对胰岛素受体具有降低的结合力的胰岛素类似物及其用途
阅读说明：本技术 对胰岛素受体具有降低的结合力的胰岛素类似物及其用途 (insulin analogs having reduced binding to insulin receptor and uses thereof ) 是由 崔仁荣 郑圣烨 M·寇恩 S·居斯雷根 N·特纳格尔斯 于 2017-09-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种新型胰岛素类似物、其用途以及制备该类似物的方法。(The present invention relates to a novel insulin analogue, its use and a method for preparing the analogue.)
[技术领域]
本发明涉及一种新型胰岛素类似物、其用途以及制备该类似物的方法。
[背景技术]
已知通过各种途径除去体内的蛋白质，这些途径包括在血液中由蛋白酶分解、通过肾脏***、通过受体来去除等。就此而言，已经进行了各种尝试以通过避免蛋白质清除机制增加生理蛋白质的半衰期来改进蛋白质的治疗效果。
一般来说，胰岛素是由人体胰腺分泌的激素，其调节血液葡萄糖水平，并具有维持正常血液葡萄糖水平的作用，同时将血液中的多余葡萄糖携带至细胞以便为细胞提供能量。然而，在糖尿病患者中，胰岛素由于缺乏胰岛素、胰岛素抵抗和β细胞功能丧失而无法正常发挥作用，因此血液中的葡萄糖不能用作能量来源并且血液葡萄糖水平升高，导致高血糖症。因此，糖尿病患者不能将血液中的葡萄糖用作能量来源，但是表现出高血糖的症状(具有高的葡萄糖水平)并且在尿液中排出葡萄糖，这成为各种并发症的原因。因此，胰岛素疗法对于具有异常胰岛素分泌(I型)或胰岛素抵抗(II型)的患者是必需的，并且血液葡萄糖水平可以通过胰岛素给药正常调节。
然而，与其他蛋白质和肽激素一样，胰岛素具有非常短的体内半衰期，因此具有重复给药的缺点。这种频繁的给药会给患者带来严重的疼痛和不适，因此需要从患者的依从性、安全性和便利性方面改进给药。
因此，研究集中于开发各种蛋白质制剂、化学缀合物(例如脂肪酸缀合物)等，以通过增加这些蛋白质药物如胰岛素的体内半衰期降低给药频率来改善治疗效果以及患者的生活质量。
根据先前的报告，在肾脏中除去了50％或更多的胰岛素，而其余的胰岛素通过在靶位点(如肌肉、脂肪、肝脏等)中由受体介导的清除(RMC)过程去除。
就此而言，有报道(J Pharmacol Exp Ther(1998)286:959、Diabetes Care(1990)13:923以及Diabetes(1990)39:1033等)称体外活性降低以避免胰岛素的RMC，从而增加血液中的胰岛素水平。然而，在J Pharmacol Exp Ther(1998)286:959、Diabetes Care(1990)13:923中，其中提出的胰岛素类似物具有至少两个氨基酸的取代或者没有提供特定结果，而在Diabetes(1990)39:1033中，胰岛素类似物显示其对受体的结合亲和力没有变化，或者通过取代直接参与和胰岛素受体结合的氨基酸降低了胰岛素类似物的活性。
诸位发明人开发了这样的类似物，其通过取代不直接参与和胰岛素受体结合的氨基酸可仅降低对胰岛素受体的结合亲和力；并证实它们降低了对胰岛素受体的结合亲和力，从而完成了本发明。
[
发明内容
][技术问题]
本发明的一个目的是提供一种新型胰岛素类似物。
本发明的另一个目的是提供一种编码该胰岛素类似物的分离的核酸、一种包含该核酸的重组表达载体、以及一种包含该表达载体的转化体。
本发明的再另一个目的是提供一种制备该胰岛素类似物的方法。
本发明的再另一个目的是提供一种包含该胰岛素类似物作为活性成分的组合物，例如药物组合物。
本发明的再另一个目的是提供一种用于治疗胰岛素相关疾病(例如糖尿病)的药物组合物，其包含胰岛素类似物作为活性成分。
本发明的再另一个目的是提供一种治疗糖尿病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予该胰岛素类似物或包含该胰岛素类似物作为活性成分的药物组合物。
本发明的再另一个目的是提供该胰岛素类似物在制备药物中的用途。
本发明的再另一个目的是提供胰岛素类似物在治疗胰岛素相关疾病、特别是糖尿病中的用途。
[技术方案]
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了胰岛素类似物，并且特别是如下胰岛素类似物，其包含选自以下的一个或多个氨基酸中的至少一个修饰：天然胰岛素的B链的第16个氨基酸、B链的第25个氨基酸、A链的第14个氨基酸、以及A链的第19个氨基酸。
在示例性实施方案中，该修饰可以是将天然胰岛素的B链的第16个氨基酸(即酪氨酸)修饰成谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸；将天然胰岛素的B链的第25个氨基酸(即苯丙氨酸)修饰成天冬氨酸或谷氨酸；将天然胰岛素的A链的第14个氨基酸(即酪氨酸)修饰成组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；或将天然胰岛素的A链的第19个氨基酸(即酪氨酸)修饰成谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
在另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其包括由以下通式1表示的SEQ ID NO:55的A链和由以下通式2表示的SEQ ID NO:56的B链的所有组合，排除天然胰岛素，即排除其中A链与SEQ ID NO:53一致而B链也与SEQ ID NO:54一致的肽。
[通式1]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(SEQ ID NO:55)
在通式1中，
Xaa1是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，
Xaa5是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或天冬酰胺，
Xaa12是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸或天冬酰胺，
Xaa14是酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，
Xaa16是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，
Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸，并且
Xaa21是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸或丙氨酸。
[通式2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(SEQ ID NO:56)
在通式2中，
Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸，
Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，
Xaa27是苏氨酸，或者不存在，并且
Xaa28是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或者不存在。
在再另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其包括由以上通式1表示的SEQ ID NO:55的A链和SEQ ID NO:54的B链。
在再另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其包括SEQ ID NO:53的A链和由以上通式2表示的SEQ ID NO:56的B链。
在再另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其中：
在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且
在通式2中，Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸。
在再另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其中：
在通式1中，
Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸、谷氨酸或丝氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且
在通式2中，
Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸或天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸。
在再另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其中：
(1)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是组氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，Xaa28是脯氨酸；
