用于治疗糖尿病的肽及方法
阅读说明：本技术 用于治疗糖尿病的肽及方法 (For treating the peptide and method of diabetes ) 是由 卢克·范德·埃尔斯特 文森特·卡利尔 让-玛丽·圣-雷米 于 2018-03-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及肽诸如HCPYCSLQPLALEGSLQKRG及它们在治疗1型糖尿病和产生溶细胞性CD4+T细胞中的用途。(The present invention relates to peptide such as HCPYCSLQPLALEGSLQKRG and they treatment type 1 diabetes and generate cytolytic CD4+T cell in purposes.)
背景技术
已经描述了几种策略来防止产生针对抗原的不需要的免疫应答。WO2008/017517描述了一种使用包含给定抗原蛋白的MHC II类抗原和氧化还原酶基序的肽的新策略。这些肽将CD4+T细胞转化为具有细胞溶解特性的细胞类型，称为溶细胞性CD4+T细胞(cytolyticCD4+T cell，溶细胞CD4+T细胞)。这些细胞能够通过触发细胞凋亡来杀死那些抗原呈递细胞(APC)，所述抗原呈递细胞呈递衍生所述肽的抗原。WO2008/017517证明了过敏和自身免疫疾病(例如I型糖尿病)的这一概念。在本文中，胰岛素可以充当自身抗原。
WO2009101207和Carlier et al.(2012)Plos one 7,10e45366进一步更详细地描述了抗原特异性溶细胞性细胞。
WO2009101206描述了具有氧化还原酶基序和可溶性同种异体抗原的MCH II类表位的肽的用途，以在用于替代疗法时防止针对这种抗原的免疫应答(例如糖尿病患者中针对注射胰岛素的不需要的免疫应答)。
WO2016059236公开了进一步修饰的肽，其中在氧化还原酶基序附近存在附加的组氨酸。
在设计针对I型糖尿病的肽时，可以考虑很多因素，例如自身抗原的类型(胰岛素、GAD 65,…)、自身抗原的特定结构域和表位、氧化还原酶基序、氧化还原酶基序与表位序列之间的长度和氨基酸序列。
发明内容
本发明提供了衍生自胰岛素的新的肽，其用于治疗1型糖尿病。
与现有技术的肽相比，本发明的肽具有优点：已使用这些肽产生的溶细胞性CD4+T细胞具有增加的IFN-γ和sFasL生产。还认为所述CD4+T细胞中的颗粒酶B的产生增加。
这些标志物的表达水平增加表明，与现有技术肽相比，本发明的肽具有更大的产生溶细胞性CD4+T细胞的能力。
本发明的一个方面涉及长度为12至50个氨基酸的肽，其包含四肽序列Cxx[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]xxC[SEQ ID NO:2](即氧化还原基序)以及与该四肽间隔0至5个氨基酸、优选间隔0至4个氨基酸(即间隔了接头)的序列LALEGSLQK[SEQ ID NO:3](即表位)。
这些肽的实施方式包含序列Cxx[CST]SLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:4]或[CST]xxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:5]。
这些肽的其它实施方式包含序列CxxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:6]。
这些肽的其它实施方式包含序列HCxx[CST]SLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:7]或H[CST]xxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:8]。
这些肽的其它实施方式包含序列HCxxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:9]。
这些肽的其它实施方式包含Cxx[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]xxC[SEQ ID NO:2]氧化还原基序序列和序列SLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:20]。
这些肽的
具体实施方式
由以下序列组成：
Cxx[CST]SLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:4]、
[CST]xxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:5]、
CxxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:6]、
HCxx[CST]SLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:7]、
H[CST]xxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:8]或
HCxxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO:9]。
这些肽的其它具体实施方式由以下序列组成：
Cxx[CST]SLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:10]、
[CST]xxCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:11]、
CxxCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:12]、
HCxx[CST]SLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:13]、
H[CST]xxCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:14]或
HCxxCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:15]。
在这些序列的具体实施方式中，Cxx[CST][SEQ ID NO:1]是CPY[CST][SEQ ID NO:16]，[CST]xxC[SEQ ID NO:2]是[CST]PYC[SEQ ID NO:17]，更具体的CxxC[SEQ ID NO:18]是CPYC[SEQ ID NO:19]。
一个具体的实施方式是肽HCPYCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:26]。
在上述实施方式中，氧化还原基序位于表位的N末端侧。
在另一组实施方式中，肽在表位的C末端侧具有氧化还原基序。
本发明的另一方面涉及任一种如上公开的肽用作药物，尤其是用于治疗或预防1型糖尿病或用于减轻1型糖尿病的症状。
另一方面涉及药物组合物，其包含任何一种如上公开的肽和药学上可接受的载体。
另一方面涉及一种用于产生针对呈递胰岛素表位的APC的溶细胞性CD4+T细胞群的体外方法，包含步骤：
-提供外周血细胞；
-使所述细胞在体外与任何一种如上公开的免疫原性肽接触；和
-在IL-2存在下扩增所述细胞。
另一方面涉及通过上述方法可获得的针对胰岛素呈递APC的溶细胞性CD4+T细胞的细胞群用作药物。
另一方面涉及通过上述方法可获得的细胞群用于治疗或预防1型糖尿病。
附图说明
图1：用p17-003或p17-001产生的细胞系中sFasL的释放。
将p17-003或p17-001特异性细胞(IL5阳性细胞；黑色直方图)用负载有肽p17-003或p17-001的抗原呈递细胞再刺激24小时(取决于用于它们的产生的肽)，并且共培养24小时后收集上清液。IL-5阴性细胞用于对照PBMC群(开放直方图)。结果表示根据细胞数校正的sFasL浓度的平均值+/-SD。
图2：该图显示了细胞系对p17-003或p17-001的刺激在细胞因子产生方面的响应。
具体实施方式
将结合特定实施方式描述本发明，但是本发明不限于所述实施方式，而是仅由权利要求限制。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制范围。提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。除非本文中具体定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明领域技术人员理解的相同含义。本文提供的定义不应被解释为具有比本领域普通技术人员所理解的范围小的范围。
如本领域技术人员清楚的，除非另有说明，否则所有未具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以且已经以本身已知的方式执行。例如，再次参考标准手册、上文提到的一般背景技术和其中引用的其它参考文献。
