一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的复合扩增体系及其使用的引物组合
阅读说明：本技术 一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的复合扩增体系及其使用的引物组合 (Composite amplification system for identifying whether body fluid to be detected is non-blood, menstrual blood or peripheral blood and primer combination used by same ) 是由 赵一霞 孙启凡 季安全 胡胜 于 2019-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的复合扩增体系及其使用的引物组合。该引物组合由序列表中的序列1至序列12所示的12种DNA分子组成。采用该引物组合构建复合扩增体系,可以鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血,且准确性较高。本发明为明确案件性质和定罪量刑等提供准确的科学依据,具有重要的应用价值。(the invention discloses a composite amplification system for identifying whether body fluid to be detected is non-blood, menstrual blood or peripheral blood and a primer combination used by the same. The primer combination consists of 12 DNA molecules shown in a sequence 1 to a sequence 12 in a sequence table. The primer combination is adopted to construct a composite amplification system, so that whether the body fluid to be detected is non-blood, menstrual blood or peripheral blood can be identified, and the accuracy is higher. The invention provides accurate scientific basis for determining case property, conviction and sentencing, and has important application value.)
技术领域
本发明属于法医技术学领域，具体涉及一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的复合扩增体系及其使用的引物组合。
背景技术
通过鉴别案发现场体液斑迹的组织来源，可推断样本组织来源及其真实犯罪活动，从而为案件定性及现场重建提供重要信息，为法庭科学提供重要的科学证据。案件现场常见的体液包括外周血、月经血、唾液、***、***分泌液等。其中，外周血和月经血虽然均含有大量红细胞，但与外周血相比，月经血中还含有大量的子宫内膜碎片、子***和***分泌物等混合物。现场血液类检材是属于外周血还是月经血是非常重要的法庭科学问题，往往对案件定性及重建案发现场、提供法庭证据具有十分重要的意义；尤其是针对性侵案件、女性失踪案以及某些伤害案中，女性受害者称因受暴力攻击出现血尿，在这种情况下，需要确定尿液中的血细胞来源是否存在月经血污染。因此，月经血与外周血的两种血液类体液间的鉴别区分仍是法医学体液鉴别的重点及难点。传统的血痕鉴定方法主要是生化和免疫学分析法，即利用血液中的血红蛋白及其衍生物进行鉴别，但此类方法不仅费时费力，而且非常消耗检材，容易出现假阳性或假阴性结果。从犯罪现场中获取的微量检材亟需一种更为灵敏、准确的鉴定方法进行鉴别。
大量研究表明，基于分子生物学水平的mRNA标记检测有望成为体液斑迹组织属性来源鉴定的有效方法。该方法依赖于不同体液中mRNA的独特表达谱来鉴定体液，具有特异性强、灵敏度高、只需要微量检材等优势，并且兼容当前的DNA/RNA共提技术，即从生物检材中同时提取DNA和mRNA，其中DNA用于多态分型，mRNA用于组织来源鉴定，既可提高工作效率，又使微量检材得到充分利用。欧洲DNA分型小组的研究表明，在没有RNA检测经验的实验室中依然可以用mRNA分析方法成功鉴定血迹，将不同体液混合后，进行RT-PCR复合扩增，成功获得各体液组织特异性的mRNA基因位点检测结果，并对体液来源进行了准确判断。
发明内容
本发明的目的是鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血。
本发明首先保护引物组合，可包括引物组合甲和引物组合乙。
所述引物组合甲可包括引物1、引物2、引物3和引物4；
所述引物1可为序列表中的序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2可为序列表中的序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3可为序列表中的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物4可为序列表中的序列4所示的单链DNA分子。
