具体实施方式

除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常，本文中使用的命名法是熟知的并且是本领域中通常使用的。

通过取代天然胰岛素的一个或多个氨基酸而获得的胰岛素类似物具有增加的体内半衰期，并且因此可以用作基础胰岛素治疗剂。当这种胰岛素类似物与人体内的白蛋白结合时，其体内半衰期可以进一步增加，使得所述胰岛素类似物可以用作每周配制品。

诸位发明人可以发现，当天然胰岛素的一个或多个氨基酸被取代时，胰岛素的体内半衰期可以增加，并且当白蛋白结合结构域另外与其融合时，所述胰岛素可以在体内与白蛋白结合，并且因此其半衰期可以进一步增加。然而，当白蛋白结合结构域与包含一个或多个氨基酸取代的胰岛素类似物融合时，并且当在将胰岛素类似物转化为活性形式的过程中使用常规技术中使用的胰蛋白酶时，确实出现了白蛋白结合结构域本身被切割的问题，使得难以产生持续长时间的活性形式。

因此，在本发明中，试图使用梭菌蛋白酶作为一种如下的酶，其使得能够在不诱导白蛋白结合结构域的切割的情况下将胰岛素转化为活性形式。然而，梭菌蛋白酶诱导了胰岛素本身的切割，并且出于此原因，将胰岛素的氨基酸进行取代，从而阻止胰岛素本身的切割。

因此，在一个方面，本发明涉及一种用于产生长效胰岛素类似物衍生物的活性形式的方法，所述方法包括使胰岛素类似物衍生物与梭菌蛋白酶反应的步骤，在所述胰岛素类似物衍生物中，包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体且胰岛素B链的氨基酸位置22处的精氨酸(Arg)被天然胰岛素中的赖氨酸(Lys)取代的胰岛素类似物与白蛋白结合结构域融合。

在本发明中，“包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体且胰岛素B链的氨基酸位置22处的精氨酸(Arg)被天然胰岛素中的赖氨酸(Lys)取代的胰岛素类似物”意指除了天然胰岛素B链的氨基酸位置22处的精氨酸(Arg)至赖氨酸(Lys)取代之外，所述胰岛素类似物还可以包含胰岛素A链或胰岛素B链中的其他氨基酸变体。

在本发明中，所述胰岛素类似物还可以包含一个或多个选自以下的氨基酸取代：由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置3处的缬氨酸(Val)至亮氨酸(Leu)取代；由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置8处的苏氨酸(Thr)至天冬氨酸(Asp)取代；由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置10处的异亮氨酸(Ile)至赖氨酸(Lys)取代；由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置14处的酪氨酸(Tyr)至谷氨酸(Glu)取代；由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置19处的酪氨酸(Tyr)至苯丙氨酸(Phe)取代；由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置5处的组氨酸(His)至苏氨酸(Thr)取代；由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置9处的丝氨酸(Ser)至天冬氨酸(Asp)取代；由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置13处的谷氨酸(Glu)至丙氨酸(Ala)取代；由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置17处的亮氨酸(Leu)至谷氨酰胺(Gln)取代；以及由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置24处的苯丙氨酸(Phe)至丝氨酸(Ser)取代，但不限于此。

在本发明的例子中，白蛋白结合结构域可以包含由以下氨基酸序列表示的白蛋白结合基序：

GVSDFYKKLIX_aKAKTVEGVEALKX_bX_cI

其中

X_a独立地选自D和E，

X_b独立地选自D和E，并且

X_c独立地选自A和E。

在本发明的例子中，X_a是D，X_b是D，并且X_c是A。

在本发明的实施方案中，白蛋白结合结构域可以包含以下氨基酸序列：

LAX₃AKX₆X₇ANX₁₀ELDX₁₄Y-[BM]-LX₄₃X₄₄LP

其中

[BM]是如前面段落中定义的白蛋白结合基序，

X₃独立地选自C、E、Q和S；

X₆独立地选自C、E和S；

X₇独立地选自A和S；

X₁₀独立地选自A、R和S；

X₁₄独立地选自A、C、K和S；

X₄₃独立地选自A和K；并且

X₄₄独立地选自A、E和S。

所述白蛋白结合结构域可以由选自SEQ ID NO:6至13的氨基酸序列表示，但不限于此。所述白蛋白结合结构域可以优选地由SEQ ID NO:6的氨基酸序列表示。

在本发明中，在所产生的胰岛素衍生物或胰岛素类似物衍生物的蛋白质重折叠效率、酶反应效率和活性方面，优选的是白蛋白结合结构域与胰岛素或具有B链-C链-A链的胰岛素类似物中的A链的C末端融合。在这种情况下，可以在胰岛素(或胰岛素类似物)与白蛋白结合结构域之间引入接头。

