甲基磺酸乙酯离体诱变大蒜抗叶枯病突变体的方法
阅读说明：本技术 甲基磺酸乙酯离体诱变大蒜抗叶枯病突变体的方法 (Method for in vitro mutagenesis of garlic leaf blight-resistant mutant by ethyl methanesulfonate ) 是由 陈书霞 吴美骞 洪缘缘 孙银辉 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种甲基磺酸乙酯离体诱变大蒜抗叶枯病突变体的方法,目的是为无性繁殖的大蒜品种改良和新种质资源创制提供离体诱变定向筛选突变方法,并获得符合育种目标性状的抗病突变体。本发明以大蒜茎盘为外植体,通过对切成“十”字形的大蒜茎盘进行浓度为1%的EMS处理时长为6 h,再通过1 M硫代硫酸钠溶液终止诱变反应后,擦干,接种在附加有30%大蒜叶枯病粗毒素的MS培养基上进行离体培养,可获得抗叶枯病突变体。(The invention provides a method for in vitro mutagenesis of garlic leaf blight-resistant mutants by ethyl methanesulfonate, and aims to provide an in vitro mutagenesis directional screening mutation method for improvement of asexual propagation garlic varieties and creation of new germplasm resources and obtain disease-resistant mutants meeting breeding target characters. The invention takes a garlic stem disc as an explant, EMS treatment with the concentration of 1% is carried out on the garlic stem disc cut into a cross shape for 6 hours, then the garlic stem disc is wiped off after the mutagenesis reaction is stopped by 1M sodium thiosulfate solution, and the garlic stem disc is inoculated on an MS culture medium added with 30% garlic leaf blight crude toxin for isolated culture, so as to obtain the leaf blight resistant mutant.)
技术领域
本发明涉及大蒜抗病育种技术领域，尤其涉及一种甲基磺酸乙酯离体诱变大蒜抗叶枯病突变体的方法。
背景技术
大蒜(Allium sativum L.)属百合科葱属蔬菜作物。大蒜是人们喜爱的传统调味品，具有显著的食疗作用，在我国深受消费者欢迎。但是近年来，随着大蒜种植面积和产业化发展及栽培生态环境的不断变化，大蒜叶枯病日益严重，造成大蒜蒜薹、蒜头产量的严重损失。据报道，由于大蒜叶枯病造成的损失达20％～30％，严重年份及部分地块损失达50％以上。叶枯病菌主要危害大蒜的叶片和花梗，严重时造成蒜叶枯死、大蒜不抽薹等症状，严重影响大蒜的稳产高产。
虽然目前采用化学药物可用来防治叶枯病，但大量用药会引起产品农药残留增加，降低食用安全性。
由于大蒜不育的特性和有性育种几乎不可能进行等原因，导致我国大蒜生产中优质抗性品种、出口适销品种的选育和推广严重滞后，品种选育过程中特异资源严重缺乏，优异品种资源创新力度低、具有优良性状的品种因种性退化而濒临灭绝。
