对胰岛素受体具有降低的亲和力的胰岛素类似物复合物及其用途
阅读说明：本技术 对胰岛素受体具有降低的亲和力的胰岛素类似物复合物及其用途 (There is the insulin analog compound and application thereof of reduced affinity to insulin receptor ) 是由 朴永振 崔仁荣 郑圣烨 权世昌 于 2018-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及胰岛素类似物缀合物及其用途。(The present invention relates to insulin analog conjugates and application thereof.)
技术领域
本发明涉及胰岛素类似物的缀合物以及其用途。
背景技术
已知通过各种途径除去体内的蛋白质，包括通过血液中的蛋白酶分解，通过肾脏的***，通过受体去除等。在这方面，已经进行了各种尝试以通过避免蛋白质清除机制增加生理蛋白质的半寿期来改善蛋白质的治疗效果。
通常，胰岛素是由人体的胰腺分泌的激素，其调节血糖水平并且具有维持正常血糖水平的作用，同时将血液中过量的葡萄糖携带至细胞以为细胞提供能量。然而，在糖尿病患者中，由于缺乏胰岛素，对胰岛素的抗性和β细胞功能的丧失，胰岛素不能正常发挥作用。结果，糖尿病患者不能利用血糖作为能量来源，而是显示出具有高血糖水平的高血糖症状并且在尿液***葡萄糖，这成为各种并发症的原因。因此，胰岛素疗法对于具有异常胰岛素产生(I型)或胰岛素抗性(II型)的患者是必需的，并且血糖水平可以通过胰岛素施用来正常调节。
然而，与其他蛋白质和肽激素一样，胰岛素具有非常短的体内半寿期，并因此不展现连续的治疗效果。因此，为了发挥其作用，需要重复施用胰岛素。这种频繁的施用对患者造成严重的疼痛和不适，并因此需要从患者顺从性、安全性和便利性方面改善施用。
因此，研究集中于开发各种蛋白质制剂、化学缀合物(如，脂肪酸缀合物)等，以通过通过增加此类蛋白质药物(诸如胰岛素)的体内半寿期而降低施用的频率来改善治疗效果以及患者生活的质量。
根据先前的报道，50％或更多的胰岛素在肾脏中去除，以及其余的胰岛素在目标部位(诸如肌肉、脂肪、肝脏等)中通过受体介导的清除(RMC)过程去除。
在这方面，已有报道(J Pharmacol Exp Ther(1998)286：959，Diabetes Care(1990)13：923，和Diabetes(1990)39：1033,等)，其报道了减少体外活性以避免胰岛素的RMC，从而增加血液中的胰岛素水平。然而，在J Pharmacol Exp Ther(1998)286：959，Diabetes Care(1990)13：923中，所建议的胰岛素类似物具有至少两个氨基酸的取代或没有提供特定的结果，而在Diabetes(1990)39：1033中，胰岛素类似物在他们对受体的结合亲和力方面没有显示出变化，或者它们的活性通过取代直接参与对胰岛素受体的结合的氨基酸而降低。也就是说，仍然需要开发具有增加的持续时间的胰岛素类似物。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供胰岛素类似物的缀合物。
本发明的另一个目的是提供编码缀合物的多核苷酸；包括多核苷酸的载体；和包括多核苷酸或包括多核苷酸的载体的转化体。
本发明的仍另一个目的是提供制备缀合物的方法。
本发明的仍另一个目的是提供包括胰岛素类似物的缀合物的组合物，如药物组合物。
本发明的仍另一个目的是提供与天然胰岛素的缀合物相比具有增加的体内持续时间和/或稳定性的长效制剂，其包括胰岛素类似物的缀合物。
本发明的仍另一个目的是提供用于预防或治疗胰岛素相关疾病(如糖尿病)的药物组合物，其包含胰岛素类似物的缀合物。
本发明的仍另一个目的是提供治疗胰岛素相关疾病(如糖尿病)的方法，其包括向需要其的受试者施用胰岛素类似物的缀合物或其组合物的步骤。
本发明的仍另一个目的是提供胰岛素类似物的缀合物在制备药物中的用途。
本发明的仍另一个目的是提供胰岛素类似物的缀合物在治疗胰岛素相关疾病，特别是糖尿病中的用途。
技术方案
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了胰岛素类似物缀合物。
更具体地，本发明的一个方面提供了由下式1表示的缀合物：
[式1]
X-La-F
其中在式1中，
X是胰岛素类似物，其包含选自以下的一个或多个氨基酸的修饰：天然胰岛素的B链的第16个氨基酸、B链的第25个氨基酸、A链的第14个氨基酸和A链的第19个氨基酸；
L是连接体；
a是0或自然数，条件是当a为2或更大时，每个L彼此独立；和
F是能够增加X的半寿期的物质。
在示例性实施方式中，X包含选自以下的一个或多个修饰：将天然胰岛素B链的第16个氨基酸(酪氨酸)修饰为谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸；将天然胰岛素B链的第25个氨基酸(苯丙氨酸)修饰为天冬氨酸或谷氨酸；将天然胰岛素A链的第14个氨基酸(酪氨酸)修饰为组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；和将天然胰岛素的A链的第19个氨基酸(酪氨酸)修饰为谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
在另一示例性实施方式中，X是胰岛素类似物，其包含通式2中指示的SEQ ID NO：55的A链和通式3中指示的SEQ ID NO：56的B链的所有组合(条件是不包括天然胰岛素；即，不包括A链与SEQ ID NO：53重合而B链也与SEQ ID NO：54重合的肽)：
[通式2]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(SEQ ID NO：55)
其中在通式2中，
Xaa1是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺；
Xaa5是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、或天冬酰胺；
Xaa12是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、或天冬酰胺；
Xaa14是酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、或天冬氨酸；
Xaa16是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺；
Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、或苏氨酸；和
Xaa21是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、或丙氨酸；并且
[通式3]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(SEQ ID NO：56)
其中在通式3中
Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、或天冬氨酸；
Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸；
Xaa27是苏氨酸或不存在；
Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在。
在仍另一个示例性实施方式中，X包含通式2中指示的SEQ ID NO：55的A链和SEQID NO：54的B链。
在仍另一个示例性实施方式中，X包含SEQ ID NO：53的A链和通式3中指示的SEQID NO：56的B链。
在仍另一个示例性实施方式中，在通式2中，
Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、或天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、或苏氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且
在通式3中，
Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、或天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
在仍另一个示例性实施方式中，在通式2中，
Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、或丝氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且
在通式3中，
Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、或天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
在仍另一个示例性实施方式中，X的特征在于：
(1)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是组氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(2)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是赖氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(3)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是谷氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(4)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是丝氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(5)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是苏氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(6)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是谷氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(7)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是丝氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(8)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是苏氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(9)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是丙氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(10)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(11)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(12)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是天冬氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(13)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
在仍另一个示例性实施方式中，X是胰岛素类似物，其包含选自SEQ ID NOS：28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50和52的氨基酸序列。
在仍另一个示例性实施方式中，在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是谷氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