在本发明中，可以将编码胰岛素类似物的多核苷酸和编码白蛋白结合结构域的核苷酸引入重组载体，使得胰岛素类似物和白蛋白结合结构域可以作为融合蛋白表达。

根据本发明的胰岛素类似物衍生物的功能根据所述衍生物的三维结构而改变。因此，可以在不影响所述衍生物功能的情况下对根据本发明的长效胰岛素类似物衍生物的氨基酸序列进行小的改变。因此，本发明包括白蛋白结合结构域或长效胰岛素类似物衍生物的变体，其保留白蛋白结合特性或对酶切割的高抗性。例如，属于氨基酸残基的特定官能团(例如，疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基可以被属于相同官能团的其他氨基酸残基替代。

如本文所用，术语“白蛋白结合”和“对白蛋白的结合亲和力”是指多肽或蛋白质的特性，所述特性可以通过使用表面等离子体共振技术(如Biacore仪器)来测试。例如，可以在实验中测试白蛋白结合亲和力，其中将白蛋白或其片段固定在所述仪器的传感器芯片上，并且使含有待测试多肽或蛋白质的样品通过芯片。

可替代地，将待测试多肽或蛋白质固定在所述仪器的传感器芯片上，并使含有白蛋白或其片段的样品通过芯片。就此而言，所述白蛋白可以是哺乳动物来源的血清白蛋白，如人血清白蛋白。本领域技术人员可以解释通过此类实验获得的结果，以建立多肽或蛋白质对白蛋白的结合亲和力的定量测量。如果需要定量测量，例如以确定相互作用的K_D值，还可以使用表面等离子体共振方法。可以例如在Biacore 2000仪器(Biacore AB)中定义结合值。将白蛋白适当地固定在测量传感器芯片上，并通过连续稀释制备待测定亲和力的多肽或蛋白质样品，并按随机顺序注射。然后可以使用例如由仪器制造商提供的BIAevaluation4.1软件的1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型从所述结果计算K_D值。

在本发明的一个实施方案中，胰岛素类似物衍生物结合的白蛋白选自人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白，但不限于此。

在一个具体实施方案中，胰岛素类似物衍生物结合的白蛋白是人血清白蛋白。

同时，白蛋白结合基序和白蛋白结合结构域(或白蛋白结合多肽)的描述被解释为包括与WO 2014048977相对应的韩国专利公开号10-2015-0058454中披露的内容。

所述胰岛素类似物和白蛋白结合结构域彼此通过以下项连接：肽键；多肽接头；或选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖(dextran)、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂肪酸、核苷酸、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合的非肽基接头，但不限于此。

在本发明中，可以在胰岛素类似物与白蛋白结合结构域之间插入由(GGGGS)_n(其中n是范围为1至6的整数)序列的重复组成的接头。这是基于实验结果的，所述结果表明当未引入接头时，重折叠率较低，但当引入(GGGGS)序列的两个或更多个重复时，重折叠率没有显著差异。同时，随着所述序列的重复数(n)的增加，通过梭菌蛋白酶转化为胰岛素活性形式的速率增加，但所述胰岛素类似物的体内药代动力学未受到显著影响。综合上述结果，所述接头优选地由GGGGS序列的2至4个重复组成。

因此，在本发明中，所述胰岛素类似物和所述白蛋白结合结构域可以通过多肽接头彼此连接，并且所述多肽接头可以包括(GGGGS)_n(其中n是范围从1至6的整数，但不限于此)。优选地，所述肽接头可以由SEQ ID NO:5的氨基酸序列表示。

在本发明中，可以在与梭菌蛋白酶反应期间添加还原剂。所述还原剂可以选自半胱氨酸、β巯基乙醇、TCEP、GSH和DTT，但不限于此。作为还原剂，优选地添加0.1至0.5mM的DTT。更优选地，添加0.1至0.4mM的DTT。