(2)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是赖氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(3)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是谷氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且，在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(4)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是丝氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(5)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是苏氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(6)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是谷氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(7)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是丝氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(8)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且，在通式2中，Xaa16是苏氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(9)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是丙氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(10)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(11)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(12)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是天冬氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；并且
(13)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸。
在再另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其包含选自SEQ ID NO:28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50和52的氨基酸序列。
在再另一方面，本发明提供了编码该胰岛素类似物的分离的核酸。
在再另一方面，本发明提供了包含该核酸的重组表达载体。
在再另一方面，本发明提供了包含该重组表达载体的转化体。
在示例性实施方案中，该转化体可以是大肠杆菌。
在再另一方面，本发明提供了一种制备该胰岛素类似物的方法，其包括：
a)通过培养包含编码胰岛素类似物的核酸的转化体来表达胰岛素类似物；并且
b)对表达的胰岛素类似物进行分离和纯化。
在示例性实施方案中，该分离和纯化可包括：
b-1)从步骤a)中的培养物获得该转化体并对其进行粉碎；
b-2)从粉碎的细胞裂解物回收表达的胰岛素类似物，然后使该胰岛素类似物进行重折叠；
b-3)将重折叠的胰岛素类似物通过阳离子交换色谱法进行纯化；
b-4)将纯化的胰岛素类似物用胰蛋白酶和羧肽酶B进行处理；并且
b-5)依次将经处理的胰岛素类似物通过阳离子交换色谱法、和阴离子交换色谱法或反相色谱法进行纯化。
在再另一方面，本发明提供了包含胰岛素类似物作为活性成分的组合物，例如药物组合物。
在再另一方面，本发明提供了用于治疗胰岛素相关疾病(例如糖尿病)的药物组合物，其包含胰岛素类似物作为活性成分。
在再另一方面，本发明提供了治疗胰岛素相关疾病(例如糖尿病)的方法，其包括向有需要的受试者给予胰岛素类似物或包含该胰岛素类似物作为活性成分的药物组合物。
在再另一方面，本发明提供了胰岛素类似物在制备药物中的用途。
在一个实施方案中，该药物用于预防或治疗胰岛素相关疾病。
在另一个实施方案中，该药物用于预防或治疗糖尿病。
在再另一方面，本发明提供了胰岛素类似物在治疗胰岛素相关疾病、特别是糖尿病中的用途。
[本发明的有益效果]
本发明的非天然胰岛素类似物可改善需要胰岛素给药的患者的依从性。
[附图说明]
图1示出蛋白质电泳对胰岛素类似物纯度的分析结果，具体地为代表性胰岛素类似物9、10、11和12的结果(泳道1：大小标记物；泳道2：天然胰岛素；泳道3：胰岛素类似物9；泳道4：胰岛素类似物10；泳道5：胰岛素类似物11；和泳道6：胰岛素类似物12)。
图2a至2d示出高压色谱法对胰岛素类似物纯度的分析结果，并且具体地为代表性胰岛素类似物9、10、11和12的结果。在每个图中，RP-HPLC(C18)、RP-HPLC(C4)和SE-HPLC的结果按照从上到下的顺序显示。
图3示出证实人胰岛素和胰岛素类似物10的葡萄糖摄取能力的实验结果。
图4示出证实人胰岛素和胰岛素类似物10的细胞稳定性的实验结果。
[
具体实施方式
]
在下文中，将详细描述本发明的示例性实施方案。
同时，这里公开的每个解释和示例性实施方案可以应用于其他解释和示例性实施方案。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应受下文提供的具体公开内容的限制。
另外，本领域技术人员将能够基于常规实验识别或确认本申请中描述的本发明的具体实施方案的许多等同物，并且这样的等同物旨在包括于本发明中。
在整个说明书中，使用了氨基酸的常规单字母和3字母代码。另外，本文以缩写提及的氨基酸是根据IUPAC-IUB规则进行描述。
本发明的一个方面提供了新型胰岛素类似物，并且特别是如下胰岛素类似物，其包含选自以下的一个或多个氨基酸中的至少一个修饰：天然胰岛素的B链的第16个氨基酸、B链的第25个氨基酸、A链的第14个氨基酸、以及A链的第19个氨基酸。
如本文所用，术语“胰岛素类似物”是指与天然胰岛素不同的非天然胰岛素。
胰岛素类似物包括与天然人胰岛素不同的非天然人胰岛素。这种胰岛素类似物包括其中通过添加、缺失或取代来修饰天然胰岛素氨基酸的一部分的类似物。
具体地，本发明的胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，将其序列特征与天然胰岛素序列的相比具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％的序列同一性。另外，本发明的胰岛素类似物可以是具有与天然胰岛素相比具有降低的受体结合亲和力、同时具有上述序列同一性的胰岛素类似物。另外，胰岛素类似物可具有如天然胰岛素的葡萄糖摄取能力和/或具有降低体内血液葡萄糖水平的能力。
更具体地，与天然胰岛素对胰岛素受体的结合亲和力(100％)相比，本发明的胰岛素类似物可以展现出对胰岛素受体约99％或更低、约95％或更低、约90％或更低、约85％或更低、约80％或更低、约75％或更低、约70％或更低、约65％或更低、约60％或更低、约55％或更低、约50％或更低、约45％或更低、约40％或更低、约35％或更低、约30％或更低、约25％或更低、约20％或更低、约15％或更低、约10％或更低、约9％或更低、约8％或更低、约7％或更低、约6％或更低、约5％或更低、约4％或更低、约3％或更低、约2％或更低、约1％或更低、或约0.1％或更低的结合亲和力(但本发明的胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力不是对应于0％)。
可以通过临近闪烁测定(SPA)评估胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力，该测定利用胰岛素类似物与I125标记的胰岛素在过表达重组人胰岛素受体的细胞膜中的竞争反应。此方法还可用于评估胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力。作为该方法的示例性实施方案，可以使用实施例8中使用的方法。
如本文所用，术语“约”是指包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范围，并且术语“约”包括与该术语后面的数值相等或在该范围内与该术语后面的数值相似的任何数值，但不限于此。
另外，本发明的胰岛素类似物可具有如天然胰岛素的葡萄糖摄取能力。
具体地，与天然胰岛素的葡萄糖摄取能力(100％)相比，本发明的胰岛素类似物可以是具有约10％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约100％或更高、约110％或更高、约120％或更高、约130％或更高、约140％或更高、约150％或更高、约160％或更高、约170％或更高、约180％或更高、约190％或更高、或约200％或更高的葡萄糖摄取能力的胰岛素类似物。
葡萄糖摄取能力的测量可以通过本领域已知的用于测量葡萄糖摄取能力的各种方法来实现，并且例如，可以通过用于测量实施例9中描述的葡萄糖摄取能力的方法来实现，但是测量方法不限于此。
具体地，有待用于本发明的胰岛素类似物可以处于单一多肽链或两条多肽链的形式，更优选两条多肽链的形式，但胰岛素类似物不特别限于此。
两条多肽链形式的胰岛素类似物可以由两种多肽即对应于天然胰岛素的A链的多肽和对应于天然胰岛素的B链的多肽构成。具体而言，对应于天然胰岛素的A链或B链可以指如下情况：其中两条多肽链中的任何一条多肽链与天然胰岛素的A链或B链相比具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％的序列同一性，但不特别限于此，并且本领域技术人员通过在构成两条多肽链的序列与天然胰岛素的A链或B链的序列之间进行比较可易于确定所述序列同一性。
天然胰岛素是由胰腺分泌的激素，并且通常具有促进细胞内葡萄糖吸收和抑制脂肪分解的作用，从而控制体内血液葡萄糖水平。可以控制血液葡萄糖水平的胰岛素是通过加工其前体胰岛素原产生的，胰岛素原不具有控制血液葡萄糖水平的功能。胰岛素由两条多肽链即A链和B链构成，它们分别包括21和30个氨基酸，并且经两个二硫键相互连接。A链和B链中的每一个可包括由下文所示的SEQ ID NO:53和54表示的氨基酸序列。