如本文使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式‘一个’、‘一种’和‘该’包括单数和复数指代物。当与本文使用的方面、权利要求或实施方式相关使用时，术语“任何”是指提及的所述方面、权利要求或实施方式的任何单个(即任一个)以及所有组合。
如本文使用的术语‘包含(comprising)’、‘包含(comprises)’和‘包含(comprisedof)’是‘包括(including)’、‘包括(includes)’或‘含有(containing)’、‘含有(contains)’的同义词，并且是包容性的或开放式的，不排除其它未列举的成员、要素或方法步骤。所述术语还涵盖实施方式“基本由…组成”和“由…组成”。
由端点表述的数值范围包括包含在相应范围内的所有数字和分数，以及所列举的端点。
当提及诸如参数、量、时距等可测量值时，本文所用的术语‘约’意指涵盖指定值+/-10％或更小，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，更优选+/-0.1％或更小的变化，只要这些变化适合于在所公开的发明中实行即可。应理解的是，修饰语‘约’所引用的值本身也被具体地且优选地公开。
如本文所使用的，“用于治疗疾病的组合物”中使用的术语“用于”还应公开了相应的治疗方法和制剂用于制造用于治疗疾病的药物的相应用途。
如本文所用的术语“肽”是指包含通过肽键连接的12至200个氨基酸的氨基酸序列的分子，但其可包含非氨基酸结构。
根据本发明的肽可以含有任何常规的20种氨基酸或其修饰形式，或者可以含有通过化学肽合成或通过化学或酶促修饰掺入的非天然存在的氨基酸。
如本文所用的术语“抗原”是指大分子的结构，通常是蛋白质(有或没有多糖)，或者由包含一个或多个半抗原并包含T细胞表位的蛋白质组合物制成。
如本文所用的术语“抗原蛋白”是指包含一个或多个T细胞表位的蛋白质。如本文所用的自身抗原或自身抗原蛋白是指存在于体内的人类或动物蛋白，其在同一人体或动物体内引发免疫应答。
术语“表位”是指抗原蛋白的一个或几个部分(其可以限定构象表位)，其被抗体或其部分(Fab'、Fab2'等)或者存在于B或T细胞淋巴细胞的细胞表面的受体特异性识别并结合，并且其通过所述结合能够诱导免疫应答。
在本发明的上下文中，术语“T细胞表位”是指显性的、亚显性的或次要的T细胞表位，即抗原蛋白的一部分，被T淋巴细胞的细胞表面的受体特异性识别并结合。表位是显性的、亚显性的还是次要的，取决于针对该表位引发的免疫反应。在所有可能的蛋白质T细胞表位中，显性取决于T细胞识别这些表位并能够激活它们的频率。
T细胞表位是由MHC II类分子识别的表位，其由+/-9个氨基酸的序列组成，其适合MHC II分子的凹槽。在代表T细胞表位的肽序列中，表位中的氨基酸编号为P1至P9，表位的氨基酸N-末端编号为P-1、P-2等，且表位的氨基酸C末端编号P+l、P+2等。由MHC II类分子而非MHC I类分子识别的肽被称为MHC II类限制性T细胞表位。
术语“MHC”是指“主要组织相容性抗原”。在人类中，MHC基因被称为HLA(“人类白细胞抗原”)基因。虽然没有一贯遵循的惯例，但是一些文献使用HLA来指代HLA蛋白质分子，并且使用MHC来指代编码HLA蛋白质的基因。因此，术语“MHC”和“HLA”在本文中使用时是等效的。人体中的HLA系统在小鼠中具有其等同物，即H2系统。研究最深入的HLA基因是9种所谓的经典MHC基因：HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DPA1，HLA-DPB1，HLA-DQA1，HLAs DQB1，HLA-DRA和HLA-DRB1。在人类中，MHC分为三个区域：I、II和III类。A、B和C基因属于MHC I类，而6个D基因属于II类。MHC I类分子由含有3个结构域(α1、2和3)的单个多态链组成，其与细胞表面的β2微球蛋白相关联。II类分子由2条多态链组成，每条多态链含有2条链(α1和2，以及β1和2)。
I类MHC分子几乎在所有有核细胞上表达。
在I类MHC分子的背景下呈现的肽片段被CD8+T淋巴细胞(溶细胞性T淋巴细胞或CTL)识别。CD8+T淋巴细胞经常成熟为细胞溶解性效应物，其可裂解带有刺激抗原的细胞。II类MHC分子主要在活化的淋巴细胞和抗原呈递细胞上表达。CD4+T淋巴细胞(辅助T淋巴细胞或Th)被由II类MHC分子呈递的独特肽片段的识别而激活，所述II类MHC分子通常发现在抗原呈递细胞如巨噬细胞或树突细胞上。CD4+T淋巴细胞增殖并分泌细胞因子如IL-2、IFN-γ和IL-4，支持抗体介导的和细胞介导的应答。
功能性HLA的特征在于内源性以及外来的潜在抗原性肽结合的深结合凹槽。该凹槽的特征还在于明确的形状和物理化学性质。HLA I类结合位点是封闭的，因为肽末端被固定在凹槽的末端。它们还涉及与保守HLA残基的氢键网络。鉴于这些限制，结合肽的长度限于8、9或10个残基。然而，已经证明，多达12个氨基酸残基的肽也能够结合HLA I类。不同HLA复合物的结构比较证实了一般的结合模式，其中肽采用相对线性的延伸的构象，或者可以使中心残基以凸出凹槽。
与HLA I类结合位点相反，II类位点在两端是开放的。这允许肽从实际的结合区域延伸出，从而“悬挂”在两端。因此，II类HLA可以结合可变长度的肽配体，所述长度范围为9个至超过25个氨基酸残基。类似于HLA I类，II类配体的亲和力由“恒定”和“可变”组分决定。恒定部分再次由HLA II类凹槽中的保守残基与结合肽的主链之间形成的氢键网络产生。然而，该氢键模式不限于肽的N-和C-末端残基，而是分布在整个链上。后者是重要的，因为它将复合肽的构象限制为严格线性的结合模式。这对于所有II类同种异型都很常见。由于II类结合位点内的多态性的某些位置，决定肽的结合亲和力的第二组分是可变的。不同的同种异型在凹槽内形成不同的互补口袋，从而解决了肽的亚型依赖性选择或特异性。重要的是，对II类口袋中保持的氨基酸残基的限制通常比I类“更软”。在不同的HLA II类同种异型中，肽的交叉反应性要高得多。适合在MHC II分子凹槽中的MHC II类T细胞表位的+/-9氨基酸(即8、9或10)的序列通常编号为P1至P9。该表位的附加氨基酸N-末端编号为P-1、P-2等，该表位的氨基酸C-末端编号为P+1、P+2等。
参考本发明上下文中使用的表位而在本文使用的术语“同源物”是指，与天然存在的表位具有至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的氨基酸序列同一性的分子，由此保持了所述表位结合抗体或者B和/或T细胞的细胞表面受体的能力。表位的特定同源物对应于在最多三个，更特别是在最多2个，最特别是在一个氨基酸中进行修饰的天然表位。
参考本发明的肽而在本文中使用的术语“衍生物”是指含有至少肽活性部分(即氧化还原基序和能够引发溶细胞性CD4+T细胞活性的MHC II类表位)以及除此之外还包含可以具有不同目的(诸如稳定肽或改变肽的药代动力学或药效学特性)的互补部分的分子。
本文使用的两个序列的术语“序列同一性”涉及当将所述两个序列对齐时，具有相同核苷酸或氨基酸的位置数除以较短序列中的核苷酸或氨基酸数。特别地，序列同一性为70％至80％，81％至85％，86％至90％，91％至95％，96％至100％，或100％。
本文使用的术语“肽编码性多核苷酸(或核酸)”和“编码肽的多核苷酸(或核酸)”是指核苷酸序列，当在适当的环境中表达时，其导致产生相关的肽序列或其衍生物或同源物。此类多核苷酸或核酸包括编码所述肽的正常序列，以及能够表达具有所需活性的肽的这些核酸的衍生物和片段。编码根据本发明的肽或其片段的核酸是编码源自哺乳动物或对应于哺乳动物的肽或其片段(最特别是人类肽片段)的序列。
术语“免疫紊乱”或“免疫疾病”是指一种疾病，其中免疫系统的反应是造成或维持生物体内功能障碍或非生理状况的原因。免疫紊乱尤其包括过敏性疾病和自身免疫性疾病。
术语“自身免疫性疾病”或“自身免疫性紊乱”是指由于生物体未能将其自身的组成部分(低至亚分子水平)识别为“自我”而引起的生物体针对其自身细胞和组织的异常免疫应答导致的疾病。这组疾病可分为两类，器官特异性疾病和全身性疾病。“过敏原”定义为一种物质，通常是大分子或蛋白质组合物，其能在易感(特别是遗传性处置的)个体(特应性)患者中诱发产生lgE抗体。Liebers et al.(1996)Clin.Exp.Allergy 26,494-516中提出了类似的定义。
术语“1型糖尿病”(T1D)或“糖尿病1型”(也称为“1型糖尿病”或“免疫介导的糖尿病”或以前称为“青少年发病型糖尿病”或“胰岛素依赖性糖尿病”)是自身免疫性紊乱，通常在儿童时期易感个体中发展。在T1D的基础上，发病机制是通过自身免疫机制破坏大多数产生胰岛素的胰腺β细胞。简而言之，生物体失去对负责胰岛素生产的胰腺β细胞的免疫耐受，并诱导免疫应答，主要是细胞介导的与自身抗体的产生相关，导致β细胞的自我破坏。
术语“治疗有效量”是指本发明的肽或其衍生物的量，其在患者中产生所需的治疗或预防效果。例如，在提及疾病或紊乱时，其是在一定程度上减少疾病或紊乱的一种或多种症状的量，更具体地，其部分或完全地将与疾病或紊乱相关的或者导致疾病或紊乱的生理或生化参数恢复至正常。通常，治疗有效量是本发明的肽或其衍生物的量，其将导致正常生理情况的改善或恢复。例如，当用于治疗受免疫紊乱影响的哺乳动物时，它是每日量肽/kg所述哺乳动物的体重。或者，在通过基因治疗施用的情况下，调节裸DNA或病毒载体的量以确保局部产生本发明的肽、其衍生物或同源物的相关剂量。