DTT可以在胰岛素类似物衍生物与梭菌蛋白酶反应的初始阶段，即在反应开始的时间点仅添加一次，并且DTT可以在反应开始的时间点添加后进一步添加2至5次。然而，考虑到生产方法的便利性和效率，最优选的是在胰岛素类似物衍生物与梭菌蛋白酶反应的初始阶段添加DTT，并在反应后3至6小时进一步添加。可以将梭菌蛋白酶按每mg蛋白质0.1至5个单位，优选0.5至2个单位的浓度添加，但不限于此。

在本发明中，所述胰岛素类似物衍生物还可以与羧肽酶B(CpB)反应，在与梭菌蛋白酶反应期间或之后添加所述羧肽酶B。在这种情况下，当反应开始时，可以将CpB与梭菌蛋白酶一起添加。

在本发明中，所述梭菌蛋白酶和/或羧肽酶B(CpB)在pH 6.0-9.0、优选6.5-7.5的条件下和在4℃-40℃、优选30℃-40℃的温度条件下反应，但不限于此。

可以将CpB按每mg蛋白质0.001至1个单位，优选0.001至0.1个单位的浓度添加，但不限于此。

在另一个方面，本发明涉及通过上述方法产生的胰岛素类似物衍生物的活性形式。

在本发明中，可以通过裂解和纯化培养的重组微生物，在重组微生物中产生胰岛素类似物衍生物，其中重组载体包含编码类似物衍生物的多核苷酸。

根据本发明的重组载体可以构建为用于常规克隆或表达的载体，并且可以构建为使用原核或真核细胞作为宿主细胞的载体。

如本文所用，术语“载体”是指能够在适当宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，它是包含可操作地连接的必需调节因子(以使得能够表达核酸插入物)的基因构建体。本发明可以制备包含编码胰岛素类似物衍生物的核酸的重组载体，并且本发明的胰岛素类似物衍生物可以通过将重组载体转化或转染到宿主细胞中来获得。

在本发明中，编码胰岛素类似物及其类似物衍生物的核酸可操作地连接到核酸表达控制序列。如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如，启动子、信号序列、核糖体结合位点、转录终止序列等)与另一个核苷酸序列之间的功能性连接，并且因此控制序列可以控制另一个核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用，术语“启动子”是指位于编码区上游的非翻译的核酸序列，其包括聚合酶结合位点并具有启动位于启动子下游的基因转录成mRNA的活性，即聚合酶结合并启动基因转录的DNA位点，并且它位于mRNA转录起始区的5'区。

例如，当本发明的载体是重组载体并使用原核细胞作为宿主细胞时，通常包括能够促进转录的强启动子(如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子、trc启动子、phoA启动子、araBAD启动子、T5启动子和T7启动子)、用于启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。

另外，可以通过操纵本领域中常用的质粒(例如，pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pPICZα系列、pUC19等)、噬菌体(例如，λgt4λB、λ-Charon、λΔz1、M13等)、或病毒(例如，SV40等)来制备可以在本发明中使用的载体，但不限于此。

同时，当本发明的载体是重组载体并使用真核细胞作为宿主细胞时，可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)、衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒的7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV的tk启动子，并且通常，所述载体包括聚腺苷酸化序列(例如，牛生长激素终止子和衍生自SV40的聚腺苷酸化序列)作为转录终止序列。

此外，本发明的重组载体包括本领域中常用的抗生素抗性基因作为选择标记，并且可包括例如对于氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素具有抗性的基因。

本发明的重组载体可以另外地包括不同的序列，以使其易于纯化所收集的靶蛋白，即胰岛素和/或其类似物。另外包括的序列可以是用于蛋白质纯化的标签序列，例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)、6-组氨酸等，但是用于纯化靶蛋白所必需的序列种类不限于此。由包含上述标签序列的重组载体表达的融合蛋白可以通过亲和色谱纯化。例如，当融合谷胱甘肽S-转移酶时，可以使用谷胱甘肽(它是所述酶的底物)，并且当使用6-组氨酸标签时，可以通过Ni-NTA柱容易地收集所需的靶蛋白。可以使用包含编码胰岛素类似物和/或类似物衍生物的多核苷酸的重组载体构建用所述载体转化的重组微生物。

如本文所用，术语“转化”是指将DNA引入宿主细胞并使DNA在其中可作为染色体因子复制或通过完成染色体整合而使DNA在其中可复制的过程，这是通过向细胞中引入外源DNA人为引起遗传改变的现象。