A链：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO:53)
B链：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO:54)
在示例性实施方案中，本发明中描述的胰岛素类似物可为对受体具有降低的结合亲和力、同时具有像天然胰岛素那样控制体内血液葡萄糖水平的功能的那些。更具体地，胰岛素类似物可具有降低体内血液葡萄糖水平的能力。
另外，在示例性实施方案中，胰岛素类似物的种类和大小可以不受特别限制，只要它们可以展现出减少的由受体介导的内化或由受体介导的清除即可。因此，与天然胰岛素相比，本发明的胰岛素类似物可以在血液中展现出改进的半衰期。本发明的胰岛素类似物包括反向胰岛素、天然胰岛素的衍生物、天然胰岛素的片段等。胰岛素类似物不仅可以通过重组方法制备，还可以通过固相合成制备，并且制备方法不限于此。
如本文所用，术语“天然胰岛素的衍生物”是指与天然胰岛素相比在氨基酸序列中具有至少一个差异的肽、通过修饰天然胰岛素序列制备的肽、以及可以像天然胰岛素那样控制体内血液葡萄糖水平的天然胰岛素模拟物。此类天然胰岛素的衍生物可以是具有控制体内血液葡萄糖水平的功能的那些。
具体地，天然胰岛素的衍生物可以通过在天然胰岛素氨基酸的一部分中进行取代、添加、缺失和修饰的任何一种方法或这些方法的组合来制备。
具体地，天然胰岛素的衍生物可以与天然胰岛素的A链和B链的各氨基酸序列具有80％或更高的同源性，和/或氨基酸残基中的一部分基团可以通过化学取代(例如α-甲基化、α-羟基化)、缺失(例如脱氨)或修饰(例如N-甲基化)等(但不限于此)进行修饰。
用于本发明的天然胰岛素的衍生物可以通过用于制备衍生物的各种方法的组合来制备。
另外，用于制备天然胰岛素的衍生物的这种修饰包括使用一个或多个L型或D型氨基酸和/或一个或多个非天然氨基酸的修饰；和/或天然序列的修饰或翻译后修饰(例如甲基化、酰化、泛素化、分子间共价键等)。
另外，包括其中将一个或多个氨基酸添加到天然胰岛素的氨基和/或羧基末端的那些胰岛素。
对于一个或多个氨基酸的取代或***，不仅可以使用人蛋白质中常规观察到的20种氨基酸，而且可以使用非典型或非天然氨基酸。非典型氨基酸的商业来源可包括Sigma-Aldrich、ChemPep、Genzyme pharmaceuticals公司等。包含这些氨基酸的肽和典型肽的序列可从商业肽合成公司(例如American Peptide Company、Bachem(美国)和Anygen(Korea)，但不特别限于此)合成或购买。
如本文所用，术语“天然胰岛素的片段或天然胰岛素的衍生物的片段”是指如下的胰岛素形式，其中除去了天然胰岛素或天然胰岛素衍生物的氨基末端或羧基末端处的至少一个氨基酸。这种胰岛素片段可具有控制体内血液葡萄糖水平的功能。
另外，本发明的胰岛素类似物可以是使用独立地或组合地制备天然胰岛素的衍生物和片段的一种或多种方法制备的那些。
具体地，根据本发明的胰岛素类似物可包括在上述天然胰岛素的A链和B链中具有修饰的那些，并且具体地是其中天然胰岛素的A链的一个或多个特定氨基酸残基被修饰和/或天然胰岛素的B链的一个或多个特定氨基酸残基被修饰的那些。
具体地，胰岛素类似物可以是其中选自以下的氨基酸中的至少一个修饰是被不同氨基酸取代的那些：天然胰岛素的B链的第16个氨基酸、B链的第25个氨基酸、A链的第14个氨基酸、以及A链的第19个氨基酸，并且具体地，这些氨基酸可以被谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸或丙氨酸取代，但不限于此。
具体地，胰岛素类似物可以是其中上述氨基酸中的至少一个、至少两个、至少三个或四个氨基酸被其他一个或多个氨基酸取代的那些。
具体地，该修饰可以是将胰岛素的B链的第16个氨基酸(即酪氨酸)修饰成谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸；将胰岛素的B链的第25个氨基酸(即苯丙氨酸)修饰成天冬氨酸或谷氨酸；将胰岛素的A链的第14个氨基酸(即酪氨酸)修饰成组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；或将胰岛素的A链的第19个氨基酸(即酪氨酸)修饰成谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
因此，胰岛素类似物可包括如下修饰：将天然胰岛素的B链的第16个氨基酸(即酪氨酸)修饰成谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸；和/或将天然胰岛素的B链的第25个氨基酸(即苯丙氨酸)修饰成天冬氨酸或谷氨酸；和/或将天然胰岛素的A链的第14个氨基酸(即酪氨酸)修饰成组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；和/或将天然胰岛素的A链的第19个氨基酸(即酪氨酸)修饰成谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸，但修饰不限于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是包括由下文通式1表示的SEQ ID NO:55的A链和由下文通式2表示的SEQ ID NO:56的B链的那些。这些胰岛素类似物可以是A链和B链通过二硫键相互连接的形式或胰岛素原的形式，但不限于此。
[通式1]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(SEQ ID NO:55)
在通式1中，
Xaa1是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，
Xaa5是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或天冬酰胺，
Xaa12是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸或天冬酰胺，
Xaa14是酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，
Xaa16是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，
Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸，并且
Xaa21是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸或丙氨酸。
[通式2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(SEQ ID NO:56)
在通式2中，
Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸，
Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，
Xaa27是苏氨酸，或者不存在，并且
Xaa28是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或者不存在。
本文中，可排除包括SEQ ID NO:53的A链和SEQ ID NO:54的B链的肽。
另外，与相应的胰岛素类似物(其包括上文通式1的A链和上文通式2的B链，同时包括上文所述的特征性修饰(即，不存在于天然胰岛素中的氨基酸残基)，具体为A链的第14个和/或第19个氨基酸和/或B链的第16个和/或第25个氨基酸)的序列具有70％或更高、特别是80％或更高、更特别是90％或更高、以及甚至更特别是95％或更高的同源性并且与天然胰岛素相比具有对受体降低的结合亲和力的那些肽也被包括在本发明的范围内。
如本文所用，术语“同源性”是指相对于野生型蛋白的氨基酸序列或对其编码的多核苷酸序列而言的相似度水平，并且包括与本发明的氨基酸序列或多核苷酸序列具有上述百分比或更高的序列或相同序列的序列。此同源性可通过肉眼比较来确定，或者可通过生物信息学算法确定，该算法通过排列两个序列来分析同源性程度。两个氨基酸序列之间的同源性可以按百分比指示。有用的自动算法可在威斯康辛遗传学软件包(GeneticsComputer Group，Madison，威斯康辛州，美国)的GAP、BESTFIT和FASTA以及TFASTA计算机软件模块上使用。自动阵列算法包括Needleman&Wunsch、Pearson&Lipman、和Smith&Waterman的序列阵列算法。算法和同源性的确定在软件中得以自动化，软件包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和CLUSTAL W。
在示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其包括由上文通式1表示的SEQ ID NO:55的A链和SEQ ID NO:54的B链；或包含SEQ ID NO:53的A链和由上述通式2表示的SEQ ID NO:56的B链的胰岛素类似物，但不特别限于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其中在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸，但不限于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其中在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸、谷氨酸或丝氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸或天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸，但不限于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其中在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸或天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸，但不限于此。