当提及肽时，术语“天然的”涉及这样的事实：该序列与天然存在的蛋白质(野生型或突变体)的片段相同。与此相反，术语“人工的”是指在自然界中不存在的序列。通过有限的修饰，例如在天然存在的序列中改变/缺失/***一个或多个氨基酸，或通过添加/去除天然存在序列的N-或C-末端的氨基酸，从天然序列获得人工序列。
氨基酸在本文中以它们的全名、它们的三字母缩写或它们的一个字母缩写来引用。
在本文中根据Prosite格式描述氨基酸序列的基序。基序用于描述序列特定部分的某种序列变体。将符号X用于接受任何氨基酸的位置。对于给定位置，通过在方括号('[]')之间列出可接受的氨基酸来指示替代物。例如：[CST]代表选自Cys、Ser或Thr的氨基酸。通过在大括号('{}')之间将它们列出来指示排除作为替代物的氨基酸。例如：{AM}代表除Ala和Met之外的任何氨基酸。基序中的不同要素可选地通过连字符(-)彼此分开。可以通过在要素后面放置括号之间的数值或数值范围来指示基序内重复的相同要素。例如，X(2)对应于X-X或XX；X(2,5)对应于2、3、4或5个X氨基酸，A(3)对应于A-A-A或AAA。
为区分氨基酸X，H和C之间的那些氨基酸称为外部氨基酸X(上述序列中带单下划线的)，氧化还原基序中的那些称为内部氨基酸X(上述序列中带双下划线的)。
X表示任何氨基酸，特别是L-氨基酸，更特别是20种天然存在的L-氨基酸之一。
包含T细胞表位和具有还原活性的经修饰的肽基序序列的肽能够产生针对抗原呈递细胞的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞群。
因此，从最广泛的意义上讲，本发明涉及肽，其包含具有引发免疫反应的潜力的至少一个抗原(自身或非自身)的T细胞表位，以及对肽二硫键具有还原活性的经修饰的硫代还原酶序列基序。T细胞表位和经修饰的氧化还原基序序列可以在肽中彼此直接相邻或任选地由一个或多个氨基酸(所谓的接头序列)分开。任选地，肽附加地包含内体靶向序列和/或附加“侧翼”序列。
本发明的肽包含：具有引发免疫反应的潜力的抗原(自身或非自身)的MHC II类T细胞表位，和经修饰的氧化还原基序。可以测定肽中基序序列还原巯基的能力来测定其还原活性，例如在胰岛素溶解度测定中，其中胰岛素的溶解度在还原时被改变，或者用荧光标记的底物如胰岛素。这种测定的一个实例使用荧光肽并且描述于Tomazzolli et al.(2006)Anal.Biochem.350,105-112。当两个具有FITC标记的肽通过二硫桥彼此共价连接时，它们变成自猝灭。在通过根据本发明的肽还原后，还原的单个肽再次发出荧光。
经修饰的氧化还原基序可以位于T细胞表位的氨基末端侧或T细胞表位的羧基末端。
在硫代还原酶中遇到具有还原活性的肽片段，所述硫代还原酶是小的二硫化物还原酶，包括谷氧还蛋白、核仁毒素、硫氧还蛋白和其它硫醇/二硫化物氧化还原酶(Holmgren(2000)Antioxid.Redox Signal.2,811-820；Jacquot et al.(2002)Biochem.Pharm.64,1065-1069)。它们是多功能的，普遍存在于许多原核生物和真核生物中。它们通过保守活性结构域共有序列内的氧化还原活性半胱氨酸对蛋白质(如酶)上的二硫键发挥还原活性，所述保守活性结构域共有序列为：CXXC[SEQ ID NO:18]、CXXS[SEQ ID NO:23]、CXXT[SEQ IDNO:24]、SXXC[SEQ ID NO:21]、TXXC[SEQ ID NO:22](Fomenko et al.(2003)Biochemistry42,11214-11225；Fomenko et al.(2002)Prot.Science 11,2285-2296)，其中X代表任何氨基酸。此类结构域也存在于较大的蛋白质中，如蛋白质二硫键异构酶(PDI)和磷酸肌醇特异性磷脂酶C。
从例如Fomenko和WO2008/017517已知的4氨基酸氧化还原基序包含位置1和/或4的半胱氨酸；因此该基序为CXX[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]XXC[SEQ ID NO:2]。这种四肽序列将被称为“基序”。肽中的基序可以是任一替代物CXXC[SEQ ID NO:18]、SXXC[SEQ IDNO:21]、TXXC[SEQ ID NO:22]、CXXS[SEQ ID NO:23]或CXXT[SEQ ID NO:24]。特别地，肽含有序列基序CXXC[SEQ ID NO:18]。
如进一步详细解释的，本发明的肽可以通过化学合成制备，其允许掺入非天然氨基酸。因此，上述氧化还原修饰的氧化还原基序中的“C”代表半胱氨酸或者具有硫醇基团的另一种氨基酸，例如巯基缬氨酸、高半胱氨酸或具有硫醇官能团的其它天然或非天然氨基酸。为了具有还原活性，存在于经修饰的氧化还原基序中的半胱氨酸不应作为胱氨酸二硫桥的一部分出现。然而，氧化还原修饰的氧化还原基序可以包含经修饰的半胱氨酸，例如甲基化半胱氨酸，其在体内转化为具有游离巯基的半胱氨酸。X可以是20种天然氨基酸中的任何一种，包括S、C或T或可以是非天然氨基酸。在特定的实施方式中，X是具有小侧链的氨基酸，例如Gly、Ala、Ser或Thr。在进一步特定的实施方式中，X不是具有庞大侧链的氨基酸，例如Trp。在进一步特定的实施方式中，X不是半胱氨酸。在进一步特定的实施方式中，经修饰的氧化还原基序中的至少一个X是His。在其它进一步特定的实施方式中，经修饰的氧化还原基序中的至少一个X是Pro。
肽可以进一步包含修饰以增加稳定性或溶解性，例如修饰N-末端NH2基团或C末端COOH基团(例如将COOH修饰成CONH2基团)。
在包含经修饰的氧化还原基序的本发明的肽中，所述基序经定位使得当表位适合于MHC凹槽时，所述基序保留在MHC结合凹槽的外部。将经修饰的氧化还原基序紧邻肽内的表位序列放置[换句话说，基序和表位之间的接头序列为零个氨基酸]，或者通过包含5个或更少氨基酸的氨基酸序列的接头与T细胞表位分隔开。更特别地，所述接头包含1、2、3、4或5个氨基酸。具体实施方式是在表位序列和经修饰的氧化还原基序序列之间具有0、1或2氨基酸接头的肽。在那些经修饰的氧化还原基序序列与表位序列相邻的肽中，与表位序列相比，这指示为位置P-4至P-1或者P+1至P+4。除肽接头外，其它有机化合物也可用作接头以将肽的各部分彼此连接(例如，将经修饰的氧化还原基序序列与T细胞表位序列连接)。
本发明的肽可以进一步在包含T细胞表位和经修饰的氧化还原基序的序列的N或C末端包含附加的短氨基酸序列。这种氨基酸序列在本文中通常称为‘侧翼序列’。侧翼序列可以位于表位和内体靶向序列之间和/或经修饰的氧化还原基序和内体靶向序列之间。在不包含内体靶向序列的某些肽中，短氨基酸序列可以存在于肽内经修饰的氧化还原基序和/或表位序列的N和/或C末端。更特别地，侧翼序列是1至7个氨基酸的序列，最特别是2个氨基酸的序列。
经修饰的氧化还原基序可位于表位的N末端。
在本发明的某些实施方式中，提供了包含一个表位序列和经修饰的氧化还原基序序列的肽。在进一步特定的实施方式中，经修饰的氧化还原基序在肽中出现多次(1、2、3、4或甚至更多次)，例如作为可以彼此间隔一个或多个氨基酸的经修饰的氧化还原基序的重复，或者作为彼此直接相邻的重复。或者，在T细胞表位序列的N和C末端均提供一个或多个经修饰的氧化还原基序。
为本发明的肽设想的其它变体包括含有T细胞表位序列重复的肽，其中每个表位序列在经修饰的氧化还原基序之前和/或之后(例如，“经修饰的氧化还原基序-表位”的重复或者“经修饰的氧化还原基序-表位-经修饰的氧化还原基序”的重复)。在本文中，经修饰的氧化还原基序都可以具有相同的序列，但这不是强制性的。值得注意的是，包含本身含有经修饰的氧化还原基序的表位的肽的重复序列，也将产生包含‘表位’和‘经修饰的氧化还原基序’的序列。在这些肽中，一个表位序列内经修饰的氧化还原基序在第二表位序列外起到经修饰的氧化还原基序的作用。
通常，本发明的肽仅包含一个T细胞表位。如下所述，蛋白质序列中的T细胞表位可以通过功能测定和/或二氧化硅预测测定中的一种或多种来鉴定。T细胞表位序列中的氨基酸根据它们在MHC蛋白结合凹槽中的位置编号。肽内存在的T细胞表位由8至25个氨基酸组成，更特别是由8至16个氨基酸组成，但最特别地由8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸组成。
在更特定的实施方式中，T细胞表位由9个氨基酸的序列组成。在进一步特定的实施方式中，T细胞表位是由MHC-II类分子呈递给T细胞的表位[MHC II类限制性T细胞表位]。通常T细胞表位序列是指适合于MHC II蛋白裂隙的八肽或更具体地说是九肽序列。
本发明的肽的T细胞表位可以对应于蛋白质的天然表位序列或者可以是其修饰版本，前提是经修饰的T细胞表位保留其结合在MHC裂隙内的能力，类似于天然T细胞表位序列。经修饰的T细胞表位对MHC蛋白质可以具有与天然表位相同的结合亲和力，但也可以具有降低的亲和力。特别地，修饰肽的结合亲和力比原始肽低了不小于10倍，更特别是不小于5倍。本发明的肽对蛋白质复合物具有稳定作用。因此，肽-MHC复合物的稳定作用补偿了修饰表位对MHC分子的亲和力降低。
