一种小尺寸的磷酸钙纤维及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种小尺寸的磷酸钙纤维及其制备方法和应用 (Small-size calcium phosphate fiber and preparation method and application thereof ) 是由 姚沙沙 唐睿康 范顺武 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小尺寸的磷酸钙纤维及其制备方法和在制备用于修复骨折的药物中的应用。制备方法包括：将聚乙烯醇在90～100℃下完全溶于去离子水中,然后降温至常温得到溶液A,溶液A中聚乙烯醇的质量浓度为0.5％～1％；将尺寸小于3nm的无定形磷酸钙分散到无水乙醇中得到混合液B,混合液B中磷酸钙的浓度为5～20mg/mL；将精氨酸在常温下溶于去离子水中得到溶液C,溶液C中精氨酸的质量浓度为0.5％～3％；在搅拌下,将混合液B、溶液C逐滴加入到溶液A中均匀混合,滴加完毕后超声20～40min,最后常温风干形成薄膜后将薄膜旋拧即得小尺寸的磷酸钙纤维；混合液B、溶液C、溶液A的体积比为1:1:1。(The invention discloses a small-sized calcium phosphate fiber, a preparation method thereof and application thereof in preparing a medicament for repairing bone fracture. The preparation method comprises the following steps: completely dissolving polyvinyl alcohol in deionized water at 90-100 ℃, and then cooling to normal temperature to obtain a solution A, wherein the mass concentration of the polyvinyl alcohol in the solution A is 0.5-1%; dispersing amorphous calcium phosphate with the size less than 3nm into absolute ethyl alcohol to obtain a mixed solution B, wherein the concentration of the calcium phosphate in the mixed solution B is 5-20 mg/mL; dissolving arginine in deionized water at normal temperature to obtain a solution C, wherein the mass concentration of arginine in the solution C is 0.5-3%; dropwise adding the mixed solution B and the solution C into the solution A while stirring, uniformly mixing, performing ultrasonic treatment for 20-40 min after dropwise adding is finished, finally performing air drying at normal temperature to form a film, and then screwing the film to obtain the small-sized calcium phosphate fiber; the volume ratio of the mixed solution B, the solution C and the solution A is 1:1: 1.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种小尺寸的磷酸钙纤维及其制备方法和应用。
背景技术
