具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例和对比例中所使用的珊瑚状猴头菌粉为产自长白山的珊瑚状猴头菌子实体经粉碎机粉碎后获得，为棕黄色粉末，用于后续实验。

实施例和对比例中所使用的蜜环菌粉为深层液体发酵获得的蜜环菌菌丝体，离心、冻干后经粉碎机粉碎后的菌粉为浅黄色粉末，用于后续实验。

实施例和对比例中所使用的牛肝菌粉为牛肝菌子实体经粉碎机粉碎后获得，为棕色粉末，用于后续实验。

实施例和对比例中所使用的羊肚菌粉为羊肚菌子实体经粉碎机粉碎后获得，为浅黄色粉末，用于后续实验。

实施例1

本实施例具有神经保护及提高记忆的保健品组合物的原料药组成为：

珊瑚状猴头菌菌粉50份，蜜环菌菌粉25份，牛肝菌菌粉10份，羊肚菌菌粉15份。

该组合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将珊瑚状猴头菌子实体、牛肝菌子实体、羊肚菌子实体和蜜环菌菌丝体干燥后，经粉碎机粉碎，过50目筛，分别得到各菌菌粉；

（2）分别取珊瑚状猴头菌菌粉50份，蜜环菌菌粉25份，牛肝菌菌粉10份，羊肚菌菌粉15份，混合均匀即得实施例1的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物。

实施例2

本实施例具有神经保护及提高记忆的保健品组合物的原料药组成为：

珊瑚状猴头菌菌粉40份，蜜环菌菌粉30份，牛肝菌菌粉10份，羊肚菌菌粉20份。

该组合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将珊瑚状猴头菌子实体、牛肝菌子实体、羊肚菌子实体和蜜环菌菌丝体干燥后，经粉碎机粉碎，过50目筛，分别得到各菌菌粉；

（2）分别取珊瑚状猴头菌菌粉40份，蜜环菌菌粉30份，牛肝菌菌粉10份，羊肚菌菌粉20份，以液料比为20:1添加去离子水，煎煮3小时，得到煎煮液；

（3）将煎煮液过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末，得到实施例2的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物，按照常规的食品制备工艺制成颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、糖浆剂或膏剂等各种剂型，用于下面的药效实验。

实施例 3

本实施例具有神经保护及提高记忆的保健品组合物的原料药组成为：

珊瑚状猴头菌菌粉50份，蜜环菌菌粉20份，牛肝菌菌粉10份，羊肚菌菌粉20份。

该组合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将珊瑚状猴头菌子实体、牛肝菌子实体、羊肚菌子实体和蜜环菌菌丝体干燥后，经粉碎机粉碎，过50目筛，分别得到各菌菌粉；

（2）分别取珊瑚状猴头菌菌粉50份，蜜环菌菌粉20份，牛肝菌菌粉10份，羊肚菌菌粉20份，以液料比为25:1添加去离子水，煎煮2小时，得到煎煮液；

（3）将煎煮液过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末，得到实施例3的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物，按照常规的食品制备工艺制成颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、糖浆剂或膏剂等各种剂型，用于下面的药效实验。

实施例4

本实施例具有神经保护及提高记忆的保健品组合物的原料药组成为：

珊瑚状猴头菌菌粉60份，蜜环菌菌粉20份，牛肝菌菌粉5份，羊肚菌菌粉15份。

该组合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将珊瑚状猴头菌子实体、牛肝菌子实体、羊肚菌子实体和蜜环菌菌丝体干燥后，经粉碎机粉碎，过50目筛，分别得到各菌菌粉；

（2）分别取珊瑚状猴头菌菌粉60份，蜜环菌菌粉20份，牛肝菌菌粉5份，羊肚菌菌粉15份，以液料比为30:1添加去离子水，煎煮1.5小时，得到煎煮液；

（3）将煎煮液过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末，得到实施例4的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物，按照常规的食品制备工艺制成颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、糖浆剂或膏剂等各种剂型，用于下面的药效实验。

实施例5

本实施例具有神经保护及提高记忆的保健品组合物的原料药组成为：

珊瑚状猴头菌菌粉50份，蜜环菌菌粉25份，牛肝菌菌粉10份，羊肚菌菌粉15份。

该组合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将珊瑚状猴头菌子实体、牛肝菌子实体、羊肚菌子实体和蜜环菌菌丝体干燥后，经粉碎机粉碎，过50目筛，分别得到各菌菌粉；