在肽内包含T细胞表位和还原化合物的序列可以被进一步连接到促进肽摄入到晚期内体中以便在MHC II类决定簇内加工和呈递的氨基酸序列(或另一有机化合物)。晚期内体靶向由蛋白质细胞质尾部中存在的信号介导，并且对应于充分鉴定的肽基序。晚期内体靶向序列允许MHC-II类分子处理和有效呈递抗原来源的T细胞表位。此类内体靶向序列包含在例如gp75蛋白(Vijayasaradhi et al.(1995)J.Cell.Biol.130,807-820)、人类CD3γ蛋白、HLA-BM 11(Copier et al.(1996)J.Immunol.157,1017-1027)、DEC205受体的细胞质尾部(Mahnke et al.(2000)J.Cell Biol.151,673-683)中。向内体发挥分选信号的肽的其它例子公开于Bonifacio和Traub(2003)Annu.Rev.Biochem.72,395-447的综述中。或者，所述序列可以是来自蛋白质的亚显性或次要T细胞表位的序列，其促进晚期内体内的摄入而不克服针对抗原的T细胞应答。晚期内体靶向序列可以位于抗原来源肽的氨基末端或羧基末端，以便有效摄入和加工，并且还可以通过侧翼序列例如至多10个氨基酸的肽序列而偶联。当使用次要T细胞表位用于靶向目的时，后者通常位于抗原来源肽的氨基末端。
因此，本发明设想了抗原蛋白的肽及其在引发特异性免疫反应中的用途。这些肽可以对应于蛋白质片段，所述蛋白质片段在其序列内包含由至多10个、优选7个或更少氨基酸分隔开的T细胞表位和还原化合物。或者，并且对于大多数抗原蛋白，本发明的肽通过将还原化合物、更特别是本文所述的还原修饰的氧化还原基序在N-末端或C-末端偶联到抗原蛋白的T细胞表位(与其直接相邻或者具有至多10个，更特别地至多7个氨基酸的接头)而产生。另外，与天然存在的序列相比，可以修饰蛋白质的T细胞表位序列和/或经修饰的氧化还原基序，和/或可以引入(或修饰)一个或多个侧翼序列和/或靶向序列。因此，取决于是否可以在目标抗原蛋白的序列内发现本发明的特征，本发明的肽可包含‘人工’或‘天然存在’的序列。
本发明的肽的长度可以显著变化。肽的长度可以从13或14个氨基酸(即由8-9个氨基酸的表位、与其相邻的具有组氨酸的经修饰的氧化还原基序5个氨基酸组成)变化至多达20、25、30、40或50个氨基酸。例如，肽可包含40个氨基酸的内体靶向序列、约2个氨基酸的侧翼序列、如本文所述的5个氨基酸的基序、4个氨基酸的接头和9个氨基酸的T细胞表位肽。
因此，在特定的实施方式中，完整的肽由13个氨基酸至多达20、25、30、40、50、75或100个氨基酸组成。更特别地，在还原化合物是本文所述的经修饰的氧化还原基序的情况下，包含任选地由接头连接的表位和经修饰的氧化还原基序(在本文中称为‘表位-经修饰的氧化还原基序’序列)但不包含内体靶向序列的(人工或天然)序列的长度是至关重要的。‘表位-经修饰的氧化还原基序’更特别地具有13、14、15、16、17、18或19个氨基酸的长度。这种13或14至19个氨基酸的肽可任选地与内体靶向信号偶联，所述内体靶向信号的大小不太重要。
如上所述，在特定实施方式中，本发明的肽包含与T细胞表位序列连接的如本文所述的还原修饰的氧化还原基序。
在进一步特定的实施方式中，本发明的肽是包含T细胞表位的肽，该T细胞表位在其天然序列内不包含具有氧化还原性质的氨基酸序列。
然而，在替代实施方式中，T细胞表位可包含确保表位与MHC裂隙结合的任何氨基酸序列。当抗原蛋白的目标表位在其表位序列内包含如本文所述经修饰的氧化还原基序时，根据本发明的免疫原性肽包含如本文所述的经修饰的氧化还原基序序列和/或与表位序列N-或C-末端偶联的另一个还原序列的序列，使得(与包埋在裂隙内的表位内存在的经修饰的氧化还原基序相反)所附接的经修饰的氧化还原基序可以确保还原活性。
因此，T细胞表位和基序直接相邻或彼此分开，但不重叠。为了评估“直接相邻”或“分开”的构思，确定了适合在MHC裂隙内的8或9氨基酸序列，并且确定了这种八肽或九肽与氧化还原基序四肽或经修饰的氧化还原基序五肽(包括组氨酸)之间的距离。
通常，本发明的肽不是天然的(因此不是原样的蛋白质片段)，而是除T细胞表位外还含有如本文所述的经修饰的氧化还原基序的人工肽，由此所述经修饰的氧化还原基序通过由至多七个、最特别是至多四或至多2个氨基酸组成的接头与所述T细胞表位直接分隔开。
已经表明，在给哺乳动物施用(即注射)根据本发明的肽(或包含这种肽的组合物)时，该肽引发T细胞的活化，识别抗原来源的T细胞表位，并通过表面受体的减少而向T细胞提供附加信号。这种超最佳活化导致T细胞获得针对呈递T细胞表位的细胞的细胞溶解特性，以及对旁观者T细胞的抑制特性。以这种方式，含有抗原来源的T细胞表位并且在该表位外含有经修饰的氧化还原基序的本发明所述的肽或者包含所述肽的组合物可用于哺乳动物(包括人类)的直接免疫。因此，本发明提供了本发明的肽或其衍生物，用作药物。因此，本发明提供了治疗方法，其包含将根据本发明的一种或多种肽施用于有需要的患者。
本发明提供了一种方法，通过该方法，可以通过用小肽免疫来引发具有细胞溶解特性的抗原特异性T细胞。已经发现，含有(i)来自抗原的编码T细胞表位的序列和(ii)具有氧化还原性质的共有序列以及进一步任选地还包含促进肽摄入晚期内体中以便有效MHC-II类呈递的序列的肽，引发抑制性T细胞。
本发明的肽的免疫原性特性在治疗和预防免疫反应中特别令人感兴趣。
本文描述的肽用作药物，更特别地用于制造用于预防或治疗哺乳动物(特别是人类)免疫紊乱的药物。
本发明描述了通过使用本发明的肽、其同源物或衍生物治疗或预防需要这种治疗或预防的哺乳动物的免疫紊乱的方法，该方法包含步骤：向患有免疫紊乱或者具有免疫紊乱风险的所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的肽、其同源物或衍生物，从而减轻免疫紊乱的症状。设想了对人类和动物如宠物和农场动物的治疗。在一个实施方式中，待治疗的哺乳动物是人类。上述免疫紊乱在特定实施方式中选自过敏性疾病和自身免疫性疾病。
本发明的肽或如本文定义的包含此种肽的药物组合物优选通过皮下或肌肉内给药。优选地，所述肽或包含此种肽的药物组合物可以皮下(SC)注射在上臂的外侧部分在肘部和肩部之间中间的区域内。当需要两次或更多次单独注射时，它们可以在两臂中同时施用。
根据本发明的肽或包含其的药物组合物以治疗有效剂量施用。示例性但非限制性的剂量方案为50至1500μg，优选100至1200μg。更具体的剂量方案可以在50至250μg之间，250至450μg之间或850至1300μg之间，这取决于患者的状况和疾病的严重程度。剂量方案可包含施用单剂量或者同时或连续施用2、3、4、5或更多个剂量。示例性的非限制性给药方案如下：
-低剂量方案，包含SC施用50μg肽，分两次注射，每次25μg(每次100μL)，随后三个连续注射25μg肽，每个分两次注射，每次12.5μg(每次50μL)。
-中剂量方案，包含SC施用150μg肽，分两次注射，每次75μg(每次300μL)，随后三个连续施用75μg肽，每个分两次注射，每次37.5μg(每次150μL)。
-高剂量方案，包含SC施用450μg肽，分两次注射，每次225μg(每次900μL)，随后三个连续施用225μg肽，每个分两次注射，每次112.5μg(每次450μL)。
对于所有上述肽，设想了其它变体，其中在组氨酸和半胱氨酸之间存在一个或两个氨基酸X。通常，这些外部氨基酸X不是His、Cys、Ser或Thr。
本发明的肽还可以用于体外诊断方法，用于检测样品中的II类限制性CD4+T细胞。在该方法中，使样品与MHC II类分子和根据本发明的肽的复合物接触。通过测量复合物与样品中细胞的结合来检测CD4+T细胞，其中复合物与细胞的结合指示样品中CD4+T细胞的存在。
复合物可以是肽和MHC II类分子的融合蛋白。
可替代地，复合物中的MHC分子是四聚体。该复合物可以作为可溶性分子提供或可以连接到载体上。
因此，在特定实施方式中，本发明的治疗和预防方法包含施用如本文所述的免疫原性肽，其中肽包含抗原蛋白的T细胞表位，其在待治疗的疾病(例如，如上所述的那些)中起作用。在进一步特定的实施方式中，使用的表位是显性表位。
通过合成肽来制备根据本发明的肽，其中T细胞表位和经修饰的氧化还原基序被0至5个氨基酸分开。在某些实施方式中，可以通过在表位序列外部引入1、2或3个突变来获得经修饰的氧化还原基序，以保持蛋白质中存在的序列背景。通常，参照作为天然序列一部分的九肽，P-2和P-l以及P+10和P+11中的氨基酸保留在肽序列中。这些侧翼残基通常稳定与MHC II类的结合。在其它实施方式中，表位的序列N末端或C末端与含有T细胞表位序列的抗原蛋白的序列无关。
因此，基于设计肽的上述方法，通过化学肽合成、重组表达方法或在更特殊的情况下蛋白质的蛋白水解或化学片段化来产生肽。
可以在体外和体内方法中测试在上述方法中产生的肽是否存在T细胞表位，并且可以在体外测定中测试它们的还原活性。作为最后的质量控制，这些肽可以在体外测定中进行测试，以验证肽是否可以产生CD4+T细胞，其通过细胞凋亡途径溶解抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞呈递的抗原含有在具有经修饰的氧化还原基序的肽中也存在的表位序列。