骨折是指骨骼或者软骨组织在遭受暴力作用时，所发生的骨骼组织或软骨组织的完整性和连续性中断，导致骨骼功能障碍的一种典型疾病。严重的骨折会引发休克等并发症，甚至会危及生命。
如果因为骨骼本身的疾病，如结核，骨髓炎或骨瘤等而遇到轻度外力碰撞而发生的骨折称之为病理性骨折。骨折多发生于儿童及老人，中青年的发病率则较低。
一般治疗骨折的方法主要有：切开复位和夹缚骨定等。这两个是目前较为常用的临床处理骨折的手段。但是它们也有缺点：比如给患者带来痛苦，以及固定脱落时可能会引起复发，从而增加财政收支。
目前，可降解的生物仿生材料由于其良好的降解性，生物相容性，成骨诱导性等优势，从而成为较好的有应用前景的治疗骨折的材料。
在这些生物材料中，磷酸钙基的生物材料脱颖而出。这是由于磷酸钙是骨骼中的主要无机成分，占骨中成分的40～70％。并且磷酸钙还具有良好的生物相容性和骨诱导性，同时磷酸钙作为无机物，还具有良好的机械性能，因此其成为治愈骨骼疾病的主要生物材料之一。
众所周知，骨骼是由小尺寸的磷酸钙经过层层组装形成的有机-无机复合多功能材料。常用的磷酸钙基修复材料主要是结晶态的羟基磷灰石，尺寸较大，不能从根源上用来修复骨折。
公开号为CN 111138186 A的专利说明书公开了一种可用于骨折治疗加固的α磷酸三钙生物陶瓷材料及其制备方法。
公开号为CN 110947026 A的专利说明书公开了一种加速骨折愈合的骨粘合生物胶水，含纳米磷酸钙等纳米成骨颗粒。
发明内容
针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种小尺寸的磷酸钙纤维的制备方法，以聚乙烯醇(PVA)、小尺寸无定形磷酸钙(尺寸小于3nm)、精氨酸为原料，利用PVA的成膜性，以及PVA、小尺寸无定形磷酸钙和精氨酸良好的生物相容性，配合各原料加入量、加入比例的精确调控以及加料方式、温度参数、超声等工艺条件的控制，可制备得到透明的小尺寸的磷酸钙纤维。该制备方法操作简单、原料易得、成本低廉、易于重复。所得小尺寸的磷酸钙纤维为透明的纤维状物质，并能够用作生物应用。
一种小尺寸的磷酸钙纤维的制备方法，包括步骤：
(1)将聚乙烯醇在90～100℃下完全溶于去离子水中，然后降温至常温得到溶液A，所述溶液A中聚乙烯醇的质量浓度为0.5％～1％；
(2)将尺寸小于3nm的无定形磷酸钙分散到无水乙醇中得到混合液B，所述混合液B中磷酸钙的浓度为5～20mg/mL；
(3)将精氨酸在常温下溶于去离子水中得到溶液C，所述溶液C中精氨酸的质量浓度为0.5％～3％；
(4)在搅拌下，将混合液B、溶液C逐滴加入到溶液A中均匀混合，滴加完毕后超声20～40min，最后常温风干形成薄膜后将所述薄膜旋拧即得所述小尺寸的磷酸钙纤维；所述混合液B、溶液C、溶液A的体积比为1:1:1。
本发明中所述的尺寸小于3nm的无定形磷酸钙可采用现有技术制备得到，例如公告号为CN107215885B、CN110183742B以及公开号为CN110669231A的专利说明书等。
在本发明中，由于制备的磷酸钙的尺寸小于3nm，进一步优选为1.5nm，为无定形态。因此，在骨折修复中更有优势。这种小尺寸的磷酸钙纤维可以经过降解之后释放到骨折区域，通过小尺寸效应渗透入骨折周围的胶原组织中。在形成胶原的同时，渗透入胶原内部矿化胶原组织，从而形成较为稳定的新的骨骼在骨折区域。因此，本发明的小尺寸的磷酸钙纤维在骨折修复中有较为广阔的应用前景。
为了防止无定形磷酸钙结晶，本发明步骤(2)中，无定形磷酸钙必须分散在无水乙醇中，若分散在水中，则会很快结晶。进一步的，为了更好地避免结晶，作为优选，所述混合液B在步骤(4)用于与所述溶液A、溶液C均匀混合前于4℃保存。
步骤(1)中，PVA在常温下不能溶解，只有在高温条件下才能完全溶解。作为优选，步骤(1)中，将聚乙烯醇在95℃下完全溶于去离子水中。
步骤(1)中，所述溶液A中PVA浓度过低不易形成纤维材料，浓度过高纤维材料降解太慢，缓释磷酸钙效果变差。作为优选，步骤(1)中，所述溶液A中聚乙烯醇的质量浓度为0.5％，该浓度不仅可以得到完整的纤维结构，还可以具有合适的降解速率，这个速率可以保证在较短时间尽量多的释放对骨折修复有效的磷酸钙和精氨酸。
步骤(2)中，所述混合液B中磷酸钙的浓度过低会导致骨折修复效果变差，浓度过高会导致纤维的结构破坏。作为优选，步骤(2)中，所述混合液B中磷酸钙的浓度为10mg/mL。