（2）分别取珊瑚状猴头菌菌粉50份，蜜环菌菌粉25份，牛肝菌菌粉10份，羊肚菌菌粉15份，以液料比为30:1添加去离子水，煎煮2.5小时，得到煎煮液；

（3）将煎煮液过滤，减压浓缩后，经喷雾干燥成粉末，得到实施例5的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物，按照常规的食品制备工艺制成颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、糖浆剂或膏剂等各种剂型，用于下面的药效实验。

对比例1

本对比例为珊瑚状猴头菌菌粉。

本对比例制备方法为：将珊瑚状猴头菌子实体干燥后，经粉碎机粉碎，过50目筛，得到珊瑚状猴头菌菌粉。

对比例2

本对比例为蜜环菌菌粉。

本对比例制备方法为：将发酵获得的蜜环菌菌丝体冷冻干燥后，经粉碎机粉碎，过50目筛，得到蜜环菌菌粉。

对比例3

本对比例为牛肝菌菌粉。

本对比例制备方法为：将牛肝菌子实体干燥后，经粉碎机粉碎，过50目筛，得到牛肝菌菌粉。

对比例4

本对比例为羊肚菌菌粉。

本对比例制备方法为：将羊肚菌子实体干燥后，经粉碎机粉碎，过50目筛，得到羊肚菌菌粉。

为进一步验证本发明的效果，进行如下实验：

测试例1

本测试例为检测具有神经保护及提高记忆的保健品组合物神经保护效果。

（1）试验材料

试验药物为实施例1、2、3、4和5中获得的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物及对比例1、2、3、4的珊瑚状猴头菌菌粉、蜜环菌菌粉、牛肝菌菌粉及羊肚菌菌粉。本实验采用的小鼠细胞系为小鼠元代海马神经元细胞系（HT22；BNCC；337709）购自北纳创联生物公司。

（2）试验方法

考察上述实施例及对比例中各菌物保健品组合物及菌物单组分对L-谷氨酸诱导的HT22细胞损伤的神经保护作用。HT22细胞以5×10³个的细胞浓度接种于96孔板， 5% CO₂，37℃恒温培养箱培养14 h左右，观察细胞状态后以各组药物浓度为25和100μg / mL的剂量预处理细胞3小时，然后以终浓度为25 mM的L-谷氨酸（L-Glu）对细胞进行建模处理，空白组不进行处理，同时再次按预处理方式进行给药，共同孵育24小时。96孔板中避光加入5 mg /mL的MTT溶液，10 μL/孔，避光孵育4h后，用DMSO溶解沉淀，于490 /540 nm下检测其吸光度，分析细胞活力的变化。

以空白组存活率为100%，计算各组存活率。实验数据按平均值±标准差（mean ±S.D.）表示。统计学上显著性差异根据IBM SPSS Statistics 16软件的单因素ANOVA分析检验组间差异（事后进行Dunn's检验），P<0.05认为组间差异显著，具有统计学意义。

（3）试验结果

表1结果为药物分别为实施例1、2、3、4和5中获得的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物及对比例1、2、3、4的珊瑚状猴头菌菌粉、蜜环菌菌粉、牛肝菌菌粉及羊肚菌菌粉单一组分对HT22细胞活力影响结果。与空白组相比，以L-谷氨酸（终浓度25 mM）建模后对照组细胞活力下降至51.7%（P<0.01），给药浓度为25 μg / mL时对照组四种菌粉均显示没有明显的神经保护作用，在增加剂量至100 μg / mL，除牛肝菌粉外，珊瑚状猴头菌、蜜环菌及羊肚菌均显著的提高了细胞的存活率（P<0.05），而将四种菌粉以一定比例混合后获得的实施例1对HT22细胞的神经保护作用效果优于单一组分单独给药，而对比例2、3、4、5经热水浸提后获得的菌物组合物在给药浓度为25 μg / mL时已显示出明显的神经保护作用（P<0.05），其中实施例5效果最好，给药浓度达到100 μg / mL时，细胞存活力提升至86.5%（P<0.01）。表明具有神经保护及提高记忆的保健品组合物预处理及给药对L-谷氨酸诱导的细胞损伤中起到显著得神经保护作用，与对比例1-4相比，组合物提取物比单一组分菌粉神经保护作用显著，证明其组合物配伍后得到效果更优。

表1 具有神经保护及提高记忆的保健品组合物对HT22细胞神经保护作用结果

注：p>0.05代表不具有显著性，p<0.05代表具有显著性，p<0.01代表非常显著。

测试例2

检测具有神经保护及提高记忆的保健品组合物对小鼠记忆提高及抗氧化能力的影响。

（1）试验材料

药物：生理盐水、实施例1、2、3、4和5中获得的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物及对比例1、2、3、4的珊瑚状猴头菌菌粉、蜜环菌菌粉、牛肝菌菌粉及羊肚菌菌粉。