在示例性实施方案中，根据本发明的胰岛素类似物可以对应于以下胰岛素类似物：
(1)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是组氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(2)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是赖氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(3)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是谷氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(4)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是丝氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(5)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是苏氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(6)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是谷氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(7)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是丝氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(8)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是苏氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(9)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是丙氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(10)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(11)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；
(12)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是天冬氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸；并且
(13)在通式1中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，并且Xaa21是天冬酰胺；并且在通式2中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，并且Xaa28是脯氨酸。
另外，在示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是如下胰岛素类似物，其包含选自SEQ ID NO:28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50和52的氨基酸序列，但不限于此。
根据本发明的胰岛素类似物可以是包含上述特定序列的肽、(基本上)由上述特定序列组成的肽，但不限于此。
同时，尽管在本发明中将其描述为“由特定SEQ ID NO组成的肽或胰岛素类似物”，但它不排除在相应的SEQ ID NO的氨基酸序列的上游或下游添加任何无义序列或天然存在的突变或其沉默突变，只要该肽具有与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的肽或胰岛素类似物相同或等同的活性即可，并且显然这样的序列添加或突变也在本发明的范围内。
同时，胰岛素类似物包括所有的肽本身、其盐(例如肽的药学上可接受的盐)或其溶剂化物。
另外，肽或胰岛素类似物可以处于任何药学上可接受的形式。
盐的种类不受特别限制。然而，优选的是盐对于受试者(例如哺乳动物)是安全有效的形式，但不特别限于此。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在药物医学决定的范围内可有效用于所需目的而不引起过度毒性、刺激、过敏反应等的物质。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”包括衍生自药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的酸的实例可包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。由合适的碱衍生的盐可包括碱金属(如钠、钾等)、碱土金属(如镁等)、铵等。
另外，如本文所用，术语“溶剂化物”是指复合物，其在根据本发明的肽或其盐与溶剂分子之间形成。
另一方面，本发明提供了编码胰岛素类似物的分离的核酸、包含该核酸的重组表达载体和包含该重组表达载体的转化体。
胰岛素类似物与上文解释的相同。
如本文所用，术语“核酸”是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，包括基因组DNA、cDNA和由其转录的RNA，并且作为核酸分子中的基本构成单元的核苷酸不仅包括天然核苷酸，还包括在糖或碱基中具有修饰的类似物(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980；Uhlman and Peyman,ChemicalReviews,90:543-584,1990)。可以使用分子生物学中的标准技术分离或制备本发明的核酸。例如，本发明的核酸可以通过PCR扩增使用基于天然胰岛素的基因序列(NM_000207.2,NCBI)的适当引物序列来制备，并且可以使用自动DNA合成仪通过标准合成技术来制备。
具体地，本发明的核酸包括由SEQ ID NO:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51表示的核苷酸序列。在示例性实施方案中，本发明的核酸不仅包括由SEQ ID NO:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51表示的核苷酸序列，还包括与上述序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、并且最优选至少98％序列同源性的所有序列，其中与天然胰岛素相比，由上述核酸编码的肽展现出对受体降低的结合亲和力，同时基本上具有控制体内血液葡萄糖水平的功能。
根据本发明的重组载体可以构建为用于典型克隆或用于表达的载体，并且可以构建为使用真核细胞或原核细胞作为宿主细胞的载体。
如本文所用，术语“载体”是指能够在适当宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，它是包含可操作地连接的必需调节因子(以使得能够表达核酸***物)的核酸构建体。本发明可以制备包含编码胰岛素类似物的核酸的重组载体，并且可以通过将重组载体转化或转染到宿主细胞中来获得本发明的胰岛素类似物。
在本发明中，编码胰岛素类似物的核酸可以与启动子可操作地连接。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指用于核酸表达的调节序列(例如，启动子、信号序列、核糖体结合位点、转录终止序列等)与不同核苷酸序列之间的功能性连接，并且调节序列可以通过相同的调节序列调节不同核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“启动子”是指非翻译的核酸序列，其可位于编码区的上游，包括聚合酶结合位点并具有启动位于启动子下游的基因转录成mRNA的活性，即聚合酶结合并启动基因转录的DNA区域，并且它可以位于mRNA转录起始的5’区。
例如，当本发明的载体是重组载体并且使用原核细胞作为宿主细胞时，总体上，通常包括能够执行转录的强启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子、T7启动子等)、用于启动翻译的核糖体结合位点、和转录/翻译终止序列。
另外，可以通过操纵本领域中常用的质粒(例如pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pPICZα系列、pUC19等)、噬菌体(例如λgt4·λB、λ-Charon、λΔz1、M13等)、或病毒(例如SV40等)来制备要在本发明中使用的载体
同时，当本发明的载体是重组载体并使用真核细胞作为宿主细胞时，可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、***瘤病毒的7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV的tk启动子，并且通常，载体包括多腺苷酸化序列(例如，牛生长激素终止子和衍生自SV40的多腺苷酸化序列)作为转录终止序列。
另外，本发明的重组载体包括本领域中常用的抗生素抗性基因作为选择标记，并且可包括例如对于氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素具有抗性的基因。