所述引物组合乙可包括引物5、引物6、引物7和引物8；
所述引物5可为序列表中的序列5所示的单链DNA分子；
所述引物6可为序列表中的序列6所示的单链DNA分子；
所述引物7可为序列表中的序列7所示的单链DNA分子；
所述引物8可为序列表中的序列8所示的单链DNA分子。
所述引物1、所述引物3、所述引物5和所述引物7均用荧光标记。
所述引物1、所述引物3、所述引物5和所述引物7的5’末端均用荧光标记。
所述荧光标记具体可为FAM标记。
所述引物组合甲具体可由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成。
所述引物组合乙具体可由所述引物5、所述引物6、所述引物7和所述引物8组成。
所述引物组合具体可由所述引物组合甲和所述引物组合乙组成。
本发明还保护所述引物组合甲。
本发明还保护所述引物组合乙。
上述任一所述引物组合还可包括引物组合丙；所述引物组合丙可包括引物9、引物10、引物11和引物12；
所述引物9可为序列表中的序列9所示的单链DNA分子；
所述引物10可为序列表中的序列10所示的单链DNA分子；
所述引物11可为序列表中的序列11所示的单链DNA分子；
所述引物12可为序列表中的序列12所示的单链DNA分子。
所述引物组合丙具体可由所述引物9、所述引物10、所述引物11和所述引物12组成。
所述引物组合具体可由所述引物组合甲、所述引物组合乙和所述引物组合丙组成。
上述任一所述引物组合甲还可包括所述引物组合丙。
所述引物组合甲具体可由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物组合丙组成。
上述任一所述引物组合乙还可包括所述引物组合丙。
所述引物组合乙具体可由所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8和所述引物组合丙组成。
上文中，引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6、引物7、引物8、引物9、引物10、引物11和引物12的摩尔比可为0.01：0.01：0.01：0.01：4.0：4.0：5.0：5.0：0.2：0.2：1.0：1.0。
本发明还保护一种复合扩增体系，包括上述任一所述引物组合、或、上述任一所述引物组合甲、或、上述任一所述引物组合乙。
所述复合扩增体系具体可由上述任一所述引物组合组成。
所述复合扩增体系具体可由上述任一所述引物组合甲组成。
所述复合扩增体系具体可由上述任一所述引物组合乙组成。
上述复合扩增体系中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述复合扩增体系中的浓度为0.01μM。所述引物5和所述引物6在所述复合扩增体系中的浓度为4.0μM。所述引物7和所述引物8在所述复合扩增体系中的浓度为5.0μM。所述引物9和所述引物10在所述复合扩增体系中的浓度为0.2μM。所述引物11和所述引物12在所述复合扩增体系中的浓度为1.0μM。
上述复合扩增体系中，所述复合扩增体系还可包括进行PCR扩增反应所需的试剂；所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。
所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”可包括DNA聚合酶、dNTP和Mg2+中的至少一种。所述DNA聚合酶在所述复合扩增体系中的浓度可为0.5U/μL。所述dNTP在所述复合扩增体系中的浓度可为0.2mmol/L(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为0.2mmol/L)。所述Mg2+在所述复合扩增体系中的浓度可为1.5mmol/L。
所述复合扩增体系具体可由上述任一所述引物组合和进行PCR扩增反应所需的试剂组成。
所述复合扩增体系具体可由上述任一所述引物组合甲和进行PCR扩增反应所需的试剂组成。
所述复合扩增体系具体可由上述任一所述引物组合乙和进行PCR扩增反应所需的试剂组成。
本发明还保护含有上述任一所述引物组合的试剂盒甲；所述试剂盒甲用于鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血。
本发明还保护含有上述任一所述引物组合甲的试剂盒乙；所述试剂盒乙用于鉴定待测体液为血液还是非血液。
本发明还保护含有上述任一所述引物组合乙的试剂盒丙；所述试剂盒丙用于鉴定待测血液为月经血还是外周血。
上述任一所述复合扩增体系、试剂盒甲、试剂盒乙或试剂盒丙的制备方法也属于本发明的保护范围。
上述任一所述复合扩增体系、试剂盒甲、试剂盒乙或试剂盒丙的制备方法，可包括将上述任一所述引物组合、上述任一所述引物组合甲或上述任一所述引物组合乙中的各条引物单独包装的步骤。
下述X1)或X2)或X3)也属于本发明的保护范围。
X1)上述任一所述引物组合、或、上述任一所述复合扩增体系(尤其指包括上述任一所述引物组合的复合扩增体系)在鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血中的应用。