在仍另一个示例性实施方式中，在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是丝氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
在仍另一个示例性实施方式中，在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是苏氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
在仍另一个示例性实施方式中，在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
在仍另一个示例性实施方式中，在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是天冬氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
在仍另一个示例性实施方式中，在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
在仍另一个示例性实施方式中，F选自聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合材料、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合材料、体内***、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖、肝素和弹性蛋白。
在仍另一个示例性实施方式中，聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基***、可生物降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合。
在仍另一个示例性实施方式中，F是免疫球蛋白Fc区。
在仍另一个示例性实施方式中，F是IgG Fc区。
在仍另一个示例性实施方式中，L选自肽、脂肪酸、糖、聚合物、低分子量化合物、核苷酸及其组合。
在仍另一个示例性实施方式中，聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基***、可生物降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合。
在仍另一个示例性实施方式中，L是聚乙二醇。
在仍另一个示例性实施方式中，聚合物的分子量为1kDa至100kDa。
在仍另一个示例性实施方式中，连接体被连接至胰岛素类似物的B链的N末端或胰岛素类似物中的赖氨酸残基。
在仍另一个示例性实施方式中，F是免疫球蛋白Fc区和连接体被连接至免疫球蛋白Fc区的N末端。
在仍另一个示例性实施方式中，F是免疫球蛋白Fc区和缀合物具有其中连接体的两端被连接到胰岛素类似物的B链的N末端和免疫球蛋白Fc区的N末端的结构。
在仍另一个示例性实施方式中，胰岛素类似物是其中与天然胰岛素相比对天然胰岛素受体的结合亲和力被降低的一种。
在仍另一个示例性实施方式中，胰岛素类似物对天然胰岛素受体的结合亲和力与天然胰岛素对天然胰岛素受体的结合亲和力相比为约10％到约90％。
在仍另一个示例性实施方式中，缀合物的特征在于：F是免疫球蛋白Fc区；L是聚乙二醇；和缀合物对天然胰岛素受体的结合亲和力与天然胰岛素对天然胰岛素受体的结合亲和力相比为0.1％到50％。
在仍另一个示例性实施方式中，缀合物的特征在于F是免疫球蛋白Fc区；L是聚乙二醇；和X是胰岛素类似物，其除了A链的第14个氨基酸是天冬氨酸外具有与天然胰岛素的序列同一的序列。
本发明的另一个方面提供了编码缀合物的多核苷酸；包括多核苷酸的载体；和包括多核苷酸或包括多核苷酸的载体的转化体。
本发明的仍另一个方面提供了制备缀合物的方法。
本发明的仍另一个方面提供了包括缀合物的组合物。
在示例性实施方式中，组合物是药物组合物。
在另一示例性实施方式中，组合物是用于预防或治疗胰岛素相关疾病的药物组合物。
在仍另一个示例性实施方式中，组合物是用于预防或治疗糖尿病的药物组合物。
本发明的仍另一个方面提供与天然胰岛素的缀合物相比具有增加的体内持续时间和/或稳定性的长效制剂，其包括胰岛素类似物的缀合物。
本发明的仍另一个方面提供治疗胰岛素相关疾病的方法，其包括向需要其的受试者施用胰岛素类似物的缀合物或其组合物的步骤。
在示例性实施方式中，胰岛素相关疾病是糖尿病。
本发明的仍另一个方面提供胰岛素类似物的缀合物在制备药物中的用途。
在示例性实施方式中，药物用于预防或治疗胰岛素相关疾病。
在另一示例性实施方式中，药物用于预防或治疗糖尿病。
本发明的仍另一个方面提供胰岛素类似物的缀合物在治疗胰岛素相关疾病，特别是糖尿病中的用途。
有益效果
本发明的非天然胰岛素类似物缀合物可以改善需要胰岛素施用的患者的顺从性。
附图说明
图1显示了通过蛋白质电泳的胰岛素类似物的纯度的分析结果，并且具体地，代表性胰岛素类似物9、10、11和12的结果(泳道1：片段尺寸标记物；泳道2：天然胰岛素；泳道3：胰岛素类似物9；泳道4：胰岛素类似物10；泳道5：胰岛素类似物11；和泳道6：胰岛素类似物12)。
图2a至2d显示了通过高压色谱的胰岛素的纯度的分析结构，并且具体地，代表性胰岛素类似物9、10、11和12的顺序结果(图2a至2d)。在每张附图中，以从上到下的顺序显示了RP-HPLC(C18)、RP-HPLC(C4)和SE-HPLC的结果。
图3a到3c是显示在正常小鼠(图3a)、SD大鼠(图3b)和比格犬(图3c)中“胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物”(其是本发明的代表性胰岛素类似物缀合物)和“天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物”(其是天然胰岛素缀合物)之间药代动力学特征的比较结果的图。
图4是显示在DIO/STZ大鼠中“胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物”(其是本发明的代表性胰岛素类似物缀合物)和“天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物”(其是天然胰岛素缀合物)之间降低血糖水平能力的比较结果的图。
具体实施方式
下文，将详细描述本发明的示例性实施方式。
同时，本文公开的解释和示例性实施方式中的每个可以适用于其他解释和示例性实施方式。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应受下文提供的具体公开内容的限制。
另外，本领域技术人员将能够基于常规实验识别或确认本申请中描述的本发明具体实施方式的许多等同物，并且此类等同物旨在包括在本发明中。
在整个说明书中，使用了氨基酸的常规单字母和3字母代码。另外，本文缩写中提到的氨基酸根据IUPAC-IUB规则进行描述。
本发明的一个方面提供了胰岛素类似物缀合物。
具体地，胰岛素类似物缀合物可以为缀合物的形式，其中胰岛素类似物与生物相容性材料相连，用于增加胰岛素类似物的体内半寿期。在本发明中，生物相容性材料可与载体互换使用。
在本发明中，与不缀合至载体的胰岛素类似物相比，胰岛素类似物缀合物可以展现出增加的功效持续时间，并且在本发明中，这种缀合物被称为“长效缀合物”。
通式，此类缀合物可以是非天然存在的缀合物。
更具体地，本发明提供由以下式1表示的缀合物：
[式1]
X-La-F
其中在式1中，
X是胰岛素类似物，其包含选自以下的一个或多个氨基酸的修饰：天然胰岛素的B链的第16个氨基酸、B链的第25个氨基酸、A链的第14个氨基酸和A链的第19个氨基酸；
L是连接体；
a是0或自然数，条件是当a为2或更大时，每个L彼此独立；和
F是能够增加X的半寿期的物质。
如本文所使用，术语“胰岛素类似物”是指与天然胰岛素不同的非天然胰岛素。胰岛素类似物包括与天然人胰岛素不同的非天然人胰岛素。胰岛素类似物是构成本发明的缀合物的部分，并且对应于式1中的X。
此类胰岛素类似物包括其中通过添加、缺失或取代而修饰天然胰岛素的一些氨基酸的类似物。
具体地，与天然胰岛素序列的序列同一性相比，本发明的胰岛素类似物可以具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％的序列同一性。另外地，与天然胰岛素对天然胰岛素受体的结合亲和力相比，本发明的胰岛素类似物可以具有对天然胰岛素受体的降低的结合亲和力，而具有与天然胰岛素序列的上述序列同一性。另外，胰岛素类似物可以具有血糖吸收能力和/或减少体内血糖水平的能力，如天然胰岛素所示。
在本发明中，任何胰岛素类似物与天然胰岛素受体的结合亲和力是指当在受体结合的竞争性抑制条件下测量结合抑制水平时，在胰岛素类似物和天然胰岛素中显示的结合抑制百分比，其中任何检测配体与天然胰岛素受体的结合在天然胰岛素或与其对应的胰岛素类似物的存在下被抑制。结合抑制可以间接地定义为测量的值，以确定由于根据适当标准的胰岛素受体的配体结合而显示的信号是否有效地改变。例如，结合亲和力可以通过测量值的百分比(如，天然胰岛素的IC50对与其对应的胰岛素类似物的IC50的百分比)来定义，该测量值通过测量增加或减少多少信号而获得；即，当放射性同位素标记的胰岛素与胰岛素受体结合时，测量从该标记产生的信号以确定在添加未标记的天然胰岛素或胰岛素类似物后每种信号减少或增加多少(如，通过测量天然胰岛素或胰岛素类似物的信号减少的IC50值)。此类通过竞争性抑制来测量受体的结合亲和力是本领域熟知的。在本发明的一个示例性实施方式中，对于此类测量所需的天然胰岛素受体，可以使用表达人天然胰岛素受体(A同种型或B同种型或两者)的细胞膜，例如细胞的细胞膜，其已经被通过基因工程方法操纵以过表达人天然胰岛素受体。另外，对于检测配体，可以使用碘-125标记的天然胰岛素。在本发明的更具体的实施方式中，闪烁亲近测定法(SPA)可用于测量受体结合的竞争性抑制。在本发明的进一步具体实施方式中，可以使用实验实施例1中描述的方法测量对胰岛素受体的结合亲和力。
更具体地，与天然胰岛素对胰岛素受体的结合亲和力(100％)相比，本发明的胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力可以为约99％或以下、约95％或以下、约90％或以下、约85％或以下、约80％或以下、约75％或以下、约70％或以下、约65％或以下、约60％或以下、约55％或以下、约50％或以下、约45％或以下、约40％或以下、约35％或以下、约30％或以下、约25％或以下、约20％或以下、约15％或以下、约10％或以下、约9％或以下、约8％或以下、约7％或以下、约6％或以下、约5％或以下、约4％或以下、约3％或以下、约2％或以下、约1％或以下、或约0.1％或以下(然而，本发明的胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力不对应于0％)。在本发明的具体实施方式中，胰岛素类似物对天然胰岛素受体的结合亲和力适当约10％至约90％，但值不限于此。另外，如果相对于天然胰岛素的结合亲和力，结合亲和力是弱的，那么胰岛素类似物落入本发明的范围内。如果结合亲和力弱于天然胰岛素的结合亲和力，则胰岛素受体对胰岛素类似物的去除被削弱，因此可以预期改善的血液半寿期以及效果的可持续性。
在本发明的实施方式中，在胰岛素类似物缀合物中，连接体可以是聚乙二醇；能够增加半寿期的物质可以是免疫球蛋白Fc区；并且与天然胰岛素的结合亲和力相比，天然胰岛素受体的结合亲和力可以是约99％或以下、约95％或以下、约90％或以下、约85％或以下、约80％或以下、约75％或以下、约70％或以下、约65％或以下、约60％或以下、约55％或以下、约50％或以下、约45％或以下、约40％或以下、约35％或以下、约30％或以下、约25％或以下、约20％或以下、约15％或以下、约10％或以下、约9％或以下、约8％或以下、约7％或以下、约6％或以下、约5％或以下、约4％或以下、约3％或以下、约2％或以下、约1％或以下、或约0.1％或以下(然而，本发明的胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力不对应于0％)。在在本发明的具体实施方式中，胰岛素类似物缀合物对天然胰岛素受体的结合亲和力适当地是0.1％至50％，但是值不限于此。另外，如果结合亲和力弱于天然胰岛素的结合亲和，则其落入本发明的范围内。如果结合亲和力弱于天然胰岛素的结合亲和力，则胰岛素受体对胰岛素类似物的去除被削弱，并因此可以预期改善的血液半寿期以及效果的可持续性。