本发明中使用的转化方法可以是任何转化方法，并且可以根据本领域中使用的常规方法容易地进行。常用的转化方法的例子可以包括CaCl₂沉淀法，使用二甲亚砜(DMSO)作为CaCl₂沉淀法中的还原剂而改进效率的Hanahan方法，电穿孔，CaPO₄沉淀法，原生质体融合法，使用碳化硅纤维的搅拌法，土壤杆菌介导的转化方法，使用PEG的转化方法，硫酸葡聚糖、脂质转染胺和干/抑制介导的转化等。

用于转化包含编码根据本发明的胰岛素类似物和/或类似物衍生物的核酸的重组载体的方法可以不限于这些方法，但是可以使用本领域中常用的任何转化或转染方法而没有限制。

可以通过将包含编码胰岛素类似物衍生物的核酸的重组载体引入宿主细胞中来获得本发明的重组转化体。用于本发明的适当宿主可以没有特别限制，只要它可以表达本发明的核酸即可。适当的宿主的例子可包括属于埃希氏杆菌属的细菌(如大肠杆菌(E.coli))、属于芽孢杆菌属的细菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、属于假单胞菌属的细菌(如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、酵母菌(如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、昆虫细胞(如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9))、以及动物细胞(如CHO、COS和BSC)，但不限于此。

如本文所用，术语“活性形式”意指胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素类似物衍生物的能够在体内调节血糖水平的成熟形式，并且是指通过从胰岛素原的形式中除去C肽而获得的并且包含胰岛素A链和B链的胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素类似物衍生物。

实施例

在下文中，将参考实施例进一步详细描述本发明。对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的，而不应解释为限制本发明的范围。

在以下的实施例中，将融合ABD的胰岛素类似物作为与本发明中长效胰岛素类似物衍生物相同的含义使用。

实施例1：融合ABD的胰岛素表达载体和菌株的构建

人胰岛素是作为前胰岛素原的形式合成的，前序列在内质网中被切割开，并且胰岛素原在高尔基体和内质网中被加工，从而形成成熟的胰岛素。基于这一事实，为了通过在大肠杆菌中表达胰岛素原蛋白、并且然后通过胰蛋白酶处理去除C链的方法来产生重组胰岛素，设计了胰岛素原。为了提高胰岛素原在大肠杆菌中的表达效率和纯化效率，将融合标签插入N末端中，并进行密码子优化。

理论上，白蛋白结合结构域(ABD)可以融合到胰岛素位点的数目是四个。然而，A链的N末端是对胰岛素活性而言重要的位置，并且因此被排除在融合位置之外。虽然B链的N末端对胰岛素六聚体的形成很重要，但它被包含在融合位置，因为胰岛素的活性可得以保持。如果ABD在B链与C链之间融合，则可能对蛋白质折叠产生影响。因此，胰岛素构建体被设计成B-C-A顺序或A-C-B顺序作为候选结构。最后，设计了用于表达以下三种形式的融合ABD的胰岛素的基因结构：

NdeI-融合标签-B链-C链-A链-接头-ABD–EcoRI，

NdeI-融合标签-ABD-接头-B链-C链-A链–EcoRI，和

NdeI-融合标签-A链-C链-B链-接头-ABD–EcoRI。

使用pJ401(DNA2.0)载体作为表达载体。用限制酶NdeI和EcoRI消化所述载体，并且然后在1％琼脂糖凝胶上通过电泳分离DNA片段。使用T4DNA连接酶将用于表达ABD融合蛋白的基因结构和如上所述从表达载体获得的DNA片段彼此连接，从而构建质粒。然后，通过氯化钙法将各质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。选择对卡那霉素具有抗性的转化菌株，并从中分离DNA。通过基于限制酶消化的分析方法确定DNA是否正确地插入。

当所述基因被设计成具有NdeI-融合标签-ABD-接头-B链-C链-A链-EcoRI结构时，由于蛋白质重折叠率很低，因此被认为是不合适的。此外，当所述基因被设计成具有NdeI-融合标签-A链-C链-B链-接头-ABD-EcoRI结构时，融合ABD的胰岛素具有胰岛素活性，但其显示出低重折叠率和酶处理率，因此被视为不适合作为制备胰岛素活性形式的方法。因此，在三种形式的融合ABD的胰岛素中，选择了NdeI-融合标签-B链-C链-A链-接头-ABD-EcoRI结构并用于后续实验。