步骤(3)中，所述溶液C中精氨酸的浓度过高或过低都会引起骨折修复性能的降低。作为优选，步骤(3)中，所述溶液C中精氨酸的质量浓度为0.5％。
步骤(4)中，溶液A、混合液B与溶液C要混合均匀，不然会导致最终纤维中物质分布不均匀。因此，本发明采用搅拌下将混合液B、溶液C逐滴加入到溶液A的方式并配合超声辅助。作为优选，步骤(4)中，所述超声的时间为30min。
本发明步骤(4)中，要在常温条件下风干，温度过高的话会导致薄膜破裂，不能形成纤维。
作为优选，步骤(4)中，在培养皿中常温风干。进一步优选，所述培养皿上方半封闭，避免杂质进入混合体系而导致在纤维中引入杂质。
步骤(4)中，薄膜制备好以后，需轻轻从培养皿中撕下，太用力会导致薄膜破裂，从而不能形成磷酸钙纤维。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的小尺寸的磷酸钙纤维。
所述小尺寸的磷酸钙纤维为透明的纤维状物质，具有一定的可降解性、生物相容性和成骨诱导性等。相对于其它的生物仿生材料，其降解性更好，磷酸钙尺寸更小，从而更好的用于骨折修复。
所述小尺寸的磷酸钙纤维可以在28天内完全降解70％左右，没有表现出明显的细胞毒性，并能够促进成骨细胞的增殖和分化，具有良好的生物相容性和成骨分化能力。
所述小尺寸的磷酸钙纤维能够明显促进骨折的愈合，且没有引起明显的炎症反应。
本发明还提供了所述的小尺寸的磷酸钙纤维在制备用于修复骨折的药物中的应用。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：
(1)所述的制备方法操作简单，原料易得，无污染，易于重复和工业化应用。
(2)制备得到的小尺寸的磷酸钙纤维为透明的纤维状物质，具有良好的降解性、生物相容性和成骨诱导性等，可以作为高效的骨折愈合的药物。
附图说明
图1为实施例1的制备得到的小尺寸的磷酸钙纤维的宏观照片(A)，扫描电镜和元素分布照片(B)，透射电镜照片(C)，X射线衍射图(D)和拉伸照片(E)，图中标尺：10μm(B)，20nm(C)；
图2为应用例1的小尺寸的磷酸钙纤维促进成骨分化的茜素红染色(A，B)和碱性磷酸酶染色(C，D)的照片，图中标尺：4mm(A，B，C，D图中的左图)，100μm(A，B，C，D图中的右图)；
图3为应用例2的小尺寸的磷酸钙纤维促进骨折愈合的X射线和断层扫描照片；
图4为应用例3的小尺寸的磷酸钙纤维在体内骨折愈合的耐酒石酸磷酸盐(TRAP)染色(A，B)和番红固绿(SO)染色(C，D)图，图中标尺：100μm；
图5为对比例1的不完整薄膜照片(其中A图聚乙烯醇浓度为0.1％，B图聚乙烯醇浓度为0.3％)和实施例2、对比例2的薄膜的降解和精氨酸释放的结果(C，D)。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
(1)将聚乙烯醇在95℃下完全溶于去离子水中，然后降温至常温得到溶液A，所述溶液A中聚乙烯醇的质量浓度为0.5％；
(2)将尺寸1.5nm左右的无定形磷酸钙分散到无水乙醇中得到混合液B，所述混合液B中磷酸钙的浓度为10mg/mL；
(3)将精氨酸在常温下溶于去离子水中得到溶液C，所述溶液C中精氨酸的质量浓度为0.5％；
(4)在搅拌下，将混合液B、溶液C逐滴加入到溶液A中均匀混合，滴加完毕后超声30min，最后转移到培养皿中保持培养皿上方半封闭常温风干形成薄膜后将所述薄膜旋拧即得小尺寸的磷酸钙纤维；所述混合液B、溶液C、溶液A的体积比为1:1:1。
如图1A所示，得到的小尺寸的磷酸钙纤维为透明的纤维状物质，可以弯曲，折叠并打结，具有一定的韧性。
如图1B所示，得到的小尺寸的磷酸钙纤维的扫描电镜结果显示，该纤维结构较为完整，相应的元素分布图可以看出C、O、Ca、P和N元素均匀分布。其中，C、O元素主要来自于PVA和精氨酸，N元素是精氨酸的代表性元素，Ca和P元素是磷酸钙的代表性元素。这种均匀分布表明PVA，精氨酸和磷酸钙在纤维中是均匀分布的。
图1C为小尺寸的磷酸钙纤维切片的透射电镜照片，表明小尺寸的磷酸钙的尺寸在1.5nm左右。
如图1D所示，X射线衍射结果显示该纤维中的无定型磷酸钙随着时间推移会逐渐出现羟基磷灰石的(002)，(211)，(310)，(222)和(213)晶面，证明纤维中的磷酸钙会随时间逐渐结晶。