X2)上述任一所述引物组合甲、或、上述任一所述复合扩增体系(尤其指包括上述任一所述引物组合甲的复合扩增体系)在鉴定待测体液为血液还是非血液中的应用。
X3)上述任一所述引物组合乙、或、上述任一所述复合扩增体系(尤其指包括上述任一所述引物组合乙的复合扩增体系)在鉴定待测血液为月经血还是外周血中的应用。
本发明还保护S1)或S2)或S3)。
S1)一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法，可包括如下步骤：以待测体液的cDNA为模板，分别采用引物对1、引物对2、引物对3和引物对4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述引物对1由所述引物1和所述引物2组成；所述引物对2由所述引物3和所述引物4组成；所述引物对3由所述引物5和所述引物6组成；所述引物对4由所述引物7和所述引物8组成；然后进行如下判断：
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中含有大小为159bp的DNA片段，采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中含有大小为272bp的DNA片段，则该待测体液为或疑似为月经血；
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中含有大小为159bp的DNA片段，采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中不含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中不含有大小为272bp的DNA片段，则该待测体液为或疑似为外周血；
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中不含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中不含有大小为159bp的DNA片段，采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中不含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中不含有大小为272bp的DNA片段，则该待测体液为或疑似为非血液。
S2)一种鉴定待测体液为血液还是非血液的方法，可包括如下步骤：以待测体液的cDNA为模板，分别采用所述引物对1和所述引物对2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中含有大小为159bp的DNA片段，则待测体液为或疑似为血液；
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中不含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中不含有大小为159bp的DNA片段，则该待测体液为或疑似为非血液。
S3)一种鉴定待测血液为月经血还是外周血的方法，可包括如下步骤：以待测血液的cDNA为模板，分别采用所述引物对3和所述引物对4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：
如果采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中含有大小为272bp的DNA片段，则该待测血液为或疑似为月经血；
如果采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中不含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中不含有大小为272bp的DNA片段，则该待测血液为或疑似为外周血。
本发明还保护T1)或T2)或T3)。
T1)一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法，可包括如下步骤：以待测体液的cDNA为模板，分别采用所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5和所述引物对6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中含有大小为159bp的DNA片段，采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中含有大小为272bp的DNA片段，采用所述引物对5得到的PCR扩增产物中含有大小为250bp的DNA片段，采用所述引物对6得到的PCR扩增产物中含有大小为291bp的DNA片段，则待测体液为或疑似为月经血；
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中含有大小为159bp的DNA片段，采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中不含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中不含有大小为272bp的DNA片段，采用所述引物对5得到的PCR扩增产物中含有大小为250bp的DNA片段，采用所述引物对6得到的PCR扩增产物中含有大小为291bp的DNA片段，则待测体液为或疑似为外周血；
