶兰花蕾进行细胞学观察，发现减数分裂进程与花蕾直径变化有显著相关性(表4)。
表4 蝴蝶兰小孢子母细胞发育时期与花蕾外部形态变化的对应关系
注：1：小兰屿蝴蝶兰、2：小兰屿蝴蝶兰蓝白色变种、3：‘安娜’蝴蝶兰、4：‘小茴紫’蝴蝶兰、5：‘满天红’蝴蝶兰、6：‘紫水晶’蝴蝶兰
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
参考文献
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