可以使用重组DNA技术在细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中产生本发明的肽。鉴于肽的长度有限，它们可以通过化学肽合成来制备，其中通过将不同的氨基酸彼此偶联来制备肽。化学合成特别适合用于纳入例如D-氨基酸、具有非天然存在的侧链的氨基酸或具有修饰的侧链的天然氨基酸，例如甲基化的半胱氨酸。
化学肽合成方法被充分地描述，并且肽可以从诸如Applied Biosystems和其它公司等公司订购。
肽合成可以作为固相肽合成(SPPS)或与溶液相肽合成相反进行。最著名的SPPS方法是t-Boc和Fmoc固相化学：
在肽合成期间，使用多种保护基团。例如，通过叔丁基保护羟基和羧基官能团，通过t-Boc基团保护赖氨酸和色氨酸，通过三苯甲基保护天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和组氨酸，和通过pdf基团保护精氨酸。如果合适，在合成后可以将这种保护基团留在肽上。使用连接策略(两个未保护的肽片段的化学选择性偶联)，可以将肽彼此连接以形成更长的肽，如Kent(Schnelzer&Kent(1992)Int.J.Pept.Protein Res.40,180-193)最初描述的以及例如Tam et al.(2001)Biopolymers 60,194-205综述的，这提供了超出SPPS范围来实现蛋白质合成的巨大潜力。通过该方法已成功合成了大小为100-300个残基的许多蛋白质。由于SPPS的巨大进步，合成肽在生物化学、药理学、神经生物学、酶学和分子生物学等研究领域继续发挥着越来越重要的作用。
可替代地，可以通过使用编码本发明的肽的核酸分子在合适的表达载体中合成肽，所述表达载体包括编码核苷酸序列。使用自动DNA合成仪和众所周知的遗传密码的密码子-氨基酸关系，可以容易地制备这种DNA分子。使用寡核苷酸探针和常规杂交方法，这种DNA分子也可以作为基因组DNA或cDNA获得。此类DNA分子可以掺入到表达载体(包括质粒)中，其适于在如细菌(例如大肠杆菌)、酵母细胞、动物细胞或植物细胞等适合宿主中表达DNA并且产生多肽。
检查目标肽的物理和化学性质(例如溶解度、稳定性)以确定该肽是否适合用于治疗组合物中。通常，这是通过调节肽的序列来优化的。任选地，在合成后可以使用本领域公知的技术来修饰肽(化学修饰，例如添加/缺失官能团)。
认为T细胞表位本身通过与抗原呈递细胞表面上的适当HLA分子结合并刺激相关T细胞亚群而触发T辅助细胞水平的早期事件。这些事件导致T细胞增殖，淋巴因子分泌，局部炎症反应，附加免疫细胞向该部位的募集，和激活B细胞级联反应，导致产生抗体。这些抗体的一种同种型lgE在过敏症状的发展中具有根本重要性，并且其产生在T辅助细胞水平上在事件级联早期受到分泌的淋巴因子的性质的影响。T细胞表位是T细胞受体识别的基本元件或最小单位，其中表位包含受体识别所必需的氨基酸残基，这些氨基酸残基在蛋白质的氨基酸序列中是连续的。
然而，在施用具有T细胞表位和氧化还原基序的肽时，认为会发生以下事件：
由与MHC-II类分子呈递的抗原来源性肽的同源相互作用而导致抗原(i)特异性T细胞的激活；
还原酶序列还原T细胞表面蛋白，如CD4分子，其第二结构域含有受限的二硫桥。这将信号转导到T细胞。在与氧化途径增加有关的一系列后果中，重要的事件是钙流入的增加和NF-kB转录因子向细胞核的易位。后者导致IFN-γ和颗粒酶的转录增加，使得细胞通过诱导细胞凋亡机制获得细胞溶解特性；细胞溶解性质通过涉及颗粒酶B分泌和Fas-FasL相互作用的机制影响呈递肽的细胞。由于细胞杀伤作用是通过凋亡途径获得的，因此溶细胞性细胞是比细胞毒性细胞更适合于这些细胞的术语。抗原呈递靶细胞的破坏防止了对位于相同抗原上的表位特异的其它T细胞的激活，或者对由相同抗原呈递细胞处理的无关抗原的激活；T细胞激活的另一个后果是通过细胞-细胞接触依赖性机制抑制旁观者T细胞的激活。在这种情况下，如果溶细胞性T细胞和旁观者T细胞非常接近，即在同一抗原呈递细胞的表面上被激活，则由不同抗原呈递细胞呈递的抗原激活的T细胞也被抑制。
通过上述引用的PCT申请WO2008/017517和本发明人出版物中公开的实验数据，证实了上述假定的作用机制。
本发明提供了在体内或体外产生抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞的方法，以及独立于此方法，基于特征表达数据区分溶细胞性CD4+T细胞与其它细胞群(如Foxp3+Tregs)的方法。
本发明描述了用于产生抗原特异性CD4+T细胞的体内方法。一个特定的实施方式涉及用于生产或分离CD4+T细胞的方法，其用本文所述的本发明的肽免疫动物(包括人类)，然后从免疫的动物中分离CD4+T细胞。本发明描述了用于产生针对APC的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞的体外方法。本发明提供了产生针对APC的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞的方法。
在一个实施方式中，提供了这样的方法，其包含：分离外周血细胞，体外通过根据本发明的免疫原性肽刺激细胞群，和特别是在IL-2存在下，扩增所刺激的细胞群。根据本发明的方法具有产生大量CD4+T细胞的优点，并且可以产生对抗原蛋白特异的CD4+T细胞(通过使用包含抗原特异性表位的肽)。
在替代的实施方式中，可以在体内产生CD4+T细胞，即通过向受试者注射本文所述的免疫原性肽，以及收集体内产生的溶细胞性CD4+T细胞。
通过本发明的方法可获得的针对APC的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞特别有用于向哺乳动物施用以用于免疫疗法、预防过敏反应和治疗自身免疫性疾病。设想了同种异体和自体细胞的使用。
如下文所述获得溶细胞性CD4+T细胞群。
如本文所述的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞可用作药物，更特别地用于过继性细胞疗法，更特别地用于治疗急性过敏反应和自身免疫性疾病(如多发性硬化症)的复发。分离的溶细胞性CD4+T细胞或细胞群，更特别是抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞群，用于制造用于预防或治疗免疫紊乱的药物。公开了通过使用分离的或产生的溶细胞性CD4+T细胞进行治疗的方法。
如在WO2008/017517中所解释的，基于细胞的表达特征，可以将针对APC的溶细胞性CD4+T细胞与天然Treg细胞区分开。更具体地，与天然Treg细胞群相比，溶细胞性CD4+T细胞群表现出一种或多种以下特征：
激活后表面标志物的表达增加，所述表面标记物包括CD103、CTLA-4、Fasl和ICOS；
中间表达CD25；
表达CD4、ICOS、CTLA-4、GITR，并且低表达或不表达CD127(IL7-R)，不表达CD27；
表达转录因子T-bet和egr-2(Krox-20)，但不表达转录抑制因子Foxp3；
高产IFN-γ并且不产或仅产微量的IL-10、IL-4、IL-5、IL-13或TGF-β。
此外，溶细胞性T细胞表达CD45RO和/或CD45RA，不表达CCR7、CD27并且呈递高水平的颗粒酶B和其它颗粒酶以及Fas配体。
本发明的肽在向活动物(通常是人)给药后，会引发特异性T细胞对旁观者T细胞发挥抑制活性。
在具体的实施方式中，本发明的溶细胞性细胞群的特征在于表达FasL和/或干扰素γ。在具体的实施方式中，本发明的溶细胞性细胞群的特征还在于表达颗粒酶B。
该机制还暗示并且实验结果显示本发明的肽，尽管包含某种抗原的特异性T细胞表位，但可用于预防或治疗由针对相同抗原的其它T细胞表位的免疫反应引起的紊乱，或在某些情况下，甚至用于治疗由针对其它不同抗原的其它T细胞表位的免疫反应引起的紊乱，如果其它不同抗原会通过由本发明的肽激活的T细胞附近的MHC II类分子经由相同的机制呈递。
公开了具有上述特征的细胞类型的分离细胞群，其除了是抗原特异性之外，即还能够抑制抗原特异性免疫应答。