大蒜为无性繁殖作物，目前大蒜主要是以地方品种为主，种植时直接采用大蒜鳞茎作为播种材料；选育新品种的方式主要是通过选种，即在田间通过蒜头大小、植株生长势、抗病性以及抽薹与否等性状根据育种目标进行选择，一般情况下如果有自然变异，则可以选择出一些有益的突变。但通常条件下，自然变异率低，大蒜新种质获得比较困难。因此研究者普遍偏向于采用物理或者化学诱变的方式对大蒜进行突变，在此基础上进行选择，可以获得较高的突变频率，可以在相对较短时间内有望获得符合育种目标的突变体。
因此，以大蒜抗叶枯病种质资源创新和新品种培育为目标，以EMS为诱变剂，以大蒜种质G024的大蒜茎盘等作为外植体进行诱变，并在含有叶枯病粗毒素的培养基上进行抗叶枯病突变株系的筛选，为大蒜抗叶枯病种质创制提供理论和技术依据。
发明内容
有鉴于此，本发明解决大蒜自然变异率低，筛选获得符合目标性状的突变体较难，常规选育的方法育种周期长、难以快速选育出符合育种目标品种的问题，提供一种甲基磺酸乙酯离体诱变大蒜抗叶枯病突变体的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：甲基磺酸乙酯离体诱变大蒜抗叶枯病突变体的方法，其特征在于：方法为：
1)以大蒜茎盘为材料，以浓度为1％的甲基磺酸乙酯(EMS)为诱变剂，分别进行处理2、4、6、8、12h，通过萌发率以确定最佳诱变时间；
2)将未诱变和诱变过的大蒜茎盘分别接种在粗毒素体积分数分别为0、5％、10％、15％、20％、25％、30％的筛选培养基上进行培养，通过萌发率以确定最佳粗毒素筛选压；
3)利用浓度为1％的EMS处理大蒜茎盘6h，将处理过的外植体接种在叶枯病病原菌粗毒素体积分数为30％的培养基上，筛选获得具有抗病性的再生植株。
进一步，步骤1)中最佳诱变时间的具体筛选方法为：
以大蒜茎盘为材料，在自来水下冲洗3h，在无菌条件下用酒精浸泡1min，用浓度为0.5％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗3次后，切取5mm厚的茎盘，按“十”字型切成4块，备用；
将处理好的大蒜茎盘放入浓度为1％的甲基磺酸乙酯(EMS)浸泡2、4、6、8、12h，后用1M硫代硫酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水洗净，擦干，接种在MS培养基上；
光照培养28d，统计萌发数，将接种茎盘一半不能萌发的处理时间确定为适宜的诱变时长。
进一步，步骤2)中最佳粗毒素筛选压的具体确定方法为：
将处理好的茎盘按“十”字型切成4块，放入浓度为2.0％的EMS磷酸缓冲液浸泡8h；
接种在粗毒素体积分数分别为0、5％、10％、15％、20％、25％、30％的筛选培养基上，每个处理接种40个外植体，设置3次重复，并以不添加EMS的磷酸缓冲液处理设置为对照；
光照培养30d后，将茎盘萌发率为2.2％的粗毒素体积分数30％确定为最终的粗毒素筛选压。
进一步，步骤3)的具体方法为：将处理好的茎盘按“十”字型切成4块，放入1.0％EMS的磷酸缓冲液浸泡6h，将诱变处理后的茎盘用1M硫代硫酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水浸泡30min，用灭过菌的滤纸擦干，接种在粗毒素体积分数分别为30％的筛选培养基上，进行抗病植株的筛选。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1)本发明以浓度为1％的EMS为诱变剂，以大蒜茎盘为外植体，通过离体诱变的方式进行抗叶枯病突变体的定向筛选；确定大蒜茎盘EMS诱变时长为6h，适宜的叶枯病粗毒素筛选压为30％。在该筛选体系下，通过浓度为1％的EMS对大蒜茎盘浸泡6h，以浓度为30％的大蒜叶枯病菌毒素半致死剂量为定向选择压进行离体培养筛选，获得抗叶枯病突变体植株，而未经过EMS诱变的大蒜茎盘在筛选压为30％的叶枯病粗毒素培养基上全部死亡。
2)本发明可为百合科植物大蒜的品种改良和新种质资源创制提供离体诱变并定向筛选的方法。
附图说明
图1为大蒜茎盘切成“十”字形；
图2浓度为1％的EMS不同处理时间对大蒜茎盘萌发率的影响；
图3附加不同浓度粗毒素对经过EMS诱变和未诱变的大蒜茎盘萌发率影响；