如本文所使用，术语“约”是指包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范围，并因此包括等同或类似该术语后陈述的范围的范围中的所有值，但不限于此。
另外，本发明的胰岛素类似物可以具有如天然胰岛素中所显示的葡萄糖摄取能力。
具体地，相对于天然胰岛素的葡萄糖摄取能力(100％)，根据本发明的胰岛素类似物的葡萄糖摄取能力可以为约10％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约100％或更高、约110％或更高、约120％或更高、约130％或更高、约140％或更高、约150％或更高、约160％或更高、约170％或更高、约180％或更高、约190％或更高、或约200％或更高。
可以使用本领域已知的用于测量葡萄糖摄取能力的各种方法实现葡萄糖摄取能力的测量。
具体地，胰岛素类似物可以是单链，其中对应于其天然形式的A链和B链的两个序列区中的每一个在一条多肽链中连接，或者可以是两条多肽链的形式，其中两条序列区各自由单个多肽链组成。在下文中，当在本说明书中提及胰岛素类似物的A链或B链时，其应当根据如下情况进行解释：当对应胰岛素类似物是两个多肽链的形式时，其指的是A链或B链；以及甚至当类似物是单链的形式时，其分别指的是对应于对应单链多肽中天然A链的序列区或对应于对应单链多肽中天然B链的序列区。本发明的胰岛素类似物可以是单链或两个多肽链的形式，其是选自天然胰岛素的A链或对应其的多肽的一个链和选自天然胰岛素的B链或对应其的多肽的一个链的组合。特别地，对应天然胰岛素的A链或B链可以指的是例如，其中两个多肽链中多肽的任意一个链与天然胰岛素的A链或B链的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％的序列同一性，但不具体限于此，并且本领域技术人员可以通过构成对应多肽的序列和天然胰岛素的A链或B链之间的比较容易确定相同。
如上所描述，本文描述的内容旨在适用于相关胰岛素类似物的子概念的所有描述。
天然胰岛素是由胰腺分泌的激素，并且通常具有促进细胞内葡萄糖摄取和抑制脂肪分解的作用，从而控制体内血糖水平。可以控制血糖水平的胰岛素是由其前体胰岛素原的加工产生的，胰岛素原不具有控制血糖水平的功能。胰岛素由两条多肽链组成，即A链和B链，它们分别包括21和30个氨基酸，并且通过两个二硫键相互连接。A链和B链中的每一个可包括由以下显示的SEQ ID NO：53和54表示的氨基酸序列。
A链：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO：53)
B链：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO：54)
在一个示例性实施方式中，本发明中描述的胰岛素类似物可以是对受体具有降低的结合亲和力同时如天然胰岛素那样具有控制体内血糖水平功能的那些。更具体地，胰岛素类似物可具有降低体内血糖水平的能力。
另外，在一个示例性实施方式中，胰岛素类似物的种类和大小可以没有特别限制，只要它们可以表现出降低的受体介导的内化或受体介导的清除率。因此，与天然胰岛素相比，本发明的胰岛素类似物在血液中可以表现出改善的半寿期。
本发明的胰岛素类似物包括反向胰岛素、天然胰岛素的衍生物、天然胰岛素的片段等。胰岛素类似物不仅可以通过基因重组方法制备，而且可以通过固相合成制备，并且制备方法不限于此。
如本文所使用，术语“天然胰岛素的衍生物”是指与天然胰岛素相比在氨基酸序列上具有至少一个差异的肽，通过修饰天然胰岛素序列制备的肽，和可以像天然胰岛素一样控制体内血糖水平的天然胰岛素模拟物。天然胰岛素的此类衍生物可以是具有控制体内血糖水平的功能的衍生物。
具体地，天然胰岛素的衍生物可以在天然胰岛素的一部分氨基酸中通过取代、添加、缺失、修饰的任一种方法或这些方法的组合的修饰来制备。
具体地，天然胰岛素的衍生物可以与天然胰岛素的A链和B链的氨基酸序列中的每个具有80％或更高的同源性和/或氨基酸残基中的一部分基团可以通过化学取代(如，α-甲基化，α-羟基化)、缺失(如脱氨基)或修饰(如N-甲基化)等进行修饰，但不限于此。
用于本发明的天然胰岛素衍生物可以通过用于制备衍生物的各种方法的组合进行制备。
另外，用于制备天然胰岛素衍生物的此类修饰包括使用L-型或D-型氨基酸和/或非天然氨基酸的修饰；和/或天然序列的修饰或翻译后修饰(如，甲基化、酰化、泛素化、分子间共价键等)。
另外，天然胰岛素的衍生物都包括其中一个或多个氨基酸添加到天然胰岛素的氨基和/或羧基端的那些衍生物。
对于氨基酸的取代或***，不仅可以使用人蛋白质中常规观察到的20种氨基酸，而且可以使用非典型或非天然氨基酸。非典型氨基酸的商业来源可包括Sigma-Aldrich、ChemPep、Genzyme pharmaceuticals等。含有这些氨基酸的肽和典型肽的序列可以由商业肽合成公司合成或购自商业肽合成公司，例如American Peptide Company，Bachem(USA)，和Anygen(韩国)，但不具体限于此。
如本文所使用，术语“天然胰岛素的片段或天然胰岛素的衍生物的片段”是指胰岛素的一种形式，其中天然胰岛素或天然胰岛素的衍生物的氨基端或羧基端的至少一个氨基酸被去除。此类胰岛素片段可具有控制体内血糖水平的功能。
另外，本发明的胰岛素类似物可以是独立地或组合地使用制备天然胰岛素的衍生物或片段的方法制备的那些。
具体地，根据本发明的胰岛素类似物可以包括在上述天然胰岛素的A链和B链中具有修饰的那些，并且具体而言是其中修饰天然胰岛素的A链的特定氨基酸残基和/或修饰天然胰岛素的B链的特定氨基酸残基的那些。
具体地，胰岛素类似物可以是其中选自天然胰岛素的B链的第16个氨基酸、B链的第25个氨基酸、A链的第14个氨基酸和A链的第19个氨基酸的氨基酸中至少一个修饰被不同的氨基酸取代的那些，并且具体而言，其可以被谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸或丙氨酸取代，但不限于此。
具体地，胰岛素类似物可以是其中上述氨基酸中的至少一个、至少两个、至少三个或四个氨基酸被其它氨基酸取代的那些。
具体地，修饰可以是将胰岛素的B链的第16个氨基酸(即酪氨酸)修饰成谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸；将胰岛素的B链的第25个氨基酸(即苯丙氨酸)修饰成天冬氨酸或谷氨酸；将胰岛素A链的第14个氨基酸(即酪氨酸)修饰成组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；或将胰岛素的A链的第19个氨基酸(即酪氨酸)修饰成谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
因此，胰岛素类似物可以包括天然胰岛素的B链的第16个氨基酸(即酪氨酸)到谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或天冬氨酸的修饰；和/或天然胰岛素的B链的第25个氨基酸(即苯丙氨酸)到天冬氨酸或谷氨酸的修饰；和/或天然胰岛素的A链的第14个氨基酸(即酪氨酸)到组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸的修饰；和/或天然胰岛素A链的第19个氨基酸(即酪氨酸)到谷氨酸、丝氨酸或苏氨酸的修饰，但这些不限于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是包括下面的通式2表示的SEQ ID NO：55的A链和下面的通式3表示的SEQ ID NO：56的B链的那些。这些胰岛素类似物可以是A链和B链通过二硫键相互连接的形式，或者是胰岛素原的形式，但不限于此。
[通式2]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(SEQ ID NO：55)
在通式2中，
Xaa1是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺；
Xaa5是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、或天冬酰胺；
Xaa12是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、或天冬酰胺；
Xaa14是酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、或天冬氨酸；
Xaa16是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺；
Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、或苏氨酸；和
Xaa21是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、或丙氨酸。
[通式3]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(SEQ ID NO：56)
在通式3中，
Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、或天冬氨酸；
Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸；
Xaa27是苏氨酸或不存在；和
Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在。
本文中，可以不包括A链与SEQ ID NO：53一致而B链也与SEQ ID NO：54一致的肽。
另外，与包括上面通式2的A链和上面通式3的B链同时包括上述的A链的第14个和/或第19个氨基酸和/或上述B链的第16个和/或第25个氨基酸的特性修饰(即，在天然胰岛素中不存在氨基酸残基)的对应胰岛素类似物的序列具有70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、和甚至更具体地95％或更高的同源性，并且与天然胰岛素相比对受体具有降低的结合亲和力的那些肽也包括在本发明的范围内。
如本文所使用，术语“同源性”指的是关于野生型蛋白的氨基酸序列或编码其的多肽序列的相似性的水平，并且包括这样的序列，该序列具有与本发明的氨基酸序列或多肽序列具有上述百分比或更高的相同序列的序列。该同源性可以通过裸眼进行比较来确定，或可以经由通过排列两个序列分析同源性的程度的生物信息算法来确定。两个氨基酸序列之间的同源性可以指示为百分比。有用的自动化算法可以用在Wisconsin GeneticsSoftware Package的GAP、BESTFIT和FASTA(Genetics Computer Group，Madison，WI，USA)和TFASTA计算机软件模块中。自动化阵列算法包括Needleman&Wunsch，Pearson&Lipman和Smith&Waterman的序列阵列算法。在软件中自动确定算法和同源性，软件包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和CLUSTAL W。
在示例性实施方式中，胰岛素类似物可以是包括由上面通式2表示的SEQ ID NO：55的A链和SEQ ID NO：54的B链的胰岛素类似物，或包括SEQ ID NO：53的A链和由上面通式3表示的SEQ ID NO：56的B链的胰岛素类似物，但是不具体限于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是胰岛素类似物，其中在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、或天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、或苏氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、或天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸，但不限于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是胰岛素类似物，其中在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，谷氨酸、或丝氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、或天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸，但不限于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是胰岛素类似物，其中在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸或天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、或苏氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸，但不限于此。