本发明提供了包含一种或多种根据本发明的肽的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体。如上所述，本发明还涉及用作药物的组合物，或者涉及通过使用所述组合物治疗哺乳动物免疫紊乱的方法，并且涉及该组合物用于制造用于预防或治疗免疫紊乱的药物的用途。例如，药物组合物可以是适于治疗或预防免疫紊乱(特别是空气传播和食源性过敏)以及过敏源性疾病的疫苗。作为本文进一步描述的药物组合物的实例，根据本发明的肽吸附在适于施用于哺乳动物的佐剂上，例如氢氧化铝(明矾)。通常，通过皮下途径，间隔2周，3次注射50μg吸附在明矾上的肽。对于本领域技术人员显而易见的是，其它给药途径是可能的，包括口服、鼻内或肌内。而且，注射次数和注射量可根据待治疗的病况而变化。此外，可以使用除明矾之外的其它佐剂，前提条件是它们促进MHC-II类呈递和T细胞活化中的肽呈递。因此，尽管活性成分可以单独给药，但它们通常作为药物配方提供。本发明的兽医用和人用的配方包含至少一种如上所述的活性成分以及一种或多种药学上可接受的载体。本发明涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的载体混合的一种或多种根据本发明的肽作为活性成分。本发明的药物组合物应包含治疗有效量的活性成分，如下文关于治疗或预防方法所示。任选地，组合物还包含其它治疗成分。合适的其它治疗成分以及它们通常的剂量，取决于它们所属的类别，是本领域技术人员公知的，并且可以从用于治疗免疫病症的其它已知药物中选择。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指与活性成分配制的任何材料或物质，用以促进活性成分应用或传播到待治疗的部位，例如通过溶解、分散或扩散所述组合物，和/或用以协助其储存、运输或处理而不损害其有效性。它们包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣料、抗菌和抗真菌剂(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等渗剂(例如糖或氯化钠)等。可以包括附加成分以控制组合物中免疫原性肽的作用持续时间。药学上可接受的载体可以是固体或液体或已被压缩以形成液体的气体，即本发明的组合物可适合用作浓缩物、乳液、溶液、颗粒、粉剂、喷雾剂、气溶胶、悬浮液、软膏、乳膏、片剂、丸剂或粉末。用于药物组合物及其配方的合适的药物载体是本领域技术人员公知的，并且在本发明中对它们的选择没有特别限制。它们还可以包括添加剂，例如润湿剂、分散剂、粘着剂、粘合剂、乳化剂、溶剂、包衣料、抗菌剂和抗真菌剂(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等渗剂(例如糖或氯化钠)等，前提条件是它们符合药学实践，即不会对哺乳动物造成永久性损害的载体和添加剂。本发明的药物组合物可以以任何已知的方式制备，例如在一步或多步骤程序中通过将活性成分与选定的载体材料和(在适合的情况下)其它添加剂如表面活性剂一起均匀混合、涂覆和/或研磨。它们也可以通过微粉化来制备，例如以获得通常具有约1至10μm直径的微球形式，即用于制造用于控制或持续释放活性成分的微胶囊。
待用于本发明药物组合物的合适的表面活性剂，也称为利泄剂或乳化剂，是具有良好乳化、分散和/或润湿性质的非离子、阳离子和/或阴离子材料。合适的阴离子表面活性剂包括水溶性皂和水溶性合成表面活性剂。合适的皂是高级脂肪酸(C10-C22)的碱金属或碱土金属盐、未取代的或取代的铵盐，例如油酸或硬脂酸的钠盐或钾盐，或从椰子油或牛油中可获得的天然脂肪酸混合物的钠盐或钾盐。合成表面活性剂包括聚丙烯酸的钠盐或钙盐；脂肪磺酸盐和硫酸盐；磺化苯并咪唑衍生物和烷基芳基磺酸盐。脂肪磺酸盐或硫酸盐通常的形式为碱金属或碱土金属盐、未取代的铵盐或被具有8至22个碳原子的烷基或酰基基团取代的铵盐，例如木质素磺酸或十二烷基磺酸的钠盐或钙盐或者从天然脂肪酸中获得的脂肪醇硫酸盐的混合物，硫酸或磺酸酯的碱金属或碱土金属盐(如十二烷基硫酸钠)以及脂肪醇/环氧乙烷加合物的磺酸的碱金属或碱土金属盐。合适的磺化苯并咪唑衍生物通常含有8至22个碳原子。烷基芳基磺酸盐的实例是十二烷基苯磺酸或二丁基萘磺酸或萘磺酸/甲醛缩合产物的钠、钙或烷醇胺盐(alcanolamine salt)。还合适的是相应的磷酸盐，例如磷酸酯的盐，以及对壬基苯酚与环氧乙烷和/或环氧丙烷的加合物，或磷脂。用于此目的的合适的磷脂是天然的(源自动物或植物细胞)或合成的脑磷脂或卵磷脂型磷脂，诸如例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、溶血卵磷脂、心磷脂、二辛基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱及其混合物。
合适的非离子表面活性剂包括分子中含有至少12个碳原子的烷基酚、脂肪醇、脂肪酸、脂族胺或酰胺的聚乙氧基化和聚丙氧基化的衍生物，烷基芳烃磺酸酯和二烷基磺基琥珀酸酯，例如脂族和脂环族醇、饱和以及不饱和脂肪酸和烷基酚的聚乙二醇醚衍生物，所述衍生物通常在(脂族)烃部分含有3至10个二醇醚基团和8至20个碳原子，并且在烷基酚的烷基部分含有6至18个碳原子。其它合适的非离子表面活性剂是聚环氧乙烷与聚丙二醇、烷基链中含1至10个碳原子的乙二氨基-聚丙二醇的水溶性加合物，该加合物含有20至250个乙二醇醚基团和/或10至100个丙二醇醚基团。这些化合物通常每丙二醇单元含有1至5个乙二醇单元。非离子表面活性剂的代表性实例是壬基酚-聚乙氧基乙醇、蓖麻油聚乙二醇醚、聚丙烯/聚环氧乙烷加合物、三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。聚乙烯脱水山梨糖醇(如聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯)、甘油、脱水山梨糖醇、蔗糖和季戊四醇的脂肪酸酯也是合适的非离子表面活性剂。合适的阳离子表面活性剂包括具有4个任选被卤素、苯基、取代的苯基或羟基取代的烃基的季铵盐，特别是卤化物；例如，含有至少一个C8C22烷基(例如十六烷基、月桂基、棕榈基、肉豆蔻基、油烯基等)作为N-取代基并且含有未取代的或卤代的低级烷基、苄基和/或羟基-低级烷基作为进一步的取代基的季铵盐。
适用于此目的的表面活性剂的更详细描述可以在例如“McCutcheon的洗涤剂和乳化剂年刊(McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual)”(MC PublishingCrop.,Ridgewood,New Jersey,1981)、“Tensid-Taschenbucw',2d ed.(Hanser Verlag,Vienna,1981)和“表面活性剂百科全书(Encyclopaedia of Surfactants),(ChemicalPublishing Co.,New York,1981)中找到。根据本发明的肽、其同源物或衍生物(及其生理学上可接受的盐或药物组合物，均包括在术语“活性成分”中)可以通过适合于待治疗的病状并且适合于待施用的化合物(此处为蛋白质和片段)的任何途径施用。可能的途径包括区域性、全身性、口服(固体形式或吸入)、直肠、鼻腔、局部(包括眼、颊和舌下)、***和肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)。优选的施用途径可以根据例如接受者的状况或待治疗的疾病而变化。如本文所述，在与配方的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体最佳地是“可接受的”。配方包括适合口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、***或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)施用的那些配方。
适用于肠胃外给药的配方包括含水和非水无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，使配方与预期接受者的血液等渗；以及含水或非水无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。配方可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在即将使用之前，仅需要添加无菌液体载体，例如注射用水。即席注射溶液和悬浮液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
典型的单位剂量配方是含有每日剂量或单位每日亚剂量(如上文所述或其适当的部分)活性成分的那些。应当理解的是，除了上面特别提到的成分之外，本发明的配方可以包括关于所讨论的配方类型的本领域常规的其它试剂，例如，适合口服施用的那些可包括调味剂。根据本发明的肽、其同源物或衍生物可以用来提供控释药物配方(“控释配方”)，其含有作为活性成分的一种或多种本发明的化合物，其中活性成分的释放可以被控制并且调节以允许较低频率给药或改善给定的本发明化合物的药代动力学或毒性曲线。可以根据常规方法来制备适于口服施用的控释配方，其中离散单元包含一种或多种本发明的化合物。可以包括附加成分以控制组合物中活性成分的作用持续时间。因此，可通过选择合适的聚合物载体来实现控释组合物，所述聚合物载体例如为聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白等。还可以通过将活性成分掺入到聚合物质(如水凝胶、聚乳酸、羟甲基纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯和其它上述聚合物)的颗粒(例如微胶囊)中，来控制药物释放速率和作用持续时间。这些方法包括胶体药物传递系统如脂质体、微球、微乳液、纳米粒子、纳米胶囊等。取决于施用途径，药物组合物可能需要保护性包衣。适于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于其临时制备的无菌粉末。因此，用于此目的的典型载体包括生物相容的水性缓冲液、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇等及其混合物。鉴于当组合使用多种活性成分时，它们不一定在待治疗的哺乳动物中同时直接发挥其联合治疗效果，相应的组合物也可以是医药试剂盒或包装的形式，其中两种成分被包含在分开但相邻的储存库或隔室中。在后一种情况下，每种活性成分因此可以以适合于不同于其它成分的施用途径的方式配制，例如其中一种可以是口服或肠胃外配方的形式，而另一种可以是用于静脉注射的安瓿形式或气雾剂形式。