在A链与白蛋白结合结构域(ABD)之间，插入一个由(GGGGS)序列的1至6个重复组成的接头。在这种情况下，当未引入接头时，重折叠率很低，但当引入由(GGGGS)序列的两个或更多个重复组成的接头时，重折叠率没有显著差异。同时，随着(GGGGS)_n序列中的n的增加，通过梭菌蛋白酶转化为胰岛素活性形式的速率增加，但胰岛素的体内药代动力学未受到显著影响。综合上述结果，将所述接头设计成由GGGGS序列的2至4个重复组成。

在本发明中使用的融合ABD的胰岛素的每个部分的氨基酸序列在下表1中示出。

表1

实施例2：具有经修饰胰岛素氨基酸序列的融合ABD的胰岛素类似物的构建

为了使用重组大肠杆菌产生胰岛素，通过使用胰蛋白酶将胰岛素原转化为活性形式的方法是必要的。然而，胰蛋白酶以高效率切割双碱性氨基酸，并且也切割单一氨基酸(如赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg))，这使得难以产生所需的胰岛素活性形式。此外，所述ABD序列还包括许多赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)残基，这使得难以进一步通过使用胰蛋白酶产生具有活性的所需的融合ABD的胰岛素。

出于此原因，使用梭菌蛋白酶作为能够替代胰蛋白酶的酶，以便诱导转化为活性形式。在这种情况下，当梭菌蛋白酶与融合ABD的胰岛素反应时，胰岛素B链位置22处的精氨酸(Arg)发生切割。为了解决这一问题，用赖氨酸(Lys)取代B链的位置22。在这种情况下，梭菌蛋白酶对胰岛素B链位置22处的切割显著降低，并且因此可以有效地产生融合ABD的胰岛素的活性形式(图1)。

除了如上所述的突变之外，还将另外的突变引入融合ABD的胰岛素，以便进一步提高融合ABD的胰岛素的稳定性和体内半衰期。A链和B链各有五个氨基酸被取代，并且被取代的位置在下表2中示出。

表2

使用GeneArt算法对大肠杆菌中的基因表达进行密码子优化，并合成基因以具有取代的氨基酸。

将如上所述构建的质粒以与实施例1中所述相同的方式引入大肠杆菌BL21(DE3)，从而构建大肠杆菌菌株。

实施例3：融合ABD的胰岛素类似物的表达

为了表达融合ABD的胰岛素类似物，将每种重组大肠杆菌菌株接种于100mL LB培养基中，并在37℃下振荡培养16小时，并且将所述培养物用作种子培养物。将2L LB培养基添加到7L发酵罐(New Brunswick BioFlo)中，灭菌，并且然后接种所述种子培养物。在温度为35℃、空气流量为3vvm以及搅拌速度为1,000rpm的条件下进行培养，并用氨水和磷酸将培养过程中的pH维持在6.8。在培养基中碳源耗尽的时间点，开始进料并且同时用IPTG诱导蛋白表达。在诱导表达后再进行10小时的培养，并使用离心机回收重组菌株。

融合ABD的胰岛素类似物在大肠杆菌菌株中作为包涵体表达，并且即使当氨基酸突变被引入胰岛素结构域中时，表达水平在本发明中使用的载体系统中出现(图2)。

实施例4：诱导细胞裂解和增溶/重折叠

将表达融合ABD的胰岛素或融合ABD的胰岛素类似物的各菌株悬浮在裂解缓冲液(20mM Tris、10mM EDTA、10％蔗糖、0.2M NaCl，pH 8.0)中，并使用高压均质器裂解细胞。以7,000rpm在高速离心机中离心裂解的细胞，并除去可溶性蛋白和一些细胞碎片，从而分离出包括包涵体的沉淀。将分离的包涵体用缓冲液(含有1％Triton X-100、0.2M NaCl和1M尿素)洗涤，并且然后以7,000rpm离心。将沉淀的包涵体用蒸馏水另外洗涤两次，并且然后在-80℃下储存直至使用。

将冷冻储存的包涵体溶解在增溶缓冲液(25mM Tris、8M尿素、30mM半胱氨酸-HCl，pH 10.5)中，并且然后在重折叠缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 10.5)中稀释，并在4℃下重折叠16小时。通过RP-HPLC分析确定是否发生重折叠。当通过RP-HPLC分析增溶的溶液时，由于高疏水性，在约20分钟时观察到蛋白质峰，但当进行重折叠时，观察到所述峰偏移至16分钟(图3)。这是因为随着重折叠的进行，疏水性与增溶溶液中的疏水性相比有所下降。重折叠继续进行，直至在通过RP-HPLC分析期间不再观察到蛋白质峰偏移。