本发明的重组载体可另外包括不同的序列以促进所收集的靶蛋白即单链胰岛素类似物、胰岛素原或其类似物的纯化。另外包括的序列可以是用于蛋白质纯化的标签序列，例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)、6-组氨酸等，但是用于纯化靶蛋白所必需的序列种类不限于此。
由包含上述标签序列的重组载体表达的融合蛋白可以通过亲和色谱纯化。例如，当融合谷胱甘肽S-转移酶时，可以使用谷胱甘肽(它是酶的底物)，而当使用6-组氨酸标签时，可以通过Ni-NTA柱容易地收集所需的靶蛋白。
如本文所用，术语“转化”是指将DNA引入宿主细胞并使DNA在其中可复制为染色体因子或完成染色体整合的过程，这是通过向细胞中引入外源DNA人为引起遗传改变的现象。
本发明中使用的转化方法可以是任何转化方法，并且可以根据本领域中使用的常规方法容易地进行。常用的转化方法的例子可包括CaCl2沉淀法，使用二甲亚砜(DMSO)作为CaCl2沉淀法中的还原剂而改进效率的Hanahan方法，电穿孔，CaPO4沉淀法，原生质体融合法，使用碳化硅纤维的搅拌法，土壤杆菌介导的转化，使用PEG的转化，硫酸葡聚糖、脂质转染胺和干/抑制介导的转化等。
用于转化包含对根据本发明的胰岛素类似物进行编码的核酸的重组载体的方法可以不限于这些方法，但是可以使用本领域中常用的任何转化或转染方法而没有限制。
可以通过将包含编码胰岛素类似物的靶核酸的重组载体引入宿主细胞中获得本发明的转化体。
用于本发明的适当宿主可以没有特别限制，只要它可以表达本发明的核酸即可。适当的宿主的例子可包括属于埃希氏杆菌属的细菌(如大肠杆菌)、属于芽孢杆菌属的细菌(如枯草芽孢杆菌)、属于假单胞菌属的细菌(如恶臭假单胞菌)、酵母菌(如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、和粟酒裂殖酵母)、昆虫细胞(如草地贪夜蛾(SF9))、以及动物细胞(如CHO、COS和BSC)。具体地，大肠杆菌可以用作宿主细胞，但不限于此。
在实现本发明目的的另一方面，提供了使用转化体制备胰岛素类似物的方法。
具体地，制备胰岛素类似物的方法可包括以下：
a)通过培养包含编码胰岛素类似物的核酸的转化体来表达胰岛素类似物；并且
b)对表达的胰岛素类似物进行分离和纯化。
用于培养本发明的转化体的培养基可以按适当的方式满足宿主细胞培养的要求。用于宿主细胞生长的培养基中含有的碳源可以通过本领域技术人员根据其制备的转化体进行决定来适当选择，并且可以选择适当的培养条件来控制培养的时间和量。
所使用的糖源的例子可包括糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；以及有机酸，如乙酸。这些材料可单独使用或组合使用。
所使用的氮源的例子可包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素；或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可单独或组合使用。
所使用的磷源的例子可包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。另外，培养基可包含转化体生长所必需的金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。
最后，可以使用必需的生长材料，例如氨基酸和维生素。另外，也可以使用用于培养基的适当前体。可以在通过分批培养或连续培养的培养期间将上述来源适当地添加到培养物中。培养物的pH可以使用碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾和氨)或酸化合物(如磷酸或硫酸)适当调节。另外，可以添加消泡剂(如脂肪酸聚乙二醇酯)以防止泡沫产生。另外，为了保持培养物的需氧状态，可以将氧气或含氧的气体(例如空气)注入培养物中。
可以在20℃至45℃、并且特别是25℃至40℃下培养本发明的转化体。另外，继续培养直至获得所需胰岛素类似物的最大产量，并且就此而言，培养正常可持续10小时至160小时。
如上所述，当根据宿主细胞提供适当的培养条件时，本发明的转化体可以产生胰岛素类似物，并且根据载体构成和宿主细胞特征产生的胰岛素类似物可以分泌于宿主细胞的细胞质内或到周质空间中或细胞外。
在宿主细胞内或宿主细胞外表达的蛋白质可以通过常规方法纯化。纯化方法的例子可包括盐析(例如硫酸铵沉淀、磷酸铵沉淀等)、溶剂沉淀(例如使用丙酮或乙醇的蛋白质级分沉淀等)、透析、凝胶过滤、离子交换、或色谱法(如反相柱色谱法)、超滤等，并且这些方法可单独或组合使用。
在示例性实施方案中，本发明可以进一步包括用于从转化体中分离和纯化以包涵体形式表达的胰岛素类似物的以下步骤：
b-1)从步骤a)中的培养物获得该转化体并对其进行粉碎；
b-2)从粉碎的细胞裂解物回收表达的胰岛素类似物，然后使该胰岛素类似物进行重折叠；
b-3)将重折叠的胰岛素类似物通过阳离子交换色谱法进行纯化；
b-4)将纯化的胰岛素类似物用胰蛋白酶和羧肽酶B进行处理；并且
b-5)依次将经处理的胰岛素类似物通过阳离子交换色谱法、和阴离子交换色谱法或反相色谱法进行纯化。
在再另一方面，本发明提供了用于治疗包含胰岛素类似物作为活性成分的糖尿病的组合物(例如药物组合物)。
药物组合物可为用于治疗胰岛素相关疾病(例如糖尿病)的药物组合物。
胰岛素类似物与上文解释的相同。
如本文所用，术语“胰岛素相关疾病”是指在胰岛素的不存在或低水平的生理活性下发生或发展的疾病，例如包括糖尿病，但不特别限于此。
包含本发明的胰岛素类似物的药物组合物可包括药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指具有足以展现治疗效果并且不引起副作用的量的性质，并且可以易于由本领域技术人员基于在医学领域中熟知的因素来确定，这些因素例如是疾病的种类、年龄、体重、健康状况、性别、患者的药物敏感性、给药途径、给药方法、给药频率、治疗持续时间、要混合或同时给予的一种或多种药物等。
对于口服给药，药学上可接受的载体可包括粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、香水等。对于注射制品，药学上可接受的载体可包括缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于用于局部给药的制品，药学上可接受的载体可包括碱、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。本发明的药物组合物可与前述药学上可接受的载体组合配制成各种剂型。例如，对于口服给药，可将药物组合物配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆或晶片。对于注射制品，可将药物组合物配制成单剂量安瓿或多剂量容器。还可将药物组合物被配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊和缓释制品。
同时，适用于配制的载体、赋形剂和稀释剂的例子可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。另外，药物制剂还可包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、保湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
另外，基于本申请的组合物的总重量，可以按0.001wt％至10wt％的量包括本申请的胰岛素类似物，但是该量不特别限于此。
在再另一方面，本发明提供了治疗胰岛素相关疾病(例如糖尿病)的方法，其包括向有需要的受试者给予胰岛素类似物或包含该胰岛素类似物的药物组合物。
胰岛素类似物和药物组合物与上文解释的相同。
如本文所用，术语“给予”是指通过适当的方式向患者引入特定材料，并且可以通过任何常用途径给予本发明的胰岛素类似物，只要药物可到达靶组织即可。例如，可进行腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内和直肠内给药，但给药途径不限于此。然而，由于肽在口服给药时被消化，因此应对用于口服给药的组合物的活性成分进行包衣或配制，以防止胃中降解。优选地，可以按可注射的形式给予本发明的组合物。另外，可使用能够将活性成分转运到靶细胞中的某种装置来给予药物组合物。
另外，本发明的药物组合物可以通过作为活性成分的药物的类型以及若干相关因素(包括待治疗的疾病类型、给药途径、患者的年龄、性别和体重以及疾病严重程度)来确定。由于本发明的药物组合物具有优异的体内持续时间，因此可以显著降低本发明的给药频率和药物剂量。
本发明的组合物的总有效剂量可以按单剂量给予患者，或者可以根据分次治疗方案以多剂量长期给予。包含在本发明的药物组合物中的一种或多种活性成分的量可以根据疾病严重程度而变化。具体地，本发明的胰岛素类似物的总日剂量可以是每1kg患者体重约0.0001mg至500mg。
然而，除了药物组合物的给予途径和治疗频率之外，还考虑各种因素(包括患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和***率)来确定胰岛素类似物的有效剂量。就此而言，本领域技术人员可以容易地确定适合于本发明的药物组合物的特定用途的有效剂量。根据本发明的药物组合物不特别受限于制剂和给药途径和模式，只要它显示本发明的效果即可。
为实现本发明，本发明的另一方面提供了胰岛素类似物在制备药物中的用途。
在实施方案中，该药物用于预防或治疗胰岛素相关疾病，但该用途不特别限于此。
在实施方案中，该药物用于预防或治疗糖尿病，但该用途不特别限于此。
为实现本发明，本发明的再另一方面提供了胰岛素类似物在治疗胰岛素相关疾病、特别是糖尿病中的用途。
胰岛素类似物和胰岛素相关疾病与上文解释的相同。