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中不含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中不含有大小为159bp的DNA片段，采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中不含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中不含有大小为272bp的DNA片段，采用所述引物对5得到的PCR扩增产物中含有大小为250bp的DNA片段，采用所述引物对6得到的PCR扩增产物中含有大小为291bp的DNA片段，则待测体液为或疑似为非血液。
T2)一种鉴定待测体液为血液还是非血液的方法，可包括如下步骤：以待测体液的cDNA为模板，分别采用所述引物对1、所述引物对2、所述引物对5和所述引物对6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中含有大小为159bp的DNA片段，采用所述引物对5得到的PCR扩增产物中含有大小为250bp的DNA片段，采用所述引物对6得到的PCR扩增产物中含有大小为291bp的DNA片段，则待测体液为或疑似为血液；
如果采用所述引物对1得到的PCR扩增产物中不含有大小为243bp的DNA片段，采用所述引物对2得到的PCR扩增产物中不含有大小为159bp的DNA片段，采用所述引物对5得到的PCR扩增产物中含有大小为250bp的DNA片段，采用所述引物对6得到的PCR扩增产物中含有大小为291bp的DNA片段，则该待测体液为或疑似为非血液。
T3)一种鉴定待测血液为月经血还是外周血的方法，可包括如下步骤：以待测血液的cDNA为模板，分别采用所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5和所述引物对6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：
如果采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中含有大小为272bp的DNA片段，采用所述引物对5得到的PCR扩增产物中含有大小为250bp的DNA片段，采用所述引物对6得到的PCR扩增产物中含有大小为291bp的DNA片段，则该待测血液为或疑似为月经血；
如果采用所述引物对3得到的PCR扩增产物中不含有大小为126bp的DNA片段，采用所述引物对4得到的PCR扩增产物中不含有大小为272bp的DNA片段，采用所述引物对5得到的PCR扩增产物中含有大小为250bp的DNA片段，采用所述引物对6得到的PCR扩增产物中含有大小为291bp的DNA片段，则该待测血液为或疑似为外周血。
上述任一所述待测体液可为外周血、月经血、唾液、***或***分泌液。
上述任一所述待测血液可为外周血或月经血。
上述任一所述血液可为外周血或月经血。
上述任一所述非血液可为唾液、***或***分泌液。
上述任一所述PCR扩增产物可通过毛细管电泳检测。
在本发明的一个实施例中，从河南地区的80个志愿者(年龄在18-35周岁)中获得20份外周血样本、20份唾液样本、20份***样本、20份月经血样本和20份***分泌液样本。采用本发明提供的复合扩增体系对80个样本进行鉴定，结果如下：20份外周血样本中，75％以上的外周血样本可以检测到HBB基因、HBA基因、GAPDH基因和ACTB基因的表达，且任何外周血样本均没有MMP7基因和MMP10基因的表达；20份月经血样本中，75％以上的月经血样本可以检测到HBA基因、HBB基因、MMP7基因和GAPDH基因的表达，50％-75％的月经血样本可以检测到MMP10基因和ACTB基因的表达；20份***样本中，75％以上的***样本可以检测到GAPDH基因和ACTB基因的表达，且任何***样本均没有HBB基因、HBA基因、MMP7基因和MMP10基因的表达；20份唾液样本中，50％-75％的唾液样本可以检测到GAPDH基因和ACTB基因的表达，且任何唾液样本均没有HBB基因、HBA基因、MMP7基因和MMP10基因的表达；20份***分泌液样本中，50％以上的***分泌液样本可以检测到GAPDH基因和ACTB基因的表达，1份***分泌液样本可以检测到MMP10基因的表达，2份***分泌液样本可以检测到MMP7基因的表达。结果表明，本发明提供的复合扩增体系可以鉴定待测体液为血液、外周血还是月经血，还可以鉴定待测血液为外周血还是月经血，均具有较高的准确性。本发明为明确案件性质和定罪量刑等提供准确的科学依据，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为单重PCR扩增特异性检测。
图2为多重PCR扩增特异性检测。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，所有引物均有sangon公司合成。miRNeasy Mini Kit为德国Qiagen公司的产品。III First-Strand Synthesis System为美国Invitrogen公司的产品。HotstarTaq Polymerase为德国Qiagen公司的产品。Hi-Di甲酰胺、分子量内标LIZ600和3500XL遗传分析仪均为美国Applied Biosystems公司的产品。MastercyclerNexus PCR仪为德国Eppendorf公司的产品。Nanodrop 2000c紫外分光光度计为美国ThermoScientific公司的产品。