图1E说明磷酸钙纤维具有一定的韧性和拉伸性，可以拉伸到原本长度的一倍以上。
应用例1小尺寸的磷酸钙纤维的成骨分化能力评估
(1)将100μg实施例1的小尺寸的磷酸钙纤维铺到24孔板底部作为实验组，空白的24孔板作为对照组。将实验组和对照组分别在紫外灯照射杀菌后，加入成骨诱导液，成骨诱导液的成分为包含10-8M地塞米松，50μg ml-1抗坏血酸，10mMβ-甘油磷酸钠和10％小牛血清的培养基。并将骨髓间充质干细胞(MSCs)种植于孔板中，培养板放置于37℃包含5％二氧化碳的加湿空气中培养，培养液隔一天换一次。培养14天以后，观察细胞的生长情况并用茜素红染色，结果如图2A(对照组)和2B(实验组)所示。
(2)将100μg实施例1的小尺寸的磷酸钙纤维铺到24孔板底部作为实验组，空白的24孔板作为对照组。将实验组和对照组分别在紫外灯照射杀菌后，加入成骨诱导液，成骨诱导液的成分为包含10-8M地塞米松，50μg ml-1抗坏血酸，10mMβ-甘油磷酸钠和10％小牛血清的培养基。并将MSCs种植于孔板中，培养板放置于37℃包含5％二氧化碳的加湿空气中培养，培养液隔一天换一次。培养7天以后，观察细胞的生长情况并用碱性磷酸酶染色，结果如图2C(对照组)和2D(实验组)所示。
图2A和2B为对照组和实验组分别培养14天以后的MSC细胞茜素红染色图。可以看出，实验组细胞的钙沉积量比对照组高很多，表明实施例1的小尺寸的磷酸钙纤维具有较好的钙沉积量。
图2C和2D为对照组和实验组分别培养7天以后的MSC细胞碱性磷酸酶图。可以看出，实验组细胞的成骨量比对照组高很多，表明实施例1的小尺寸的磷酸钙纤维具有较好的成骨分化能力。
应用例2小尺寸的磷酸钙纤维的骨折愈合的X射线和CT结果
准备8周大的C57小鼠数只，然后将胫骨折断。之后，将实施例1的小尺寸的磷酸钙纤维包裹于事先插入骨髓钉的骨折的小鼠骨折区域作为实验组。空白的骨髓钉插入小鼠骨折区域作为对照组。实验完毕后，将小鼠放回无菌房间，保持小鼠正常饮食。实验过程中，小鼠健康状况良好。分别在实验进行7天，14天，21天和28天后将小鼠猝死取出胫骨，并用X射线和纤维CT对修复的骨折区域进行表征，观察骨的修复情况。
图3A和3B为空白组的小鼠在实验结束7天，14天，21天和28天后的X射线和CT图。结果显示，实验结束7天，14天，21天和28天后空白组的骨折修复情况较差。
图3C和3D为实验组的小鼠在实验结束7天，14天，21天和28天后的X射线和CT图。结果显示，与空白组相比，实验结束7天，14天，21天和28天后实验组的骨折修复情况明显变好。
应用例3小尺寸的磷酸钙纤维的骨折愈合的TRAP和SO染色结果
取八周大雌性C57小鼠并制造骨折模型，之后将该专利中的纤维绑缚于制造的骨折缺损区域。仅制造骨折模型，不额外添加任何材料作为空白对照组。一定时间以后，取出空白组和纤维材料组的骨。脱钙之后，分别用TRAP和SO染色，观察两组骨折愈合的程度。图4为空白组和材料组7天，14天，21天和28天后的TRAP和SO染色图。其中，A为空白组的TRAP染色图，B为材料组的TRAP图。C为空白组的SO染色图，D为材料组的SO染色图。
如图4A和4B所示，空白组和实验组的小鼠在实验结束7天，14天，21天和28天后的TRAP染色结果。TRAP染色结果进一步证明实验组材料可以明显促进骨折的愈合。
如图4C和4D所示，空白组和实验组的小鼠在实验结束7天，14天，21天和28天后的SO染色结果。SO染色结果证明实验组的成骨量比对照组明显升高，证实小尺寸的磷酸钙纤维可以明显促进骨折修复。
对比例1
与实施例1的区别仅在于溶液A中聚乙烯醇的质量浓度为0.1％或0.3％，其余步骤和条件均相同。聚乙烯醇的质量浓度分别为0.1％、0.3％时，所得磷酸钙薄膜分别如图5A、5B所示，均不能形成完整薄膜结构，无法制成纤维。
实施例2
与实施例1的区别仅在于溶液A中聚乙烯醇的质量浓度为1％，其余步骤和条件均相同。
对比例2
与实施例1的区别仅在于溶液A中聚乙烯醇的质量浓度为3％，其余步骤和条件均相同。
如图5C、5D所示，与实施例2相比，对比例2的薄膜降解和释放精氨酸的量太低，不适用于生物体内的骨折修复。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。