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，提供这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不应以任何方式限制于此。
实施例1：制备单链胰岛素类似物表达载体
为了制备分别在A链或B链中具有单个修饰氨基酸的胰岛素类似物，使用拥有的天然胰岛素表达载体作为模板，合成正向和反向寡核苷酸(表2)，然后进行PCR以扩增类似物的每个基因。
在A链或B链中修饰的氨基酸序列以及类似物名称示于下文表1中。在表1中，类似物1代表其中A链的第14个氨基酸(即酪氨酸，Y)被组氨酸(H)取代的类似物，并且类似物6代表其中B链的第16个氨基酸(即酪氨酸，Y)被谷氨酸(E)取代的类似物。
[表1]
胰岛素类似物编号
序列修饰
类似物1
A <sup>14</sup>Y→H
类似物2
A <sup>14</sup>Y→K
类似物3
A <sup>19</sup>Y→E
类似物4
A <sup>19</sup>Y→S
类似物5
A <sup>19</sup>Y→T
类似物6
B <sup>16</sup>Y→E
类似物7
B <sup>16</sup>Y→S
类似物8
B <sup>16</sup>Y→T
类似物9
A <sup>14</sup>Y→A
类似物10
A <sup>14</sup>Y→D
类似物11
B <sup>16</sup>Y→D
类似物12
B <sup>25</sup>F→D
类似物13
B <sup>25</sup>F→E
用于胰岛素类似物扩增的引物显示在下文表2中。
[表2]
用于胰岛素类似物扩增的PCR反应是在95℃持续30秒、55℃持续30秒和68℃持续6分钟的条件下进行18个重复循环。将在该条件下获得的胰岛素类似物片段***pET22b载体中以表达为细胞内包涵体，并将由此获得的表达载体命名为pET22b-胰岛素类似物1至13。表达载体包含编码在T7启动子控制下的胰岛素类似物1至13的氨基酸序列的核酸，并且胰岛素类似物蛋白在包括表达载体的宿主细胞中表达为包涵体。
胰岛素类似物1至13的DNA序列和蛋白质序列在下文表3中给出。
通过DNA序列分析检查每个序列修饰，并且结果证实每个胰岛素类似物的序列已根据预期目的被修饰。
[表3]
实施例2：重组胰岛素类似物融合肽的表达
重组胰岛素类似物的表达在T7启动子的控制下进行。用各个重组胰岛素类似物表达载体转化大肠杆菌BL21-DE3(大肠杆菌B F-dcmompThsdS(rB-mB-)galλDE3；Novagen)。根据推荐的方案(Novagen)进行转化。收集用各个重组表达载体转化的单菌落，接种于含有氨苄青霉素(50μg/mL)的2X Luria肉汤(LB)中，并在37℃下培养15小时。将包含30％甘油的重组菌株培养液和2X LB培养基以1:1(v/v)的比率混合，将各1mL混合物分配到冷冻管中并在-140℃下储存，其被用作用于产生重组融合蛋白的细胞母液。
为了表达重组胰岛素类似物，将各个细胞母液的一小瓶解冻并接种到500mL的2XLuria肉汤中，并在37℃下振荡培养14小时至16小时。当OD600达到5.0或更高时终止培养，并将培养液用作种子培养液。使用50L发酵罐(MSJ-U2，B.E.MARUBISHI，日本)将种子培养液接种到17L发酵培养基中，并开始初始浴发酵。将培养条件维持在37℃的温度、20L/min(1vvm)的空气流速、500rpm的搅拌速度和pH 6.70(使用30％氨溶液)。当营养物在培养液中耗尽时，通过添加进料溶液而以补料分批模式进行发酵。通过OD值监测菌株的生长。当OD值达到100或更高时，引入IPTG至终浓度为500μM。引入后，培养再进行约23小时至25小时。在培养终止后，将重组菌株通过离心收获并储存在-80℃直至使用。
实施例3：重组胰岛素类似物的回收和重折叠
为了将实施例2中表达的重组胰岛素类似物变为可溶形式，破坏细胞，然后进行重折叠。将细胞沉淀(100g；湿重)重悬于1L裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 9.0)、1mM EDTA(pH 8.0)、0.2M NaCl和0.5％Triton X-100)中。使用微流化器(Microfluidic Corp.ModelM-110EH-30)在15,000psi的操作压力下破坏细胞。将由此破坏的细胞裂解物在7,000rpm、4℃至8℃的温度下离心20分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于3L洗涤缓冲液(0.5％Triton X-100和50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2M NaCl和1mM EDTA)中。在7,000rpm、4℃至8℃的温度下离心20分钟后，将细胞沉淀重悬于蒸馏水中，然后以相同方式离心。将由此获得的沉淀重悬于缓冲液(1M L-甘氨酸，3.78g L-半胱氨酸-HCl，pH 10.6)中并在室温下搅拌1小时。为了回收由此重悬浮的重组胰岛素类似物，向其中添加8M尿素并搅拌3小时至5小时。为了使溶解的重组胰岛素原类似物进行重折叠，在7,000rpm、4℃至8℃的温度下离心30分钟，将上清液收集并用15mM L-半胱氨酸-HCl(即还原剂)处理一小时。使用蠕动泵向其中添加预定体积的蒸馏水，并在4℃至8℃的温度下搅拌至少12小时。
实施例4：阳离子交换色谱纯化
完成重折叠后，将样品加载到用含45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液平衡的SP FF(GE healthcare)柱上，然后将胰岛素类似物蛋白使用含0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液以0％至100％的线性梯度以10个柱体积洗脱。
实施例5：用胰蛋白酶和羧肽酶B处理
使用超滤膜从洗脱的样品中除去盐，然后替换缓冲溶液(10mM Tris-HCl，pH8.0)。将由此获得的样品蛋白用胰蛋白酶和羧肽酶B处理，该胰蛋白酶对应于相对于样品的蛋白量而言约30,000的摩尔比，该羧肽酶B对应于相对于样品的蛋白量而言约3,000的摩尔比；并且在4℃至8℃的温度下搅拌至少16小时。
实施例6：阳离子交换色谱纯化
完成反应后，将样品再加载到用含45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液平衡的SP HP(GE healthcare)柱上，并将胰岛素类似物蛋白使用含0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液以0％至100％的线性梯度以10个柱体积洗脱。
实施例7：反相色谱纯化
为了将实施例6中获得的纯胰岛素类似物进行纯分离，将其加载到用磷酸钠和异丙醇平衡的反相色谱Source30RPC(GE healthcare，美国)上，并将胰岛素类似物蛋白使用含磷酸钠和异丙醇的缓冲液以线性梯度洗脱。
通过蛋白质电泳(SDS-PAGE，图1)和HPLC分析由此纯化的胰岛素类似物，并且分析了其中的代表性胰岛素类似物编号9、10、11和12的纯度，结果示于图2中。
实施例8：胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力的比较
为了测量胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力，通过临近闪烁测定(SPA)进行分析。将表达胰岛素受体的CHO细胞系的细胞膜和PVT SPA珠粒一起添加至96孔pico-板中。为了确认对胰岛素受体的结合亲和力，将人胰岛素和以超过10种不同浓度稀释的每种胰岛素类似物、以及作为竞争者的放射性同位素I125标记的胰岛素一起添加，并在室温下进行竞争性反应，持续4小时。四小时后，使用β计数器测量对胰岛素受体的结合亲和力。使用GraphPad Prism 6软件以IC50计算每种材料的结合亲和力，并将其数字化为针对人胰岛素而言对于胰岛素受体的相对结合亲和力。
结果是，与人胰岛素相比，对胰岛素受体的结合亲和力显示为：胰岛素类似物(编号1)为90％；胰岛素类似物(编号2)为95％；胰岛素类似物(编号3)为1.0％；胰岛素类似物(编号4)为<0.1％；胰岛素类似物(编号6)为20％；胰岛素类似物(编号7)为8.5％；胰岛素类似物(编号9)为79％；胰岛素类似物(编号10号)为79％；胰岛素类似物(编号11)为24％；胰岛素类似物(编号12)为<0.1％；以及胰岛素类似物(编号13)为<0.1％(表4)。因此，与天然胰岛素相比，观察到本发明的胰岛素类似物具有对胰岛素受体降低的结合亲和力。
[表4]
实施例9：胰岛素类似物10的体外功效的比较
为了评价胰岛素类似物10的体外功效，将分化成脂肪细胞的源自小鼠的3T3-L1细胞系用于测试葡萄糖摄取能力或脂质合成。将3T3-L1细胞在含有10％新生小牛血清(NBCS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Gibco，目录号12430)中传代培养，每周2次或3次，并保持。将3T3-L1细胞悬浮于分化培养基(含10％FBS的DMEM)中，然后在48孔培养皿中以每孔5×104个细胞的浓度接种，并培养48小时。为了将细胞分化成脂肪细胞，将1μg/mL人胰岛素(Sigma，目录号I9278)、0.5μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Sigma，目录号I5879)和1μM***(Sigma，目录号D4902)与分化培养基混合，并且在除去现有培养基后，向各孔中添加250μL混合物。48小时后，将培养基用补充有仅1μg/mL人胰岛素的分化培养基替换。此后，检查到诱导分化成脂肪细胞持续12天，同时将培养基每48小时用补充有1μg/mL人胰岛素的分化培养基更换。为了测试葡萄糖摄取能力，将分化的细胞用无血清DMEM培养基洗涤一次，然后添加各250μL无血清DMEM培养基以诱导血清耗竭4小时。使用无血清DMEM培养基对人胰岛素和胰岛素类似物10进行10倍连续稀释，浓度为从10μM至0.001nM。将由此制备的各250μL样品添加至细胞中，并在5％CO2培养箱中于37℃培养24小时。为了测量孵育后培养基中葡萄糖的剩余量，取培养基各200μL并用D-PBS稀释5倍，然后进行GOPOD测定(GOPOD测定试剂盒，Megazyme，目录号K-GLUC)。基于葡萄糖标准溶液的吸光度，将培养基中剩余的葡萄糖浓度换算，并分别计算人胰岛素和胰岛素类似物10的葡萄糖摄取能力的EC50值。