如体外和体内所证实的，本发明中获得的溶细胞性CD4+T细胞在MHC-II类依赖性同源激活后诱导APC凋亡，影响树突细胞和B细胞，并且(2)在不存在IL-10和/或TGF-β的情况下通过接触依赖性机制抑制旁观者T细胞。如WO2008/017517中详细讨论的，溶细胞性CD4+T细胞可以与天然和适应性Treg区分开。
现在将通过以下实施例说明本发明，提供所述实施例没有任何限制意图。此外，本文描述的所有参考文献通过引用明确包括在本文中。
实施例
实施例1：肽设计
与WO2016059236中公开的肽相比，合成了包含胰岛素的C结构域的T细胞表位的肽，其中已经除去了胰岛素序列中不存在的VR二肽序列，如下面描述的比对所示：
P17 001：HCPYC VR SLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:25]
P17 003：HCPYC—SLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:26]
因此，P17 003肽含有CxxC[SEQ ID NO:18]基序，其前面是His，其中xx是Pro和Tyr。9个氨基酸的T细胞表位具有序列LALEGSLQK[SEQ ID NO:3]并且通过4个氨基酸SLQP的接头与CxxC[SEQ ID NO:18]基序分开。RG二肽是表位的c末端侧翼序列。在该肽中，序列SLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO:20]与胰岛素中发生的序列具有100％的同一性。
实施例2：评估肽还原活性的方法
使用Tomazzolli et al.(2006)Anal.Biochem.350,105-112中描述的荧光测定肽的还原酶活性。当两个具有FITC标记的肽在通过二硫桥彼此共价连接时变成自猝灭。在通过根据本发明的肽还原后，还原的单个肽再次变为发荧光。
用二硫苏糖醇(100％还原活性)和水(100％还原活性)进行对照实验。
肽P17 001显示出68％的还原活性，而肽P17 003显示出65％的还原活性。
实施例3：溶细胞性CD4+T细胞系的干扰素γ释放
干扰素γ是表征溶细胞性CD4+T细胞的重要标志物。
通过用肽p17-001引发和刺激来自T1D患者(T1D07)的幼稚CD4+T细胞获得特异性CD4+T细胞系。在12次刺激后，将细胞与加载(2μM)的肽p17-001或p17-003的自体LCL B细胞共培养。24小时后，收集上清液并通过多重测定法测量IFN-γ(参见下表1)。
表1
刺激物1
IFN-γ(pg/ml)
p17 UL
2.35±1.2
p17 001
11.1±0.8
p17 003
29.7±14.1
两种肽之间的IFN-γ产生存在显著差异(与p17 001相比，用p17 003刺激后产生为约3倍多的IFN-γ)。
实施例4：溶细胞性CD4+T细胞系的FasL释放
将用如上实施例3中所述的p17 001最初产生的T细胞系分开，并使用自体LCL B细胞系作为APC，用肽P17 003或P17 001在4次连续体外刺激中进行刺激。在每次刺激的第11天(总共4次)，在再刺激后用自体B细胞呈递的相应肽测试细胞的FasL。在共培养24小时(刺激1和2)或72小时(刺激3和4)后收集上清液。
表2来自T1D患者的CD4+T细胞系的FasL表达
对于四个刺激中的每一个，P17-003的FasL(也称为sFasL)表达显著更高。
这说明与P17-001肽相比，P17-003肽产生溶细胞性T细胞的能力更强。
实施例5：T1D患者PBMC中sFasL的释放和细胞因子产生。
在体外用P17001肽或P17003肽刺激来自T1D患者T1D018的PBMC。这两个群体在抗原活化后特异性地释放Il-5。在用肽进行6次刺激循环后，用细胞因子捕获珠富集两种细胞系中产生IL-5的细胞。将白细胞介素-5阴性细胞的两个群用作对照。
然后，在用它们的同源肽(P17-001或P17-003)刺激后，测试这四个群的sFasL、颗粒酶B和细胞因子的特异性释放。培养24小时后收集上清液，通过ELISA测量sFasL和颗粒酶B(sFasL：Diaclone 851730010；颗粒酶B：eBioscience BMS2027)并且通过MACSplex细胞因子12试剂盒(Miltenyi,130-099-169)测量细胞因子。
5.1.sFasL生产
四种细胞系的sFasL水平如图1所示。这显示，与阴性部分(开放直方图)相比，富含对肽p17-003或p17-001特异的特异性细胞的IL5阳性部分(黑色直方图)释放了更多sFasL，指示了有效的特异性细胞纯化。
此外，结果表明，与通过肽p17-001产生的细胞相比，用p17-003体外刺激产生的细胞特异性释放显著地为4.5倍多的sFasL(p<0.0001)。
5.2.颗粒酶B生产
测试富含对肽p17-003或p17-001特异的特异性细胞的IL5阳性部分，与IL5阴性部分相比，释放了更多的颗粒酶B，其作为有效特异性细胞纯化的量度。
此外，将测试与通过肽p17-001产生的细胞相比，用p17-003体外刺激产生的细胞特异性增加的颗粒酶B的释放。
5.3.细胞因子释放
为了确定来自T1D供体的体外培养细胞是否对肽P17001或P17003具有特异性，使用MACSplex细胞因子12试剂盒(Miltenyi,130-099-169)研究了细胞因子的释放，细胞因子是肽刺激后细胞活化的标志。在T1D供体PBMC在不存在或存在肽的情况下培养24小时后，收集上清液。测定生物学重复的细胞因子浓度并以pg/mL显示。在刺激10(休息日)结束时进行特异性测试。结果表示为在没有和有肽的条件下每种细胞因子的浓度差。
图2显示，与细胞系P17003 IL5阴性、P17001 IL5阴性和P17001 IL5阳性相比，P17003细胞系的IL5阳性部分特异性地响应刺激。这说明与P17001相比，肽P17003在引发肽特异性细胞方面更有效。
总之，与用P17-001产生的细胞相比，P17-003重新产生的细胞在释放溶解分子(如sFasL和潜在颗粒酶B)和细胞因子方面更有效。因此，肽导致CD4+细胞群对呈递胰岛素表位的APC具有优异的细胞溶解性质。
实施例6：临床试验
在给药之前，用含有佐剂的稀释剂重构本发明的肽。产品应临时重建，优选在重构后不到3小时内使用。
可以配制研究药物产品，使得在稀释剂中重构后，小瓶中肽的浓度为250μg/ml。将取出适量体积以符合临床试验方案。例如：
-低剂量(组1)可以包含SC施用50μg肽，分两次注射，每次25μg(每次100μL)，随后三个连续注射25μg肽，每个分两次注射，每次12.5μg(每次50μL)。
-中剂量(组2)可以包含SC施用150μg肽，分两次注射，每次75μg(每次300μL)，随后三个连续施用75μg肽，每个分两次注射，每次37.5μg(每次150μL)。
-高剂量(组3)可以包含SC施用450μg肽，分两次注射，每次225μg(每次900μL)，随后三个连续施用225μg肽，每个分两次注射，每次112.5μg(每次450μL)。
根据本发明的研究产品优选地皮下(SC)注射在上臂的外侧部分在肘部和肩部之间中间的区域内。当需要两次单独的注射时，它们优选同时在两臂中给药：例如，注射1在右臂且注射2在左臂。
序列表
<110> 易姆赛斯股份公司（ImCyse S.A.）
卢克·范德·埃尔斯特（Vander Elst, Luc）
文森特·卡利尔（Carlier, Vincent）
<120> 用于治疗糖尿病的肽及方法
<130> IMCY-006-PCT
<150> 17160085.1
<151> 2017-03-09
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
<400> 1
Cys Xaa Xaa Xaa
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Cys
1
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素表位
<400> 3
Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序 + 胰岛素表位
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
<400> 4
Cys Xaa Xaa Xaa Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln
1 5 10 15
Lys
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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Xaa Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln
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Lys
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<213> 人工序列
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<223> 氧化还原基序 + 胰岛素表位
<220>
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Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 氧化还原基序 + T细胞表位
<220>
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<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
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His Cys Xaa Xaa Xaa Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1 5 10 15
Gln Lys
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<212> PRT
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<220>
<223> 氧化还原基序 + T细胞表位
<220>
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<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
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His Xaa Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
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Gln Lys
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<211> 18
<212> PRT
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<223> Xaa可以是任何氨基酸
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His Cys Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
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Gln Lys
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<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
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Cys Xaa Xaa Xaa Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
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Arg Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
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<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
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Xaa Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln
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Lys Arg Gly
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序 + 胰岛素T细胞表位
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
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Cys Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln
1 5 10 15
Lys Arg Gly
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序 + 胰岛素T细胞表位
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
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Gln Lys Arg Gly
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序 + 胰岛素T细胞表位
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 14
His Xaa Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1 5 10 15
Gln Lys Arg Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 氧化还原基序 + 胰岛素T细胞表位
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 15
His Cys Xaa Xaa Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
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Gln Lys Arg Gly
20
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
<400> 16
Cys Pro Tyr Xaa
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys, Ser或Thr
<400> 17
Xaa Pro Tyr Cys
1
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 18
Cys Xaa Xaa Cys
1
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<400> 19
Cys Pro Tyr Cys
1
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含胰岛素T细胞表位的肽
<400> 20
Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly
1 5 10 15
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 21
Ser Xaa Xaa Cys
1
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 22
Thr Xaa Xaa Cys
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> CXXS
<400> 23
Cys Xaa Xaa Ser
1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 24
Cys Xaa Xaa Thr
1
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有氧化还原基序和胰岛素T细胞表位的肽
<400> 25
His Cys Pro Tyr Cys Val Arg Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gln Lys Arg Gly
20
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有氧化还原基序和胰岛素T细胞表位的肽
<400> 26
His Cys Pro Tyr Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
1 5 10 15
Gln Lys Arg Gly
20