实施例5：通过使用酶转化为活性形式

为了使用重组大肠杆菌菌株产生胰岛素，需要通过使用胰蛋白酶将胰岛素原转化为活性形式。然而，融合ABD的胰岛素或融合ABD的胰岛素类似物在其序列中具有多个胰蛋白酶切割位点，并且出于此原因，使用梭菌蛋白酶作为能够替代胰蛋白酶的酶，以便诱导转化为活性形式。

当使用梭菌蛋白酶诱导转化为活性形式时，胰岛素B链位置22处发生切割，使得难以产生所需形式的胰岛素。出于此原因，使用通过将B链位置22从精氨酸(Arg)取代为赖氨酸(Lys)而获得的融合ABD的胰岛素类似物来产生胰岛素的活性形式。同时，除非另有说明，否则在所有实验中均使用融合ABD的胰岛素类似物4。

梭菌蛋白酶在其活性位点中含有半胱氨酸(Cys)，并且因此需要还原条件才能展现出酶活性。此外，在用还原剂处理重折叠溶液以维持梭菌蛋白酶活性的情况下，胰岛素区域中的二硫键极有可能被破坏。出于此原因，要求推导出在不破坏二硫键的情况下提高酶促反应产率的条件。因此，使用酶促反应溶液中含有的还原剂DTT，进行关于处理浓度和其他处理的实验。

为了将呈前体形式的融合ABD的胰岛素类似物转化为活性形式，还另外需要羧肽酶B(CpB)。CpB是一种在羧基末端处切割碱性氨基酸的酶，并且还测试了其详细条件。具体地，评价了用梭菌蛋白酶和CpB处理的时间、同时处理的可能性、酶处理的量、酶处理的温度、以及适当的pH水平。

由于梭菌蛋白酶作为原形式(pro-form)存在，因此诱导自动切割来激活它。为此，将冷冻干燥的梭菌蛋白酶(沃辛顿，美国)溶解在蒸馏水中，并且然后在添加激活缓冲液(500mM Tris、50mM DTT、25mM CaCl2 pH 7.8)后在4℃下激活30分钟。将激活的梭菌蛋白酶以每mg蛋白质0.1至5个单位的浓度添加到重折叠蛋白质中，并允许在25℃至40℃下反应2至8小时。在梭菌蛋白酶反应后，以每1mg蛋白质0.001至1个单位的浓度添加CpB，并使其反应。通过使用HCl将pH降低至3.5或更低来停止酶促反应。

5-1：添加DTT后转化为活性形式的效率评价

为了检查梭菌蛋白酶和CpB的酶促反应条件，将DTT添加至重折叠溶液中至浓度为0至0.4mM，并且然后通过SDS-PAGE观察通过梭菌蛋白酶产生胰岛素的活性形式。显示出当添加多于0.5mM的DTT时，胰岛素A链与B链之间的二硫键被破坏(数据未示出)。

同时，如在图4中可以看出，在酶促反应溶液中未添加DTT，融合ABD的胰岛素类似物转化为活性形式的速率较低，但随着DTT浓度的增加，转化为活性形式的效率增加。

5-2：在添加CpB的不同时间点对转化为胰岛素活性形式的效率评价

为了将融合ABD的胰岛素原类似物转化为活性形式，应当用梭菌蛋白酶和CpB两者处理胰岛素原类似物。就此而言，确定了添加CpB的时间点。为了切割胰岛素C肽和融合标签，应当首先进行用梭菌蛋白酶的处理，然后应当进行用CpB的处理，以从切割位点去除精氨酸(Arg)。然而，为了缩短产生时间，将在用梭菌蛋白酶处理后2至4小时用CpB处理与用梭菌蛋白酶和CpB同时处理进行了比较。

结果是，如在图5中可以看出，在用梭菌蛋白酶和CpB同时处理中的酶促反应模式与在其中首先进行用梭菌蛋白酶处理的情形中的酶促反应模式没有不同。因此，为了提高所述方法的效率，选择了用梭菌蛋白酶和CpB同时处理。