重复总计3次测试，结果是，人胰岛素和胰岛素类似物10的EC50值分别计算为14.4±1.0nM和7.8±0.7nM。也就是说，证实胰岛素类似物10与人胰岛素相比具有185.5±25.7％的葡萄糖摄取能力(图3)。
实施例10：胰岛素类似物10的细胞稳定性的比较
为了确认胰岛素类似物10的细胞稳定性，使用人源HepG2细胞系进行测试。首先，将HepG2细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中传代培养，每周2次至3次。将各300μL聚L-赖氨酸(Trevigen，目录号3438-100-01)添加至24孔板中并在37℃下包被2小时。用冷D-PBS洗涤两次后，将HepG2细胞悬浮在培养基(包含10％FBS的DMEM)中，并以每孔1×105个细胞的浓度接种在24孔板上并培养24小时。用测试培养基(包含2％FBS的DMEM)洗涤细胞后，向每个孔中添加500μL的含500nM人胰岛素和胰岛素类似物10的测试培养基。将细胞在5％CO2培养箱中于37℃孵育0、2、6、9、24和48小时后，回收培养基并在孵育结束后冷冻保存。为了确定培养基中剩余的胰岛素的量，用PBS-T进行100倍稀释，并使用人胰岛素ELISA试剂盒(Alpco，目录号80-INSHU-E10.1)分析。
重复总计3次测试，结果是，与0小时相比，在孵育48小时后，培养基中剩余的胰岛素的量计算为：针对人胰岛素和胰岛素类似物10分别为20.9±11.4％和72.7±5.7％。也就是说，证实胰岛素类似物10与人胰岛素相比具有更高的细胞稳定性(图4)。
综上所述，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本发明的技术概念或本质特征的情况下，本发明可以按其他特定形式实施。就此而言，本文公开的示例性实施方案仅用于说明目的，且不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明不仅意欲涵盖示例性实施方案，还涵盖可以包括在如由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的各种替换、修改、等同物和其他实施方案。
序列表
<110> 韩美药品股份有限公司(HANMI PHARM. CO., LTD.)
赛诺菲-安万特德国有限公司(Sanofi-Aventis Deutschland GmbH)
<120> 对胰岛素受体具有降低的结合力的胰岛素类似物及其用途
<130> OPA17190-PCT
<150> KR 10-2016-0122484
<151> 2016-09-23
<160> 56
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
cagcatctgc tccctccatc agctggagaa ctac 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gtagttctcc agctgatgga gggagcagat gctg 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
cagcatctgc tccctcaagc agctggagaa ctac 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
gtagttctcc agctgcttga gggagcagat gctg 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ctaccagctg gagaacgagt gcaactgagg atcc 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ggatcctcag ttgcactcgt tctccagctg gtag 34
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<211> 34
<212> DNA
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<223> 引物
<400> 7
ctaccagctg gagaactcct gcaactgagg atcc 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 8
ggatcctcag ttgcaggagt tctccagctg gtag 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ctaccagctg gagaacacct gcaactgagg atcc 34
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 10
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<211> 34
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 11
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<210> 12
<211> 34
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 12
gttccccgca cactagctcg agagcttcca ccag 34
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg gaac 34
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<211> 34
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 14
gttccccgca cactagggag agagcttcca ccag 34
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg gaac 34
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
gttccccgca cactagggtg agagcttcca ccag 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
cagcatctgc tccctcgccc agctggagaa ctac 34
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gtagttctcc agctgggcga gggagcagat gctg 34
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
cagcatctgc tccctcgacc agctggagaa ctac 34
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gtagttctcc agctggtcga gggagcagat gctg 34
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg gaac 34
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gttccccgca cactaggtcg agagcttcca ccag 34
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ggggaacgag gcttcgacta cacacccaag acc 33
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
ggtcttgggt gtgtagtcga agcctcgttc ccc 33
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
ggggaacgag gcttcgagta cacacccaag acc 33
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
ggtcttgggt gtgtactcga agcctcgttc ccc 33
<210> 27
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物1
<400> 27
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctccatcag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 28
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物1
<400> 28
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu His Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物2
<400> 29
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaagcag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 30