图4为筛选获得4个株系在附加30％粗毒素培养基上生长。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实施例提供一种甲基磺酸乙酯离体诱变大蒜抗叶枯病突变体的方法：
1)以大蒜茎盘为材料，在自来水下冲洗3h，在无菌条件下用酒精浸泡1min，用浓度为0.5％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗3次后，切取5mm厚的茎盘，按“十”字型切成4块，备用；
将处理好的大蒜茎盘放入浓度为1％的甲基磺酸乙酯(EMS)浸泡2、4、6、8、12h，后用1M硫代硫酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水洗净，擦干，接种在MS培养基上；
光照培养28d，统计萌发数，将接种茎盘有一半不萌发的处理时间确定为适宜的诱变时长。
2)将处理好的茎盘按“十”字型切成4块，放入浓度为2.0％的EMS磷酸缓冲液浸泡8h；
接种在粗毒素体积分数分别为0、5％、10％、15％、20％、25％、30％的筛选培养基上，每个处理接种40个外植体，设置3次重复，并以不添加EMS的磷酸缓冲液处理设置为对照；
光照培养30d后，为了严格定向筛选突变体，将茎盘萌发率为2.2％的粗毒素体积分数30％确定为最终的粗毒素筛选压。
3)将处理好的茎盘按“十”字型切成4块，放入1.0％EMS的磷酸缓冲液浸泡6h，将诱变处理后的茎盘用1M硫代硫酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水浸泡30min，用灭过菌的滤纸擦干，接种在粗毒素体积分数分别为30％的筛选培养基上，进行抗病植株的筛选。
本实施例测试了不同EMS处理时间对大蒜萌发情况的影响，利用大蒜茎盘作为外植体进行了浓度1％的EMS分别在2、4、6、8、12h诱变时间的处理，随着EMS处理时间的延长，大蒜茎盘萌发率呈逐渐降低的趋势。其中，EMS处理6h时，大蒜茎盘的萌发率只有51％，是大蒜茎盘萌发的半致死处理时长。试验重复3次。因此，本发明确定大蒜茎盘的EMS最佳诱变处理时间为6h。
为了进一步对诱变处理的茎盘进行抗叶枯病的定向筛选，本实验制备了大蒜叶枯病的无菌粗毒素，并研究了不同浓度粗毒素对大蒜萌发情况的影响。将诱变处理后的茎盘，接种在粗毒素体积分数分别为0、5％、10％、15％、20％、25％、30％的筛选培养基上。随着粗毒素浓度的增加，大蒜茎盘萌发率呈逐渐降低的趋势。其中，粗毒素浓度为30％时，未经过EMS处理的大蒜茎盘不能萌发；而经过EMS处理的大蒜茎盘在粗毒素浓度为30％的MS培养基上萌发率为2.2％，为了保证粗毒素的筛选效果，选择30％为定向筛选突变体的粗毒素浓度。试验重复3次。因此，确定大蒜茎盘经过EMS诱变后再进行定向筛选突变体的粗毒素浓度为30％。
通过对EMS诱导的大蒜茎盘再进行30％的大蒜叶枯病粗毒素进行定向抗叶枯病突变体的筛选，共接种200个外植体，获得了4株抗叶枯病的突变体。
以下是甲基磺酸乙醋离体诱变大蒜定向筛选抗叶枯病突变体的方法的具体步骤：
A、大蒜茎盘的获得。以G024大蒜茎盘为材料。选取健康完整的蒜瓣，剥掉其蒜皮，在自来水下冲洗3h，在无菌操作台里用体积分数为75％酒精浸泡1min，再用0.5％次氯酸钠震荡消毒15～20min，无菌水冲洗3次后，放干，切去其上部的贮藏叶，只留下5mm茎盘，将处理好的茎盘按“十”字型切成4块，作为外植体，如图1所示(其中a：大蒜茎盘；b：切成“十”字形的外植体)。
B、导致茎盘半致死的EMS诱变时间的确定：将切好的茎盘外植体放入1.0％EMS的磷酸缓冲液浸泡2、4、6、8、12h。处理后的茎盘用1M硫代硫酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水浸泡30min，接种在MS培养基上，每个处理接种30个外植体，设3次重复，并以不添加EMS的磷酸缓冲液处理设置为对照。光照培养28d，统计萌发数和每个外植体的再生芽数，计算萌发率(萌发率＝萌发外植体数/外植体总数×100％)，以28d内不分化不定根或枯黄认定其未萌发。EMS处理时间6h后，与对照相比，大蒜鳞芽的萌发率从100％降至51％左右，显著低于对照，如图2所示(其中A：CK；B～F：1.0％EMS分别处理大蒜茎盘2h、4h、6h、8h、12h后的萌发和小植株生长情况)，因此，确定1.0％的EMS处理6h作为茎盘为外植体时的诱变方式，如表1所示，表1.茎盘半致死的EMS诱变时间的确定