在示例性实施方式中，根据本发明的胰岛素类似物可以对应以下胰岛素类似物：
(1)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是组氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(2)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是赖氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(3)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是谷氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(4)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是丝氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(5)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是苏氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(6)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是谷氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(7)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是丝氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(8)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是苏氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(9)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是丙氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(10)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是天冬氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(11)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是天冬氨酸，Xaa25是苯丙氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；
(12)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是天冬氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸；和
(13)在通式2中，Xaa1是甘氨酸，Xaa5是谷氨酰胺，Xaa12是丝氨酸，Xaa14是酪氨酸，Xaa16是亮氨酸，Xaa19是酪氨酸，和Xaa21是天冬酰胺；并且在通式3中，Xaa16是酪氨酸，Xaa25是谷氨酸，Xaa27是苏氨酸，和Xaa28是脯氨酸。
另外，在示例性实施方式中，胰岛素类似物可以是包括选自SEQ ID NOS：28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50和52的氨基酸序列的胰岛素类似物，但不限于此。
根据本发明的胰岛素类似物可以是包括上述具体序列的一个，和(基本上)由上述具体序列组成的一个，但不限于此。
另外，尽管在本发明中将其描述为“由具体SEQ ID NO组成的肽”，但它不排除在对应的SEQ ID NO的氨基酸序列的上游或下游添加任何无义序列，或其天然存在的突变中，或者沉默突变，只要该肽具有与由对应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的肽相同或相等的活性，并且显然包括这种序列添加或突变的肽也在本发明的范围内。
同时，胰岛素类似物包括所有自身肽、其盐(如，肽的药学上可接受的盐)或其溶剂化物。
另外，肽可以是药学上可接受的形式。
盐的种类不具体限定。然而，优选的是，盐是对受试者(例如，哺乳动物)安全且有效的形式，但不具体限于此。
如本文所使用，术语“药学上可接受的”是指在药物医学决定的范围内可以有效地用于所需目的而不引起过度毒性、刺激、过敏反应等的物质。
如本文所使用，术语“药学上可接受的盐”包括衍生自药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的酸的实例可包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-p-磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。衍生自合适碱的盐可包括碱金属(诸如钠、钾等)，碱土金属(诸如镁等、铵等)。
另外，如本文所使用，术语“溶剂化物”是指在根据本发明的肽或其盐与溶剂分子之间形成的复合物。
本领域技术人员可以使用本领域已知的肽制备方法容易地制备胰岛素类似物。例如，胰岛素类似物可以通过包括以下步骤的方法产生：
a)通过培养包括编码胰岛素类似物的核酸的转化体，表达胰岛素类似物；和
b)分离和纯化表达的胰岛素类似物。
用于培养本发明转化体的培养基可以以适当的方式满足宿主细胞培养的要求。用于宿主细胞生长的培养基中含有的碳源可以由本领域技术人员根据其制备的转化体适当选择，并且可以选择适当的培养条件以控制培养的周期和量。
所使用的糖源的实例可包括糖和碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，诸如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，诸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，诸如甘油和乙醇；和有机酸，诸如乙酸。这些材料可以单独使用或组合使用。
所使用的氮源的实例可包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可以单独使用或组合使用。
所使用的磷源的实例可包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐。另外，培养基可含有转化体生长所必需的金属盐，诸如硫酸镁或硫酸铁。
最后，可以使用必需的生长材料，诸如氨基酸和维生素。另外，也可以使用适当的培养基前体。通过分批培养或连续培养，可以在培养期间将上述来源适当地添加到培养物中。培养物的pH可以使用碱性化合物(诸如氢氧化钠、氢氧化钾和氨)或酸性化合物(诸如磷酸或硫酸)适当调节。另外，可以加入消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯以防止泡沫产生。另外，为了维持培养物的有氧状态，可以将氧气或含氧气体(如空气)注入培养物中。
本发明的转化体可以在20℃至45℃下培养，并且具体地25℃至40℃。另外，继续培养直至获得所需的胰岛素类似物的最大产量，并且就此而言，培养通常可持续10小时至160小时。
如上所述，当根据宿主细胞提供适当的培养条件时，本发明的转化体可以产生胰岛素类似物，并且根据载体构成和宿主细胞的特征，产生的胰岛素类似物可以在细胞质内分泌，或分泌到宿主细胞的周质空间中，或细胞外。
在宿主细胞内或宿主细胞外表达的蛋白质可以通过常规方法纯化。纯化方法的实例可包括盐析(如，硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀等)，溶剂沉淀(如，使用丙酮或乙醇的蛋白质级分沉淀等)，透析，凝胶过滤，色谱法(诸如离子交换色谱法，或反相柱色谱法)，超滤等，并且这些方法可以单独使用或组合使用。
在示例性实施方式中，本发明可进一步包括以下步骤，用于从转化体分离和纯化以内含体形式表达的胰岛素类似物：
b-1)从步骤a)中的培养物中获得转化体并将其粉碎；
b-2)从粉碎的细胞裂解液中回收表达的胰岛素类似物，然后将其重折叠；
b-3)通过阳离子交换色谱法纯化重折叠的胰岛素类似物；
b-4)用胰蛋白酶和羧肽酶B处理纯化的胰岛素类似物；和
b-5)通过阳离子交换色谱法，和阴离子交换色谱法或反相色谱法顺序纯化处理过的胰岛素类似物。
在本发明中，编码胰岛素类似物的核酸包括由SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51表示的核苷酸序列。在示例性实施方式中，本发明的核酸不仅包括由SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51表示的核苷酸序列，还包括与上述序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、最优选至少98％的序列同源性的所有序列，其中与天然胰岛素相比，由上述核酸编码的肽对受体表现出降低的结合亲和力，同时基本上具有控制体内血糖水平的功能。
根据本发明的重组载体可以构建为用于克隆或表达的典型载体，并且可以使用真核细胞或原核细胞作为宿主细胞构建为载体。
如本文所使用，术语“载体”是指能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，其是包括可操作地连接以使得能够表达核酸***物的必需调节因子的核酸构建体。本发明可以制备包括编码胰岛素类似物的核酸的重组载体，并且可以通过将重组载体转化或转染到宿主细胞中来获得本发明的胰岛素类似物。
在本发明中，编码胰岛素类似物的核酸可以可操作地连接至启动子。
用于转化包括编码根据本发明的胰岛素类似物的核酸的重组载体的方法可以不限于这些方法，而是可以使用本领域常用的任何转化或转染方法而没有限制。
本发明的转化体可以通过将包括编码胰岛素类似物的靶核酸的重组载体引入宿主细胞中而获得。
在本发明中使用的合适的宿主可以没有特别限制，只要它可以表达本发明的核酸即可。合适的宿主的实例可包括属于埃希氏菌属的细菌(诸如大肠杆菌)，属于芽孢杆菌属的细菌(诸如枯草芽孢杆菌)，属于假单胞菌属的细菌(诸如恶臭假单胞菌)，酵母(诸如巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))，昆虫细胞(诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9))和动物细胞(诸如CHO、COS和BSC)。具体地，大肠杆菌可以用作宿主细胞，但宿主不限于此。
同时，缀合物中的F是能够增加X的半寿期的物质，并且对应于构成本发明的缀合物的部分的组分。
F和X可以通过共价化学键或非共价化学键彼此连接，并且可选地，F和X可以通过共价化学键，非共价化学键或其组合彼此连接。
更具体，X和L，以及L和F可以通过共价键彼此连接。本文中，缀合物是如此缀合物，其中X、L和F通过共价键以式1的顺序彼此连接。
能够增加X的半寿期的物质可以是生物相容性材料，和例如，它可以选自聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合材料、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合材料、体内***、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖、肝素和弹性蛋白，但不具体限于此。
对于弹性蛋白，它可以是人原弹性蛋白，其是水溶性前体，并且可以是序列的一部分或其重复单元的一部分的聚合物。例如，弹性蛋白可包括弹性蛋白样多肽，但不具体限于此。