5-3：用梭菌蛋白酶和CpB同时处理中的pH条件

已知梭菌蛋白酶在pH 7.4至7.8时展现出最佳活性，并且CpB在pH 9.0时展现出最佳活性。由于这两种酶的最佳pH范围彼此不同，因此通过用这两种酶同时处理，确定了显示转化为胰岛素活性形式的最高效率的pH范围。根据本发明的表2所示的所有融合ABD的胰岛素类似物的理论pI值接近6，并且因此涉及沉淀。因此，排除了6.0或更低的pH。此外，在pH为9.0或更高时，聚集体增加。由于这些原因，在6.0至9.0之间的pH下进行评价。

在6.5至8.5的pH范围内用这两种酶同时处理，显示出转化为胰岛素活性形式的高效率。此外，如图6所示，在6.5至7.5的pH范围内，转化为胰岛素活性形式的效率特别高。

5-4：在另外添加梭菌蛋白酶和DTT后转化为胰岛素活性形式的效率评价

如实施例5-1所示，当添加DTT时，转化为胰岛素活性形式的效率增加。然而，已知DTT的半衰期在高pH和温度下快速降低，并且因此认为难以在酶促反应的长时间内维持梭菌蛋白酶的活性。因此，研究了一种能够长时间维持梭菌蛋白酶活性的方法。

为此，与其中另外添加0.2mM DTT的方法相比，评价了其中在酶促反应开始后4.5小时另外添加1U/mg梭菌蛋白酶的方法。结果是，如图7所示，即使在另外添加梭菌蛋白酶时，转化为活性形式的效率也没有显著增加，但在另外添加DTT时，即使在未另外添加梭菌蛋白酶时，向活性形式的转化也显著增加。此外，当另外添加梭菌蛋白酶和DTT两者时，观察到未转化形式的量相对较少，并且转化为活性形式的效率增加。

然而，通过质谱对酶促反应溶液的分析表明，当添加DTT时，向胰岛素活性形式的转化显著增加，但当同时添加DTT和梭菌蛋白酶时，诱导了胰岛素的非特异性切割，从而导致杂质增加。因此，可以看出，单独添加还原剂DTT将有利于向胰岛素活性形式的转化(图8)。

5-5：在各种温度下转化为胰岛素活性形式的效率评价

进行评价以确定其中梭菌蛋白酶和CpB将显示最佳活性的温度范围。此时，考虑到生产规模下的工艺操作，排除了4℃或更低和40℃或更高的温度，并在10℃至30℃的温度下进行评价。结果是，如图9所示，可以看出，当温度从10℃升高至20℃和30℃时，未转化形式的量更少，并且向活性形式的转化进行地更快。此外，显示出随着DTT浓度的增加，向活性形式的转化进行地更快。

实施例6：融合ABD的类似物胰岛素的纯化

根据制造商的说明，首先使用EMD COO-(M)(Merck)通过离子交换树脂色谱来纯化用梭菌蛋白酶和CpB酶法处理的样品，并且然后根据制造商的说明，使用P100 RP-18e(Merck)通过反相色谱进一步纯化。

结果是，如在图10中可以看出，通过这两种纯化方法可以纯化无杂质的融合ABD的胰岛素类似物的活性形式。

实施例7：融合ABD的胰岛素类似物对白蛋白的结合亲和力的测量

为了测量融合ABD的胰岛素类似物蛋白对白蛋白的结合亲和力，使用了表面等离子体共振(SPR，BIACORE 3000，GE healthcare)分析方法。通过胺偶联法将重组人血清白蛋白固定在CM5芯片上，并使得稀释至五种或更多种浓度的ABD或融合ABD的胰岛素类似物与所述重组人血清白蛋白结合，并且测定所述ABD或融合ABD的胰岛素类似物对人血清白蛋白的亲和力。

结果是，如在下表3中可以看出，胰岛素类似物对人血清白蛋白的亲和力维持在pM水平，尽管其低于ABD本身的亲和力。

表3

实施例8：天然胰岛素和融合ABD的胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力比较

为了测量天然胰岛素和融合ABD的胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力，使用了表面等离子体共振(SPR，BIACORE 3000，GE healthcare)分析方法。通过胺偶联法将胰岛素受体固定在CM5芯片上，并将稀释至五种或更多种浓度的天然胰岛素和融合ABD的胰岛素类似物中的每一种与所述胰岛素受体结合，并且测定所述天然胰岛素和融合ABD的胰岛素类似物中的每一种对胰岛素受体的亲和力。