实施例1、基于6个基因的复合扩增体系的制备
一、特异表达基因的筛选
本发明的发明人通过查阅文献获得大量候选的在外周血、月经血、唾液、***、***分泌液中特异表达的基因，综合考虑各基因的序列结构，最终筛选获得4个特异表达基因(分别为HBA基因、HBB基因、MMP7基因、MMP10基因)和两个管家基因(分别为GAPDH基因和ACTB基因)。
二、基于6个基因的复合扩增体系的制备
依据各基因的核苷酸序列及扩增片段长度范围(在100bp-300bp之间)，合理选取不同扩增片段长度以区分各个基因，然后制备基于6个基因的复合扩增体系。具体步骤如下：
1、采用miRNeasy mini kit提取月经血的总RNA，然后用Nanodrop 2000c紫外分光光度计进行定量，同一样品重复三次计算平均值。
2、完成步骤1后，取月经血的总RNA，按照III First-Standsynthesissystem说明书的方法进行逆转录，得到月经血的cDNA。
逆转录反应体系为20μL，由200ng月经血的总RNA、1μL dNTP(浓度为2.5mmol/L)、1μL oligo(dT)(浓度为50μM)、2μL 10×RT Buffer、4μL Mg2+(浓度为25mmol/L)、2μL DTT(浓度为0.1mol/L)、1μL SuperScriptTMⅢRT(浓度为200U/μL)、1μLRNaseOUTTM(浓度为40U/μL)和去核酸酶的水组成。oligo(dT)、10×RT Buffer、SuperScriptTMⅢRT和RNaseOUTTM均为III First-Stand synthesis system中的组件。
逆转录反应程序：向月经血的总RNA中加入dNTP和oligo(dT)，然后65℃处理5min，冰上降温1min；之后加入其它试剂，混匀，置于Mastercycler Nexus PCR仪，50℃50min，85℃5min；之后置于冰上，加入1μL RNase H(浓度为2U/μL)，37℃20min。
加入RNase H的目的为消化未转录的RNA。
3、人工合成用于扩增各个基因的上游引物和下游引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；取96孔板，每孔加入PCR扩增产物0.5μL、分子量内标LIZ6000.5μL和Hi-Di甲酰胺9μL，混匀，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到检测图谱。电泳条件为：进样电压1.2kV，进样时间为30s。之后用GeneMapperID-X软件分析电泳检测结果，检测阈值为50。
PCR反应体系为20μL，由1μL月经血的cDNA、1μL10×PCR Buffer、0.2μLdNTP(浓度为2.5mmol/L)、0.6μL Mg2+(浓度为25mmol/L)、0.1μLHotstarTaq Polymerase(浓度为5U/μL)、1μL上游引物(浓度为10μM)、1μL下游引物(浓度为10μM)和5.1μL去离子水组成。10×PCRBuffer为HotstarTaq Polymerase中的组件。
PCR反应程序为：95℃15min；94℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，4℃保存。
通过上述步骤，获得各个基因的特异性引物。
4、综合每个基因的扩增条件，选择适宜扩增程序，然后进行复合扩增。复合扩增时，观察各个基因是否均有特异性产物和非特异产物的出现。如果不同基因引物之间产生非特异的杂峰，则需要一一排除，找出这些基因，重新设计并合成引物。此外，不同基因的引物之间还会形成引物二聚体，降低引物的扩增效率，也需要重新设计并合成引物。
5、反复测试、修改复合扩增体系，用复合扩增体系对月经血的cDNA进行扩增，观察各基因之间是否会有重叠，因为实际过程中会因为扩增产物的序列结构不一致而造成迁移速率偏快或偏慢，导致理论大小与实际大小不符，经常导致基因之间发生重叠或者距离过于接近，影响后续分析。一旦发生此类现象，则需要重新设计该基因引物，再经历步骤3和4，最终获得满足条件的复合扩增体系。
6、复合扩增体系的调平。具体为：初次复合扩增时，各个引物在反应体系中的浓度均为2μM；根据反应结果调整各个引物对的浓度。
7、优化复合扩增反应参数。用月经血的cDNA对反应体系中的关键组分和环节进行调整，如最优反应体系、扩增循环数、退火温度、延伸时间、HotstarTaq Polymerase用量、引物量、缓冲液浓度等等。
经过上述步骤，获得基于6个基因的复合扩增体系。该复合扩增体系由Buffer、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、引物混合物、待测体液的cDNA和水组成；引物混合物由12条引物混合而成；12条引物的名称、核苷酸序列、扩增片段的长度见表1中第1-5列。该复合扩增体系中，dNTP的浓度为0.2mmol/L(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为0.2mmol/L)，Mg2+的浓度为1.5mmol/L，12条引物的浓度见表1中第6列。其中DNA聚合酶为HotstarTaq Polymerase，在复合扩增体系中的浓度为0.5U/L；Buffer为10×PCR Buffer，10×PCR Buffer在复合扩增体系中的浓度为1×。