聚合物的实例包括选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基***、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合的聚合物，但不具体限于此。
聚乙二醇是共同包括所有形式的乙二醇均聚物、PEG共聚物或单甲基取代的PEG(mPEG)聚合物的术语，但不具体限于此。
另外，生物相容性材料包括聚氨基酸，例如聚赖氨酸、聚天然氨酸和聚谷氨酸，但不限于此。
另外，脂肪酸可以是对体内白蛋白具有结合能力的脂肪酸，但不具体限于此。
作为更具体的实例，FcRn结合材料可以是免疫球蛋白Fc区，并且更具体地，IgG Fc区，但不具体限于此。
为了增加体内溶解度和/或增强胰岛素类似物的半寿期和/或生物利用度，生物相容性材料可以与本发明的胰岛素类似物中的一个或多个氨基酸的侧链连接。此类修饰还可以降低治疗性蛋白质和肽的清除率。
上述生物相容性材料可以是水溶性的(两亲性或亲水性)和/或无毒的，和/或药学上可接受的。
F可以直接与X连接(即，式1中的a为0)，或可以通过连接体(L)与X连接。
具体地，L可以是肽连接体或非肽连接体。
当L是肽连接体时，它可以包括一个或多个氨基酸，例如，1至1000个氨基酸，但不具体限于此。在本发明中，可以使用各种已知的肽连接体，从而将F与X连接。例如，可以包括[GS]x连接体、[GGGS]x连接体、[GGGGS]x连接体等，并且上述连接体中的x可以是大于或等于1的自然数。然而，连接体不限于上述实例。
在本发明中，“非肽连接体”包括具有两个或更多个彼此连接的重复单元的生物相容性聚合物。重复单元通过除肽键之外的任何共价键连接。非肽连接体可以是本发明的缀合物的部分的组分，并且对应于式1中的L。在本发明中，当L是作为非肽连接体的生物相容性聚合物时，在非肽连接体的远端可以进一步包括用于通过共价键将连接体L与胰岛素类似物X和/或F连接的连接元件。此类连接元件不被具体限制，只要它不是生物相容性材料的重复单元，并且适合于通过共价键将生物相容性聚合物与X和/或F连接的原子或原子基团。
在La中，a可以是1或更大，和当a是2或更大时，每个L可以是是独立的。
在本发明中，非肽连接体可以与非肽聚合物可交换地使用。
另外，在示例性实施方式中，缀合物可以是其中F和C通过非肽连接体彼此共价连接的缀合物，非肽连接体包括能够在两端缀合F——具体地免疫球蛋白Fc区——和X的反应性基团。
具体地，非肽连接体可选自脂肪酸、糖类、聚合物、低分子量化合物、核苷酸及其组合。
本发明的聚合物可以在大于0kDa至约100kDa的范围内，具体地在约1kDa至约100kDa的范围内，和更具体地在约1kDa至约20kDa的范围内，但不具体限于此。
非肽连接体可以选自可生物降解的聚合物，诸如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基***、聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)，和脂质聚合物，几丁质，透明质酸，寡核苷酸及其组合，但不具体限于此。
在示例性实施方式中，非肽聚合物可以是聚乙二醇，但不限于此。另外，非肽聚合物的衍生物在本领域内已经已知并且通过本领域已知的技术可以容易制备的非肽聚合物也包括在本发明的范围内。
非肽连接体可以在本发明中使用而没有限制，只要它是对体内蛋白水解酶具有抗性的聚合物即可。非肽聚合物的分子量在大于0kDa至约100kDa的范围内，具体地在约1kDa至约100kDa的范围内，和更具体地在约1kDa至约20kDa的范围内，但不限于此。
如本文所使用，术语“约”是指包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范围，并且可以包括与该术语之后陈述的那些相当或相似的范围内的所有值，但是不限于此。
另外，作为与对应F的多肽连接的本发明的非肽连接体，不仅可以使用一种聚合物，还可以使用不同种类的聚合物的组合。
如上所述，在非示例性实施方式中，非肽连接体的两端可以各自通过连接元件与F和X连接。例如，在本发明的具体实施方式中，本发明的胰岛素类似物缀合物是通过使免疫球蛋白Fc区和/或胰岛素类似物与非肽聚合物(具有反应性基团的非肽聚合物)进行反应(连接反应)而制备的，该非肽聚合物具有能够与免疫球蛋白Fc区的胺基团或硫醇基团和X的胺或硫醇基团在其末端通过化学反应形成共价键的反应性基团(即，反应性基团被转化为缀合物的连接元件)。也就是说，具有反应性基团的非肽聚合物通过连接反应变成构成缀合物的一部分的非肽连接体。本文中，缀合物中的非肽连接体由重复单元和具有反应性基团的非肽聚合物的连接元件组成。
具体地，作为具有能够用于制备缀合物的反应性基团的非肽聚合物，非肽聚合物可包括在其两端可分别与F(如，免疫球蛋白Fc区)和X连接的反应性基团，并且具体地包括可以与位于N末端的胺基团或X的半胱氨酸残基中的赖氨酸残基或硫醇基团连接；或与位于N-末端的胺基团或F(如免疫球蛋白Fc区)的半胱氨酸残基中的赖氨酸残基或硫醇基团连接的反应性基团，但反应性基团不限于此。
另外，可以与F(即免疫球蛋白Fc区)和X形成共价键的非肽聚合物的反应性基团可以选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物，但不限于此。
在上文中，可以包括丙醛基或丁醛基作为醛基的实例，但醛基不限于此。
琥珀酰亚胺衍生物可包括琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、琥珀酰亚胺基羧甲基碳酸酯或琥珀酰亚胺基碳酸酯，但不限于此。
非肽连接体可以通过此类连接元件通过反应性基团的转化与X和F连接，但不具体限于此。
另外，用醛键还原胺化制备的最终产物比用酰胺键稳定得多。醛反应性基团在低pH下在N-末端选择性反应，并且可以在高pH(如pH9.0)下与赖氨酸残基形成共价键。
另外，具有反应性基团的非肽聚合物两端的反应性基团可以彼此相同或不同；例如，其一端可以具有马来酰亚胺基团，而在另一端具有醛基团、丙醛基团或丁醛基团。然而，反应性基团不被具体限制，只要F(即，免疫球蛋白Fc区)和X可以在具有反应性基团的非肽聚合物的两端连接即可。
例如，在具有反应性基团的非肽聚合物的一端可以包括马来酰亚胺基团作为反应性基团；和在非肽聚合物的另一端可以包括醛基团、丙醛基团、丁醛基团等作为反应性基团。
当使用在两端具有羟基反应性基团的聚乙二醇作为非肽聚合物时，可以使用本领域已知的化学反应活化羟基以产生上述各种反应性基团，或者可以使用具有市售改性的反应性基团的聚乙二醇制备本发明的长效蛋白质缀合物。
在示例性实施方式中，非肽聚合物可以是与X连接的聚合物，如，胰岛素类似物的N-末端区或赖氨酸残基，但不具体限于此。具体地，非肽聚合物(如PEG)可以与胰岛素类似物的N末端区(如胰岛素类似物中存在的末端氨基酸的胺基团或赖氨酸的胺基团)连接，但其不具体限于此。
另外，在示例性实施方式中，非肽聚合物可以与F(如免疫球蛋白Fc区)的N末端连接，但不具体限于此。具体地，非肽聚合物可以与免疫球蛋白Fc的N末端区连接，具体地，与末端氨基酸的胺基团连接，但其不被具体限于此。
如本文所使用，术语“N末端区”是指胰岛素类似物或免疫球蛋白Fc的氨基末端区或，以及还指出于本发明的目的可以与连接体连接的位置。例如，N末端区可以不仅包括N末端区的末端氨基酸残基还包括N末端氨基酸残基附近的氨基酸残基，并且具体地可以包括从远端起的第1个至第20个氨基酸残基。
如果在具有反应性基团的非肽聚合物的一端存在醛基团，并且该醛基团与位于胰岛素类似物的N-末端的胺基团连接，则该醛基团可通过还原性胺化反应与胺基团连接。此外，如果在具有反应性基团的非肽聚合物的另一端存在醛基团，并且该醛基团与位于免疫球蛋白Fc的N-末端的胺基团连接，则该醛基也可以通过还原性胺化反应与胺基团连接。
在本发明的实施方式中，用于制备缀合物的具有反应性基团的非肽聚合物是在两端具有反应性基团的PEG，并因此通过将非肽聚合物与X和F的氨基经由还原性胺化连接而形成缀合物。本文中，缀合物具有以下结构：
X-NHCH2-W-PEG部分-Z-CH2NH-F
其中，-CH2W-是连接非肽聚合物与X的连接元件；和-Z-CH2-是连接非肽聚合物与F的连接元件。另外，W和Z不存在或是二价官能团诸如亚烷基等。-CH2W-和-Z-CH2-的亚甲基衍生自醛反应性基团，和X-NH和NH-F的氮原子衍生自胰岛素类似物和F的氨基，其分别用于连接反应。
在以上结构中，PEG部分可以不仅含有结构-(CH2CH2O)n-，还含有在连接元件和-(CH2CH2O)n-之间***的氧原子。
在本发明中，“免疫球蛋白Fc区”是指包括重链恒定区2(CH2)和/或重链恒定区3(CH3)，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区的区域。免疫球蛋白Fc区可以是构成本发明的缀合物的部分的一个元件。
免疫球蛋白Fc区可以包括重链恒定区中的铰链区，但是不限于此。本发明的免疫球蛋白Fc区可以是包括部分或全部的重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区的扩展Fc区，只要免疫球蛋白Fc区实质上具有与天然类型相比相同或改进的作用。另外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是其中去除对应于CH2和/或CH3的氨基酸序列的相当长部分的区域。
例如，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)之间的组合；和6)重链恒定区的每个结构域和轻链恒定区之间的二聚体，但不限于此。
另外，在示例性实施方式中，免疫球蛋白Fc区可以是二聚体形式，并且X的一个分子可以以二聚体形式共价连接到一个Fc区，其中免疫球蛋白Fc和X可以通过非肽聚合物彼此连接。同时，X的两个分子每个以二聚体形式对称地连接到一个Fc区也是可能的。特别地，免疫球蛋白Fc和X可以通过非肽连接体彼此连接，但不限于上述实例。
另外，本发明的免疫球蛋白Fc区不仅包括天然氨基酸序列，还包括其序列衍生物。氨基酸序列衍生物是指由于缺失、***、非保守或保守取代或其组合而具有至少一个氨基酸残基差异的氨基酸序列。
例如，在免疫球蛋白Fc的缀合物中已知的在214至238、297至299、318至322或327至331位处的氨基酸残基可以用作修饰的合适位点。
另外，可以通过去除形成二硫键的位点，去除天然Fc的N-末端处的少数氨基酸，在天然Fc的N-末端***甲硫氨酸残基等来制备各种其他衍生物。另外，为了去除效应子功能，可以去除补体结合位点，如C1q结合位点，或者可以去除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。制备免疫球蛋白Fc区的这些序列衍生物的技术公开在国际公开号WO97/34631、WO96/32478等中。
不完全改变蛋白质或肽的活性的蛋白质和肽中的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath，R.L.Hill，The proteins，Academic Press，New York，1979)。最常出现的交换是两个方向上的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。根据情况，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等修饰Fc区。
上述Fc衍生物显示出与本发明的Fc区相同的生物活性，并且它们可具有对热、pH等的改善结构稳定性。
此外，免疫球蛋白Fc区可以从人或动物(诸如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)体内分离的天然形式获得，或者可以是从转化的动物细胞或微生物中获得的其重组体或衍生物。本文中，Fc区可以通过从活的人或动物体中分离整个免疫球蛋白并用蛋白酶处理分离的免疫球蛋白而从天然免疫球蛋白获得。当用木瓜蛋白酶处理整个免疫球蛋白时，它被切割成Fab和Fc区，而当用胃蛋白酶处理整个免疫球蛋白时，它被切割成pF'c和F(ab)2片段。可以使用尺寸排阻色谱法等分离Fc或pF'c。在更具体的实施方式中，人源Fc区是从微生物获得的重组免疫球蛋白Fc区。