动物： 60只SPF级C57BL/6雄性小鼠（8周龄，体重18-22 g）购自长春生物制品研究所，许可证号码：SCXK（吉）-2011-0003。将所有小鼠饲养在温度为23±1°C，湿度为55％左右的环境中。保持12小时照明时间，均匀地照射自然光，6只/笼，小鼠可以自由摄取食物和水。

试剂盒：生化指标检测包括中枢胆碱能相关指标，如乙酰胆碱（ACh），乙酰胆碱酯酶（AChE），胆碱乙酰基转移酶（ChAT）的ELISA试剂盒，氧化应激相关指标包括ROS，超氧化物歧化酶（SOD）的ELISA试剂盒，以上试剂盒均购自江苏科特生物科技有限公司，所有试剂盒检测方法均根据试剂盒内提供说明书进行操作。

（2）试验方法

小鼠分组及给药：选SPF级健康C57BL/6雄性小鼠60只，随机分为10组，每组6只，组别分别为：空白对照组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组、对比例1组（珊瑚状猴头菌粉组）、对比例2组（蜜环菌粉组）、对比例3组（牛肝菌粉组）和对比例4（羊肚菌粉组），共10组。各组用蒸馏水溶解至适当药物浓度。在每天早上9:00灌胃给药，给药剂量为10 mg / kg，灌胃体积为0.1mL / 20g体重，空白对照组灌胃给药生理盐水，连续灌胃3周。

动物行为学测试：通过Morris水迷宫考察具有神经保护及提高记忆的保健品组合物对小鼠的认知和记忆能力提高作用。

水迷宫由一个不锈钢水池（直径为120 cm，高度为50 cm）和一个位于水面以下1cm的浸没式逃生平台（直径为10 cm）组成。水迷宫中注入自来水使其没过逃生平台1 cm左右，水中加入二氧化钛粉末，搅拌均匀使水呈现白色不透明状，水温保持在25°C左右。通过水迷宫操作系统将水迷宫均分为4个1/4圆，定为四个象限。逃生平台放置于第二象限，小鼠每次由相同位置投入水中。每次实验保证环境安静。进行连续4天的空间学习测试，小鼠找到隐藏平台所需的时间记录为逃生潜伏期。实验时间设置为2min，未在规定时间内找到平台的小鼠人为引导至逃生平台。于第5天通过水迷宫监测系统记录小鼠找到平台的时间。

在最后一次行为测试后，将小鼠禁食12小时。从尾静脉取样血液，血液在室温下静置30min，3500rpm离心5分钟，离心两次后收集上清液，并将其储存在-80°C的冰箱中。然后通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg / kg）使小鼠安乐死。快速收集大脑组织。

小鼠海马中中枢胆碱能相关指标测定：将收集的海马组织用生理盐水匀浆，并通过BCA试剂盒（Millipore）检测蛋白质浓度。根据试剂盒提供说明书进行测试，检测小鼠海马中AChE、Ach、ChAT含量。

小鼠血清中氧化应激相关指标测定：将收集的小鼠血清根据试剂盒提供说明书进行测试，检测小鼠血清中SOD、ROS含量。

数据处理方法：实验数据按平均值±标准差（mean±S.D.）表示。统计学上显著性差异根据IBM SPSS Statistics 16软件的单因素ANOVA分析检验组间差异（事后进行Dunn's检验），P<0.05认为组间差异显著，具有统计学意义。

（3）实验结果

Morris水迷宫实验结果：各组小鼠找到平台时间即逃生潜伏期实验结果如表2，实施例1为珊瑚状猴头菌、蜜环菌、牛肝菌及羊肚菌四种菌物混合菌粉，给药3周后可以显著缩短小鼠找到平台时间（P<0.05），且实验结果优于单一组分给药即对比例2-4（P>0.05），与对比例1即单独给药珊瑚状猴头菌菌粉作用相近。其中实施例2-5即四种菌粉以一定比例混合后进行热水浸提，获得的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物可以显著的缩短小鼠找寻平台的时间（P<0.05），实施例3和实施例5可以极显著的缩短小鼠找寻平台时间，提高小鼠空间记忆力，其中实施例5效果最明显，与空白对照组小鼠相比，时间缩短39.6%（P<0.01）。这说明给药实施例1-5组合物后小鼠的认知能力和记忆能力有了明显的改善。另外将实施例同对比例横向比较来看，结果发现实施例由于协同作用产生缩减小鼠寻找时间的效果更加明显，普遍存在显著性（P<0.05和P<0.01），对比例的效果则大多无显著性（P>0.05）。