注：不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异；
C、无菌粗毒素的制备：将在PDA上保存的叶枯病病原菌在25℃的培养箱中培养7～14d，用直径为0.5cm的打孔器打出大小均匀的菌饼接种到I-Fries的液体培养基黑暗连续振荡9d后，用8层灭菌纱布过滤，之后利用真空抽气装置在无菌条件下用0.45μm的滤膜对滤液进行过滤即得到粗毒素。
D、适宜的毒素筛选压的确定：选取健康完整的蒜瓣，剥掉其蒜皮，在自来水下冲洗3h，在无菌操作台里用体积分数为75％酒精浸泡1min，再用0.5％次氯酸钠震荡消毒15～20min，无菌水冲洗3次后，放干，切去其上部的贮藏叶，只留下约5mm茎盘，将处理好的茎盘按“十”字型切成4块，放入2.0％EMS的磷酸缓冲液浸泡8h。将诱变处理后的茎盘用1M硫代硫酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水浸泡30min，用灭过菌的滤纸擦干，接种在粗毒素体积分数分别为0、5％、10％、15％、20％、25％、30％的筛选培养基上，每个处理接种40个外植体，设置3次重复，并以不添加EMS的磷酸缓冲液处理设置为对照。光照培养30d后，统计各处理的再生芽诱导率(萌发率＝萌发外植体数/外植体总数×100％)及发育状况，并据此确定适宜的毒素选择压。以28d内不分化不定根或枯黄认定其未萌发。
当粗毒素的浓度为30％时，未经过EMS诱变的大蒜茎盘在培养基上不能诱导芽萌发，而经过EMS诱变的茎盘萌发率为2.2％，可以萌发少量大蒜小植株，如图3所示(其中A～G：未经过诱变的大蒜茎盘在毒素分数为0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％的培养基上萌发及小植株生长情况；H～N：经过诱变的大蒜茎盘在粗毒素分数为0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％的培养基上萌发及小植株生长情况；)。为了严格定向筛选突变体，把茎盘萌发率为2.2％的粗毒素体积分数30％确定为最终的粗毒素筛选压，如表2所示；
表2.不同浓度粗毒素对未经过EMS诱变的大蒜茎盘和经过EMS诱变的大蒜茎盘萌发率影响
注：不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异；
E、抗性植株的筛选：选取健康完整的蒜瓣，剥掉其蒜皮，在自来水下冲洗3h，在无菌操作台里用体积分数为75％酒精浸泡1min，再用0.5％次氯酸钠震荡消毒15～20min，无菌水冲洗3次后，放干，切去其上部的贮藏叶，只留下5mm茎盘，将处理好的茎盘按“十”字型切成4块，放入2.0％的EMS的磷酸缓冲液浸泡8h。将诱变处理后的茎盘用1M硫代硫酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水浸泡30min，用灭过菌的滤纸擦干，接种在粗毒素体积分数为30％的筛选培养基上，随后将萌发的小植株轻轻用镊子分开，进一步按照株系接种在附加有粗毒素体积分数为30％的筛选培养基上继续进行抗病植株的培养，如图4所示(a-d：筛选获得的小植株；A-D：由抗病小植株得到的扩繁株系)。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围。上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的基本原理和主要特征，本领域技术人员阅读本申请后依然可对申请的具体实施方式进行各种变化和修改，但这些变化和修改都包括在本发明的专利保护范围内。
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