另外，免疫球蛋白Fc区可以是天然聚糖与天然类型相比增加或减少的聚糖形式，或者是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc聚糖的增加、减少或去除可以通过常规方法实现，诸如化学方法，酶促方法和使用微生物的基因工程方法。通过从Fc区去除聚糖获得的免疫球蛋白Fc区显示出对C1q部分的结合亲和力的显着降低和抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或丧失，并因此它不会诱导不必要的体内免疫反应。在这方面，去糖基化或非糖基化的免疫球蛋白Fc区中的免疫球蛋白Fc区可以是更合适的形式，以满足作为药物载体的本发明的原始目的。
如本文所使用，术语“去糖基化”是指从Fc区酶促除去糖部分，和术语“非糖基化(aglycosylation)”是指在原核生物中，更具体地在大肠杆菌中，产生的未糖基化的Fc区。
同时，免疫球蛋白Fc区可以源自人或其他动物，包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠。在更具体的实施方式中，它源自人。
另外，免疫球蛋白(Ig)Fc区可以衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂合体。在更具体的实施方式中，它衍生自IgG或IgM，其是人血液中最丰富的蛋白质之一，并且在甚至更具体的实施方式中，它衍生自IgG，已知IgG增强配体结合蛋白质的半寿期。在更具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区，并且在最具体的实施方式中，IgG4Fc区是衍生自人IgG4的非糖基化Fc区，但不限于此。
特别地，如本文所述，术语“组合”是指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。也就是说，二聚体或多聚体可以由选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两个或更多个片段形成。
本发明的另一方面提供编码缀合物的多核苷酸，包含该多核苷酸的载体，和包含该多核苷酸或包含该多核苷酸的载体的转化体。
缀合物与上面解释的相同。
多核苷酸可以是编码融合蛋白形式的缀合物的多核苷酸。
另外，编码缀合物的分离的多核苷酸在本发明的范围内包括与对应序列具有75％或更高、具体地85％或更高、更具体90％或更高，和甚至更具体地95％或更高的序列同一性的多核苷酸序列。
载体和转化体的以上描述也适用于该实施方式。
本发明的仍另一个方面提供制备缀合物的方法。
缀合物如上所描述。
具体地，方法可以包括以下步骤：
(a)使具有两个或更多个反应性端基团的非肽聚合物与胰岛素类似物和载体中的一种反应以制备非肽聚合物，其中胰岛素类似物或载体附接于一端并且反应性端基团附接到另一端；和
(b)使步骤(a)中制备的非肽聚合物——其中胰岛素类似物或载体附接于一端和反应性端基团附接于另一端——与载体或胰岛素类似物中的另一个反应以制备缀合物，其中胰岛素类似物和载体通过非肽聚合物连接。
非肽聚合物、载体、和胰岛素类似物以及其连接组分全部如上所描述。
本发明的仍另一个方面提供包括缀合物的组合物。
缀合物如上所描述。
在本发明中，组合物可以是药物组合物。具体地，组合物可以是用于预防或治疗胰岛素相关疾病的药物组合物。更具体地，组合物可以是用于预防或治疗糖尿病的药物组合物。
如本文所使用，术语“胰岛素相关疾病”是指由于胰岛素生物活性低或没有而发生或进展的疾病；并且胰岛素相关疾病的实例可包括糖尿病，但不具体限于此。
如本文所使用，术语“预防”是指通过施用上述缀合物或含有该缀合物的组合物来抑制或延迟胰岛素相关疾病的所有活动，和术语“治疗”是指通过施用上述缀合物或含有该缀合物的组合物来改善或有利地改变胰岛素相关的疾病的症状的所有活动。
含有根据本发明的胰岛素类似物缀合物的药物组合物可包括药学上可接受的载体。此类载体可以是非天然存在的。
如本文所使用，术语“药学上可接受的”是指具有足以显示治疗效果并且不引起副作用的量的性质，并且可以由本领域技术人员基于医学领域中公知的因素容易地确定，诸如患者的疾病的种类、年龄、体重、健康状况、性别、药物敏感性，施用途径，施用方法，施用频率，治疗持续时间，同时混合或施用的药物等。
对于口服给药，药学上可接受的载体可含有粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、香料等。对于可注射制剂，药学上可接受的载体可含有缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于局部施用的制剂，药学上可接受的载体可含有基质(base)、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。本发明的药物组合物可以与上述药学上可接受的载体组合配制成各种剂型。例如，对于口服施用，药物组合物可以配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆或薄片。对于可注射制剂，药物组合物可配制成单剂量安瓿或多剂量容器。药物组合物也可以配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊和缓释制剂。
同时，适于配制的载体、赋形剂和稀释剂的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。另外，药物制剂可进一步含有填料、抗凝血剂、润滑剂、保湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
如本文所使用，术语“施用”是指通过适当的方式将特定物质引入患者，并且本发明的缀合物可以通过任何常用途径施用，只要药物可以到达靶组织即可。例如，可以进行腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内和直肠内施用，但施用途径不限于此。然而，由于肽在口服给药时被消化，因此用于口服施用的组合物的活性成分应该被包被或配制以防止胃中的降解。具体地，本发明的组合物可以以可注射的形式施用。另外，药物组合物可以使用能够将活性成分运输到靶细胞中的某种装置来施用。
另外，本发明的药物组合物可以通过作为活性成分的药物类型以及通过若干相关因素——包括待治疗的疾病类型、施用途径、患者的年龄、性别和体重、和疾病的严重程度——来确定。
可以以单剂量向患者施用本发明组合物的总有效剂量，或者可以根据分次治疗方案以多剂量长期施用。包含在本发明的药物组合物中的活性成分的量可以根据疾病严重程度而变化。具体而言，本发明的缀合物的总日剂量可以是每1kg体重患者约0.0001mg至500mg。然而，除了药物组合物的施用途径和治疗频率之外，考虑各种因素，包括患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和***率，确定缀合物的有效剂量。在这方面，本领域技术人员可以容易地确定适合于本发明药物组合物的特定用途的有效剂量。根据本发明的药物组合物不特别限于制剂和施用途径和方式，只要它显示出本发明的效果即可。
为了实现本发明，本发明的仍另一个方面提供了一种与天然胰岛素的缀合物相比具有增加的体内持续时间和/或稳定性的长效制剂，其包括所述胰岛素类似物缀合物。
胰岛素类似物和缀合物如上所描述。
为了实现本发明，本发明的仍另一个方面提供了治疗胰岛素相关疾病的方法，包括向有需要的受试者施用胰岛素类似物缀合物或其组合物。
胰岛素类似物和缀合物如上所描述。
在实施方式中，胰岛素相关疾病是糖尿病，但不具体限于此。
为了实现本发明，本发明的仍另一个方面提供胰岛素类似物缀合物在制备药物中的胰岛素。
在实施方式中，药物用于预防或治疗胰岛素相关疾病，但是用途不特别限于此。
在另一个实施方式中，药物用于预防或治疗糖尿病，但是用途不特别限于此。
为了实现本发明，本发明的仍另一个方面提供胰岛素类似物缀合物在治疗胰岛素相关疾病，具体地糖尿病中的用途。
胰岛素类似物、缀合物和胰岛素相关疾病如上所描述。
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，提供这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不应以任何方式限制于此。
实施例1：单链胰岛素类似物表达载体的制备
为了使用拥有的天然胰岛素表达载体作为模板分别制备在A链或B链中具有单个修饰氨基酸的胰岛素类似物，合成了正向和反向寡核苷酸(表2)，并且然后进行PCR扩增类似物的每个基因。
在A链或B链中修饰的氨基酸序列和类似物名称显示在下面表1中。在表1中，类似物1表示其中A链的第14个氨基酸(即酪氨酸，Y)被组氨酸(H)取代的类似物，类似物6表示其中B链的第16个氨基酸(即酪氨酸，Y)被谷氨酸(E)取代的类似物。
[表1]
下面表2中显示了用于胰岛素类似物扩增的引物。
[表2]
在95℃下30秒、55℃下30秒和68℃下6分钟的条件下，进行18次重复循环的胰岛素类似物扩增的PCR反应。将在该条件下获得的胰岛素类似物片段***到pET22b载体中表达为细胞内内含体，并将由此得到的表达载体命名为pET22b-胰岛素类似物1至13。该表达载体包含在T7启动子的控制下编码胰岛素类似物1-13的氨基酸序列的核酸，并且胰岛素类似物蛋白在包括表达载体的宿主细胞中表达为内含体。
在下面表3中给出胰岛素类似物1至13的DNA序列和蛋白序列。
通过DNA序列分析检查了每个序列修饰，结果确认了每个胰岛素类似物均已根据预期目的在其序列中进行了修饰。
[表3]
实施例2：重组胰岛素类似物融合肽的表达
在T7启动子的控制下进行重组胰岛素类似物的表达。用每种重组胰岛素类似物表达载体转化大肠杆菌BL21-DE3(大肠杆菌B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλDE3；Novagen)。根据推荐方案(Novagen)进行转化。收集用每种重组表达载体转化的单个菌落，接种到含氨苄青霉素(50μg/mL)的2X Luria肉汤(LB)中，并在37℃下培养15小时。将重组菌株培养肉汤和含有30％甘油的2X LB培养基按1：1(v/v)的比例混合，将1mL每种混合物分配到冷冻管中，并在-140℃下保存，其用作生产重组融合蛋白的细胞原液。
为了表达重组胰岛素类似物，将每种细胞原液的一个小瓶解冻并接种到500mL的2X Luria肉汤中，并在37℃振荡培养14至16小时。当OD 600达到5.0或更高时终止培养，并将培养肉汤用作种子培养肉汤。使用50L发酵罐(MSJ-U2，B.E.MARUBISHI，日本)将种子培养肉汤接种到17L的发酵培养基中，并开始初始浴发酵。培养条件保持在温度为37℃，空气流速为20L/min(1vvm)，搅拌速度为500rpm，以及使用30％氨水的pH为6.70的条件下。当培养肉汤中营养耗尽时，通过添加补料溶液以补料分批模式进行发酵。通过OD值监测菌株的生长。当OD值达到100或更高时，引入IPTG至500μM的终浓度。引入后，培养进一步进行约23小时至25小时。培养终止后，通过离心收获重组菌株，并在-80℃下保存直至使用。
实施例3：重组胰岛素类似物的回收和重折叠
为了将实施例2中表达的重组胰岛素类似物改变为可溶形式，将细胞破坏然后重折叠。将细胞沉淀(100g；湿重)重悬于1L裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 9.0)，1mM EDTA(pH 8.0)、0.2M NaCl和0.5％Triton X-100)中。使用微流化器(Microfluidic Inc.，型号M-110EH-30)在15,000psi的工作压力下破坏细胞。将如此破坏的细胞裂解物在4℃至8℃的温度下以7,000rpm离心20分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于3L洗涤缓冲液(0.5％TritonX-100和50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2M NaCl和1mM EDTA)中。在4℃至8℃的温度下以7,000rpm离心20分钟后，将细胞沉淀重悬于蒸馏水中，随后以相同的方式离心。将如此得到的沉淀重悬于缓冲液(1M L-甘氨酸、3.78g L-半胱氨酸-HCl，pH 10.6)中，并在室温下搅拌1小时。为了回收悬浮的重组胰岛素类似物，向其中加入8M尿素并搅拌3小时至5小时。为了重折叠增溶的重组胰岛素原类似物，在4℃至8℃的温度下以7,000rpm进行离心30分钟，收集上清液，并用15mM L-半胱氨酸-HCl处理，即还原剂，持续一小时。使用蠕动泵向其中添加预定体积的蒸馏水，并在4℃至8℃的温度下搅拌至少12小时。
实施例4：阳离子交换色谱法纯化