表2具有神经保护及提高记忆的保健品组合物对小鼠水迷宫实验的影响

注：数据表示为平均值±标准差。（n = 6/组）。 P >0.05代表不显著，P < 0.05代表显著，P < 0.01代表极显著。

中枢胆碱能相关指标测定结果：与学习记忆和认知能力相关的乙酰胆碱（Ach）是脑中重要的神经递质，反映胆碱能神经元的状态。神经递质Ach能作用于很多胆碱受体，同时也是很多运动神经的兴奋性神经递质，其含量升高与阿尔茨海默病的改善相关。作为Ach水解酶的AchE和Ach合成酶的ChAT都可以用于调节Ach的代谢。

实验结果如表3所示，与空白对照组相比，对小鼠灌胃给药3周后，对比例1-4单一菌粉给药仅珊瑚状猴头菌显著降低AchE水平（P < 0.05），蜜环菌、牛肝菌及羊肚菌对小鼠海马中AchE水平没有明显改变（P >0.05），而以一定比例混合的四种菌物混合物经热水浸提后获得的实施例2-5都极显著的降低AchE水平（P < 0.01）。与空白对照组相比，实施例1-5显著提高了小鼠海马中Ach含量（P < 0.05），其中实施例5效果最优，含量为空白对照组的1.23倍，而对比例中使用单一菌粉灌胃给药对小鼠海马中Ach含量没有明显变化（P >0.05）。对于ChAT，与空白对照组相比，实施例5显著的增加了小鼠海马中ChAT水平（P <0.05），同时，实施例1-4均极显著的增加了ChAT水平（P < 0.01），其中实施例3效果最为显著。对比例1、3实验结果表明蜜环菌及羊肚菌单一菌粉给药也显著的增加了小鼠海马中ChAT水平（P < 0.05），但效果没有实施例显著。综合AChE、Ach及ChAT实验结果可以看出具有神经保护及提高记忆的保健品组合物可通过改善中枢胆碱能相关指标水平从而达到神经保护作用，其中四种菌粉以一定比例混合后制备的实施例1可显著改变Ach及ChAT水平。经热水浸提后获得的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物表现出更优的效果。对比例虽然具有相同的效果，但由于不同菌的作用途径不一，单独作用的效果不明显，不具有显著性。

表3 具有神经保护及提高记忆的保健品组合物对小鼠中枢胆碱能相关指标影响

注：与空白对照组相比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

氧化应激相关指标测定结果：氧化应激是包括神经变性疾病在内很多疾病的病理生理学重要假设的基础。作为氧自由基的天敌的SOD是机体的清道夫，可以清除机体内产生的有害物质，起到抗衰老的效果，并且可以阻止氧自由基的产生，避免其对细胞造成伤害，从而对受损细胞起到修复作用。实验结果如表4所示，与空白对照组相比，实施例2可以明显提升小鼠血清中SOD含量（P < 0.05），同时实施例3、4和5可以极显著的提升小鼠血清中SOD含量（p<0.01）。除此之外实施例1和对比例对小鼠血清中的SOD含量也有提升，但效果并不显著。除此之外，实施例2、4和5和对比例3可以显著清除小鼠血清中ROS，在此基础上实施例2和3对ROS的清除效果极为明显（p<0.01），其中与空白对照相比，实施例2 ROS水平降低了33.6%（p<0.01）。综上所述，具有神经保护及提高记忆的保健品组合物可以改善小鼠的氧化应激状态。对比对比例1-4的单一组分菌粉而言，以一定比例复配的四种菌粉经热水浸提后表现出更优的抗氧化效果。

表4 具有神经保护及提高记忆的组合物对小鼠血清中氧化应激指标含量的影响

注：与空白对照组相比较，^*P<0.05，^**P<0.01

体外细胞实验表明经热水浸提后获得的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物比单一菌粉具有更好的神经保护效果，同样的实验结果在动物实验中也得到验证，本发明中提供的具有神经保护及提高记忆的保健品组合物减少小鼠在Morris水迷宫中找到平台的时间，提高小鼠的空间记忆，同时可以改善小鼠中枢胆碱能相关指标及氧化应激水平。以上各个实验结果表明，通过与空白对照组及对比例即单一组分的菌粉比较，各实施例均显示出良好的改善记忆力和认知能力，同时有明显的抗氧化及抗衰老效果。实施例1为未经处理的混合菌粉，其表现出一定的改善记忆力及预防老年痴呆作用，但经热水浸提后获得的实施例2-5表现出更加优异的作用效果，综上所述，本发明组合物能够作为一种提高认知和记忆能力，预防可能的老年痴呆的保健品组合物。