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物2
<400> 30
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Lys Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
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<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物3
<400> 31
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gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaacg agtgcaac 258
<210> 32
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物3
<400> 32
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
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85
<210> 33
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物4
<400> 33
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物4
<400> 34
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Ser Cys Asn
85
<210> 35
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物5
<400> 35
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaaca cctgcaac 258
<210> 36
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物5
<400> 36
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Thr Cys Asn
85
<210> 37
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物6
<400> 37
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 38
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物6
<400> 38
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 39
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物7
<400> 39
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 40
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物7
<400> 40
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 41
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物8
<400> 41
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 42
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物8
<400> 42
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 43
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物9
<400> 43
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgcccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 44
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物9
<400> 44
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 45
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物10
<400> 45
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 46
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物10
<400> 46
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asp Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 47
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物11
<400> 47
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 48
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物11
<400> 48
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 49
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物12
<400> 49
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgactacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 50
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物12
<400> 50
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Asp Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 51
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物13
<400> 51
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgagtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 52
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物13
<400> 52
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 53
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 54
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物，A-链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> Xaa是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)
<223> Xaa是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)
<223> Xaa是酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)
<223> Xaa是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> Xaa是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸或丙氨酸
<400> 55
Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa
1 5 10 15
Glu Asn Xaa Cys Xaa
20
<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物，B-链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)
<223> Xaa是苯丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)
<223> Xaa是苏氨酸，或者不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)
<223> Xaa是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或者不存在
<400> 56
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr
20 25 30
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