重折叠完成后，将样品上样到装有含45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液平衡的SP FF(GE Healthcare)平衡柱上，然后使用含有0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液以0％至100％的线性梯度以10个柱体积洗脱胰岛素类似物蛋白。
实施例5：用胰蛋白酶和羧肽酶B处理
使用超滤膜从洗脱的样品中除去盐，然后更换缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0)。将如此得到的样品蛋白用胰蛋白酶和羧肽酶B处理，胰蛋白酶对应于相对于样品的蛋白量约30,000的摩尔比，羧肽酶B对应于相对于样品的蛋白量约3,000的摩尔比，并在在4℃到8℃的温度下搅拌至少16小时。
实施例6：阳离子交换色谱法纯化
反应完成后，将样品上样到装有含45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液平衡的SP FF(GE Healthcare)平衡柱上，然后使用含有0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液以0％至100％的线性梯度以10个柱体积洗脱胰岛素类似物蛋白。
实施例7：反相色谱法纯化
为了从实施例6中获得的样品中分离出纯胰岛素类似物，将其上样到反相色谱法Source30RPC(GE Healthcare，USA)上，该色谱法用磷酸钠和异丙醇进行平衡，并且用含磷酸钠和异丙醇的缓冲液以线性梯度洗脱胰岛素类似物蛋白。
通过蛋白质电泳(SDS-PAGE，图1)和HPLC对如此纯化的胰岛素类似物进行分析，其中代表性胰岛素类似物9、10、11和12的纯度结果在图2中示出。
实施例8：长效胰岛素类似物缀合物的制备
通过以下方法制备实施例1至7中制备的胰岛素类似物的缀合物。
类似物10的长效缀合物代表性制备如下。
为了在胰岛素类似物10的B链的N末端处PEG化3.4K丙-ALD(2)PEG(在两端的每一端具有丙醛基团的PEG(3.4kDa)；NOF Inc.，USA)，使胰岛素类似物10的浓度(5mg/mL)、其与PEG的摩尔比为1:4，在4℃下反应约2小时。此处，通过在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)和45％异丙醇的混合溶剂中添加3mM氰基硼氢化钠(NaCNBH3)的还原剂进行反应。通过使用KCl浓度梯度和含柠檬酸钠(pH 3.0)和45％EtOH的缓冲液的SP-HP柱(GE Healthcare)纯化反应溶液。
为了连接PEG，将胰岛素类似物附接至免疫球蛋白Fc片段的N末端，其中纯化的单-PEG化胰岛素类似物和免疫球蛋白Fc片段的摩尔比建立为1:1.2，并在25℃下进行反应15小时同时将总蛋白浓度设定为20mg/mL。此处，使用将20mM作为还原剂的氰基硼氢化钠和氯化钠添加到100mM HEPES缓冲液(pH 8.2)中的反应溶液。
完成反应后，使用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和NaCl浓度梯度将反应溶液施加至Q-HP柱(GE，USA)，和使用硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.5)的浓度梯度施加至源15ISO(GE，USA)，并从而纯化胰岛素类似物10-3.4K PEG-免疫球蛋白Fc缀合物。
比较实施例：天然胰岛素的长效缀合物的制备
为了在天然胰岛素(Biocon Inc.，印度)的B链的N末端处PEG化3.4K丙-ALD(2)PEG(在两端的每一端具有丙醛基团的PEG(3.4kDa)；NOF Inc.，USA)，执行聚乙二醇化，并通过与实施例8中一样的纯化柱对单PEG化天然胰岛素进行纯化。
为了连接PEG，将天然胰岛素附接至免疫球蛋白Fc片段的N末端，其中将如实施例8中描述的反应条件和纯化柱施加至纯化的单-PEG化天然胰岛素和免疫球蛋白Fc片段，并由此制备天然胰岛素-3.4K PEG-免疫球蛋白Fc。
实验实施例1：胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力的比较
为了测量胰岛素类似物与胰岛素受体的结合亲和力，通过临近闪烁分析法(SPA)进行了分析。首先，为了获得表达胰岛素受体B同种型的细胞膜，通过使用CHO细胞系和使用脂质转染胺(Life Technology，USA)的转染方法，制备了其中过表达胰岛素受体B同种型的CHO细胞系。然后将制备的细胞系用均质器(Wheaton，USA)均质，并用蔗糖缓冲法分离细胞膜。将获得的其中表达人天然胰岛素受体B同种型的CHO细胞系的细胞膜和PVT SPA珠添加到96孔微孔板(PerkinElmer，型号6005162，USA)中。此外，作为竞争者，将人胰岛素或稀释到10种以上不同浓度(50mM Tris-HCl pH 7.8、150mM NaCl、0.1％BSA)中的每个胰岛素类似物与放射性同位素I125标记的人天然胰岛素一起添加(PerkinElmer，型号NEX-420，USA)，作为检测配体，并使其在室温下竞争性反应4小时。此后四个小时，使用β计数器(PerkinElmer，型号C9904V1，USA)测量对胰岛素受体的结合亲和力。使用GraphPad Prism6软件以IC50计算通过β计数器测量的每种材料的值，并将胰岛素类似物的胰岛素受体IC50的百分比数字化为相对于人胰岛素对胰岛素受体的相对结合亲和力。
结果，与人胰岛素相比，胰岛素类似物1与胰岛素受体的结合亲和力显示为90％；胰岛素类似物2为95％；胰岛素类似物3为1.0％；胰岛素类似物4为<0.1％；胰岛素类似物6为20％；胰岛素类似物7为8.5％；胰岛素类似物9为79％，胰岛素类似物10为79％；胰岛素类似物11为24％；胰岛素类似物12为<0.1％；和胰岛素类似物13为<0.1％(表4)。因此，观察到与天然胰岛素相比，本发明的胰岛素类似物与胰岛素受体的结合亲和力降低。
[表4]
实验实施例2：长效胰岛素类似物缀合物的受体结合亲和力的确认
通过上述实验实施例1中描述的方法，确认了长效胰岛素类似物对胰岛素受体和IGF-1受体的结合亲和力。
因此，与天然人胰岛素相比，天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物对胰岛素受体的结合亲和力为2.4±0.4％，而胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物对胰岛素受体的结合亲和力为1.3±0.2％。另外，与人天然IGF-1相比，天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物对IGF-1受体的结合亲和力均小于1％。因此，确认了与天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物相比，胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物对胰岛素受体的结合亲和力降低，并且两种物质由于PEG和免疫球蛋白Fc的缀合，对IGF-1受体的结合亲和力均降低。
[表5]
1)由于在最高浓度下剂量响应曲线没有达到饱和，因此没有测量精确值。
实验实施例3：长效胰岛素类似物缀合物的药代动力学分析
为了确认长效胰岛素类似物缀合物的药代动力学，对正常大鼠(SD大鼠，雄性，6周龄)、正常小鼠和狗(其适应实验室一段时间)的血药浓度水平随时间的变化进行了比较研究。
将天然胰岛素-PEG–免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物每个皮下施用至小鼠(单剂量43.05nmol/kg)和大鼠(单剂量65.1nmol/kg)。此后，在0、1、4、8、24、48、72、96、120、144和168小时处收集血液样品。另外，将天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物每个皮下施用至狗(单剂量6.3nmol/kg)。此后，在0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216和240小时处收集血液样品。
在每个时间点，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的血液浓度，并且胰岛素ELISA(ALPCO，USA)被用作试剂盒。然而，作为检测抗体，使用小鼠和抗人IgG4 HRP缀合物(AlphaDiagnostic Intl，Inc，USA)。
结果，与天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物相比，胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的半寿期在小鼠、大鼠和狗中分别增加了1.9倍、1.2倍和1.6倍，和MRT分别增加了2.5倍、1.9倍和2.0倍。因此，确认了与天然的胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物相比，胰岛素类似物-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物在血液中显示出增加的耐久性。
[表6]
实验实施例4：长效胰岛素类似物缀合物的葡萄糖水平降低效果的确定
为了确认长效胰岛素类似物缀合物在2型糖尿病模型中的药效，向正常大鼠(SD大鼠，雄性，7周龄)饲喂高脂饮食(60％脂肪)2周，和每周两次以30mg/kg的剂量给予能够破坏胰腺β细胞的STZ，以制造2型糖尿病模型(以下称为DIO/STZ大鼠)。将高脂饮食连续饲喂该制造的模型，以维持持续的糖尿病。
将天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物分别以12.1nmol/kg和8.09nmol/kg皮下施用至DIO/STZ大鼠，并且每隔3天重复进行施用。为了确定通过施用天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物降低体内血糖水平的效果，在施用的第0、1、3、6、7、9、10、12、13、15、16、21、22、24、25、27和28天从尾静脉收集血样，并使用体内血糖仪( LifeScan，Inc.，USA)确定体内血糖水平。
结果，确认了与天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物相比，胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物具有等效的降低体内血糖水平的作用，即使将缀合物以50％的剂量施用至DIO/STZ大鼠时也是如此。基于以上结果，因此确认与天然胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物相比，本发明的胰岛素类似物10-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的提高的体内血液耐久性可以持续维持降低体内血糖水平的优异效果，即使使用其小剂量。
根据前述内容，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本发明的技术构思或基本特征的情况下，本发明可以以其他特定形式来实施。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明旨在不仅覆盖示例性实施方式，而且覆盖可能包括在由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的各种替代、修改、等同形式和其他实施方式。
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<212> DNA
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ggggaacgag gcttcgagta cacacccaag acc 33
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<212> DNA
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<223> 类似物1
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gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctccatcag 240