表1
注：FAM表示5’末端进行FAM标记。
三、单重PCR扩增特异性检测
1、HBB基因和HBA基因的特异性检测
(1)采用miRNeasy mini kit提取外周血的总RNA，然后用Nanodrop 2000c紫外分光光度计进行定量。
(2)完成步骤(1)后，取外周血的总RNA，按照III First-Standsynthesis system说明书的方法进行逆转录，得到外周血的cDNA。
(3)以外周血的cDNA的模板，采用引物对1(由引物1和引物2组成)或引物对2(由引物3和引物4组成)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(4)取96孔板，每孔加入PCR扩增产物0.5μL、分子量内标LIZ6000.5μL和Hi-Di甲酰胺9μL，混匀，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到检测图谱。电泳条件为：进样电压1.2kV，进样时间为30s。之后用GeneMapperID-X软件分析电泳检测结果，检测阈值为50。
2、MMP7基因、MMP10基因、GAPDH基因和ACTB基因的特异性检测
(1)采用miRNeasy mini kit提取月经血的总RNA，然后用Nanodrop 2000c紫外分光光度计进行定量。
(2)完成步骤(1)后，取月经血的总RNA，按照III First-Standsynthesis system说明书的方法进行逆转录，得到月经血的cDNA。
(3)以月经血的cDNA的模板，采用引物对3(由引物5和引物6组成)、引物对4(由引物7和引物8组成)、引物对5(由引物9和引物10组成)或引物对6(由引物11和引物12组成)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(4)取96孔板，每孔加入PCR扩增产物0.5μL、分子量内标LIZ6000.5μL和Hi-Di甲酰胺9μL，混匀，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到检测图谱。电泳条件为：进样电压1.2kV，进样时间为30s。之后用GeneMapperID-X软件分析电泳检测结果，检测阈值为50。
检测结果见图1(a为HBB基因，b为HBA基因，c为MMP7基因，d为MMP10基因，e为GAPDH基因，f为ACTB基因)。结果表明，各个引物对均检测到了特异峰，具有特异性。
四、多重PCR扩增特异性检测
1、外周血样本
(1)采用miRNeasy mini kit提取外周血的总RNA，然后用Nanodrop 2000c紫外分光光度计进行定量。
(2)完成步骤(1)后，取外周血的总RNA，按照III First-Standsynthesis system说明书的方法进行逆转录，得到外周血的cDNA。
(3)取9μL实施例1步骤二中3制备的复合扩增体系，加入1μL外周血的cDNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(4)取96孔板，每孔加入PCR扩增产物0.5μL、分子量内标LIZ6000.5μL和Hi-Di甲酰胺9μL，混匀，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到检测图谱。电泳条件为：进样电压1.2kV，进样时间为30s。之后用GeneMapperID-X软件分析电泳检测结果，检测阈值为50。
检测结果见图2中a。结果表明，外周血中表达HBB基因、HBA基因、GAPDH基因和ACTB基因。
2、月经血样本
按照步骤1的方法，将外周血替换为月经血，其它步骤均不变。
检测结果见图2中b。结果表明，月经血中表达HBB基因、HBA基因、MMP7基因、MMP10基因、GAPDH基因和ACTB基因。由于月经血成分复杂，其中混有大量血细胞，因此在月经血样本中检测到HBB基因和HBA基因呈阳性符合预期结果。
3、***样本
按照步骤1的方法，将外周血替换为***，其它步骤均不变。
检测结果见图2中c。结果表明，***中仅表达GAPDH基因和ACTB基因。
4、***分泌液样本
按照步骤1的方法，将外周血替换为***分泌液，其它步骤均不变。
检测结果见图2中d。结果表明，***分泌液中仅表达GAPDH基因和ACTB基因。
5、唾液样本
按照步骤1的方法，将外周血替换为唾液，其它步骤均不变。
检测结果见图2中e。结果表明，唾液中仅表达GAPDH基因和ACTB基因。
实施例2、基于6个基因的复合扩增体系在鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血中的应用
1、样本采集
待测样本为来自河南地区的80个志愿者(年龄在18-35周岁)提供的80份样本。80个志愿者为无关个体，且均知情同意。
样本编号为PB1-PB20的20份样本均为外周血样本。外周血样本为抽取部分志愿者手臂处静脉血获得，-80℃保存。
样本编号为MB1-MB20的20份样本均为月经血样本。20份月经血样本为部分志愿者用卫生棉条在***前4天采集，室温晾干1天后-80℃保存。