结果是，如在下表4中可以看出，与天然胰岛素相比，融合ABD的胰岛素类似物的亲和力降低。特别地，类似物3的亲和力显示出最大的降低，并且相对于天然胰岛素下降至约19.4％的水平。

表4

在通过链脲佐菌素诱导的1型糖尿病模型中，与甘精胰岛素相比，评价了融合ABD的胰岛素类似物的功效。类似物1、3和10被排除在候选物之外，因为与甘精胰岛素相比，它们显示出50％或更低的降血糖能力。

实施例9：六聚体合成

胰岛素在体内与锌结合，从而形成稳定的六聚体结构。胰岛素形成六聚体的特性也用于配制品开发，并且可能在增加胰岛素体内半衰期方面发挥重要作用。因此，通过尺寸排阻色谱分析了融合ABD的胰岛素类似物是否保留形成六聚体的特性。结果表明，通过添加锌和苯酚，类似物4保留了形成六聚体的能力(图11)。在排除类似物7、9和10之外的所有类似物中也观察到了六聚体的形成。因此，在具有表2所示序列的类似物中，类似物7和9被进一步排除在候选物之外。

实施例10：融合ABD的胰岛素类似物的体内药代动力学和降血糖能力评价

为了评价六种融合ABD的胰岛素类似物的体内药代动力学，向正常SD大鼠(6周龄)皮下施用每种胰岛素类似物，并且然后在0、1、4、8、24、48、72和96小时采血。使用ELISA测量每个时间点在血液中残留的每种融合ABD的胰岛素类似物的浓度。此外，使用所采血液的一部分，用血糖监测装置测量时间依赖性血糖水平。

结果是，如在下表5中可以看出，与已知半衰期为5分钟的天然胰岛素相比，融合ABD的胰岛素类似物显示出显著增加的半衰期。通过仅取代胰岛素B链的位置22而获得的类似物11显示出7.2小时的半衰期，并且显示出最大半衰期增加的类似物4被评价为具有9.9小时的半衰期。

分析了正常动物的血糖水平维持在降低水平的时间。结果表明，类似物5、6和8具有增加的半衰期，但血糖水平维持时间较短。与这些类似物相比，类似物4具有最好的降低血糖水平的能力，并且最长时间地维持其功效(图12)。

表5

虽然已经参考具体特征详细描述了本发明，但对本领域技术人员应清楚的是，此描述仅针对优选实施方案，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等效物限定。

实用性

在通过使用胰蛋白酶将胰岛素原转化为活性形式的常规方法中，诸位发明人新开发的新型长效胰岛素类似物衍生物的白蛋白结合结构域也被切割，因此使得难以将所述新型长效胰岛素类似物衍生物转化为活性形式。为了克服这一困难，使用梭菌蛋白酶将根据本发明的胰岛素类似物衍生物转化为活性形式。因此，本发明的方法可以有效地用于产生用于治疗糖尿病的长效治疗剂。

文本文件

参见所附序列表。

<110> 株式会社大熊制药

<120> 使用梭菌蛋白酶制备长效胰岛素类似物缀合物的活性形式的方法

<130> PP-B2241

<150> KR 10-2018-0092244

<151> 2018-08-08

<160> 13

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合标签(Fusion Tag)

<400> 1

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala His His His His His His

1 5 10 15

Ser Ser Gly Ser Ala Arg

20

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 类人(homo sapiens)

<400> 2

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Lys Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

<210> 3

<211> 35

<212> PRT

<213> 类人(homo sapiens)

<400> 3

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly

1 5 10 15

Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu

20 25 30

Gln Ala Arg

35

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 类人(homo sapiens)

<400> 4

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Linker

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化白蛋白结合多肽(Engineered albumin binding polypeptide, ABD)

<400> 6

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45

<210> 7

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化白蛋白结合多肽

<400> 7

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45

<210> 8

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化白蛋白结合多肽

<400> 8

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45

<210> 9

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化白蛋白结合多肽

<400> 9

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45

<210> 10

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化白蛋白结合多肽

<400> 10

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45

<210> 11

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化白蛋白结合多肽

<400> 11

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45

<210> 12

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化白蛋白结合多肽

<400> 12

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45

<210> 13

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化白蛋白结合多肽

<400> 13

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45