ctggagaact actgcaac 258
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 类似物1
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Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu His Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 类似物2
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gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
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ctggagaact actgcaac 258
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 类似物2
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Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物3
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caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaacg agtgcaac 258
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<223> 类似物3
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Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
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Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
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Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
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Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
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<212> DNA
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<223> 类似物4
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<213> 人工序列
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<223> 类似物4
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Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Ser Cys Asn
85
<210> 35
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物5
<400> 35
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaaca cctgcaac 258
<210> 36
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物5
<400> 36
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Thr Cys Asn
85
<210> 37
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物6
<400> 37
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 38
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物6
<400> 38
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 39
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物7
<400> 39
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 40
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物7
<400> 40
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 41
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物8
<400> 41
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 42
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物8
<400> 42
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 43
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物9
<400> 43
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgcccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 44
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物9
<400> 44
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 45
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物10
<400> 45
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 46
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物10
<400> 46
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asp Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 47
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物11
<400> 47
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 48
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物11
<400> 48
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 49
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物12
<400> 49
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgactacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 50
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物12
<400> 50
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Asp Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 51
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物13
<400> 51
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgagtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 52
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物13
<400> 52
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物, A链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是丙氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，谷氨酸或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> Xaa是丙氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，组氨酸或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)
<223> Xaa是丙氨酸，丝氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，组氨酸或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)
<223> Xaa是酪氨酸，组氨酸，赖氨酸，丙氨酸或天冬氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa是丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酸或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)
<223> Xaa是酪氨酸，谷氨酸，丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> Xaa是天冬酰胺，甘氨酸，组氨酸或丙氨酸
<400> 55
Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa
1 5 10 15
Glu Asn Xaa Cys Xaa
20
<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物, B链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa是酪氨酸，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸或天冬氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)
<223> Xaa是苯丙氨酸，天冬氨酸或谷氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)
<223> Xaa苏氨酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)
<223> Xaa是脯氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，或者不存在
<400> 56
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr
20 25 30