样本编号为SA1-SA20的20份样本均为唾液样本。20份唾液样本为将部分志愿者唾液收集在无菌塑料管中获得(收集前志愿者禁食1h)，-80℃保存。
样本编号为SE1-SE20的20份样本均为***样本。20份***样本为将部分志愿者新鲜***收集在无菌广口塑料杯中获得(收集前志愿者禁欲2天)，-80℃保存。
样本编号为VA1-VA20的20份样本均为***分泌液样本。20份***分泌液样本为部分志愿者用卫生棉条在在非月经期采集，室温晾干1天后-80℃保存。
2、采用miRNeasy mini kit分别提取待测样本的总RNA，然后用Nanodrop 2000c紫外分光光度计进行定量。
3、分别取待测样本的总RNA，按照III First-Stand synthesissystem说明书的方法进行逆转录，得到待测样本的cDNA。
4、取9μL实施例1步骤二中3制备的复合扩增体系，加入1μL待测样本的cDNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
5、取96孔板，每孔加入PCR扩增产物0.5μL、分子量内标LIZ6000.5μL和Hi-Di甲酰胺9μL，混匀，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到检测图谱。电泳条件为：进样电压1.2kV，进样时间为30s。之后用GeneMapperID-X软件分析电泳检测结果，检测阈值为50。
统计结果见表2。结果表明，20份外周血样本中，75％以上的外周血样本可以检测到HBB基因、HBA基因、GAPDH基因和ACTB基因的表达，且任何外周血样本均没有MMP7基因和MMP10基因的表达；20份月经血样本中，75％以上的月经血样本可以检测到HBA基因、HBB基因、MMP7基因和GAPDH基因的表达，50％-75％的月经血样本可以检测到MMP10基因和ACTB基因的表达；20份***样本中，75％以上的***样本可以检测到GAPDH基因和ACTB基因的表达，且任何***样本均没有HBB基因、HBA基因、MMP7基因和MMP10基因的表达；20份唾液样本中，50％-75％的唾液样本可以检测到GAPDH基因和ACTB基因的表达，且任何唾液样本均没有HBB基因、HBA基因、MMP7基因和MMP10基因的表达；20份***分泌液样本中，50％以上的***分泌液样本可以检测到GAPDH基因和ACTB基因的表达，1份***分泌液样本可以检测到MMP10基因的表达，2份***分泌液样本可以检测到MMP7基因的表达，这可能是由于部分样本的采集时间处于经期前后，使样本受少量月经血污染所致。管家基因GAPDH、ACTB在不同体液中的检出率存在较大差异。
表2
注：20为样本个数，“/”前的数字为毛细管电泳检测出峰的样本数。
上述结果表明，实施例1制备的复合扩增体系可以鉴定样本为血液还是非血液，还可以鉴定待测血液为外周血还是月经血，具有较高的准确性。
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的复合扩增体系及其使用的引物组合
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>1
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<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>2
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<210>3
<211>22
<212>DNA
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<210>4
<211>22
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<211>21
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<400>5
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<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>6
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<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>7
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<210>8
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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<213>Artificial sequence
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<213>Artificial sequence
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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