一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体
阅读说明：本技术 一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体 (Composite exosome of load membrane-bound tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and small-molecule antitumor drug ) 是由 刘继勇 姜良弟 顾永卫 武鑫 杜月 李爱雪 赵语南 唐晓萌 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药与肿瘤学技术领域,具体是一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体及其制备方法和应用。所述的复合外泌体的膜表面携带TRAIL蛋白,膜内包载小分子抗肿瘤药物。本发明的复合外泌体制备工艺成熟、高效、重现性好、成本低；复合外泌体的体外和体内抗肿瘤效果显著,药物用量低且无毒副作用,生物安全性良好,为肿瘤临床治疗提供了新的策略。(The invention relates to the technical field of biomedicine and oncology, in particular to a composite exosome of a load membrane-bound tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and a small-molecule antitumor drug, and a preparation method and application thereof. The membrane surface of the compound exosome carries TRAIL protein, and small-molecule antitumor drugs are encapsulated in the membrane. The preparation process of the composite exosome is mature, efficient, good in reproducibility and low in cost; the compound exosome has obvious in-vitro and in-vivo anti-tumor effects, low drug dosage, no toxic or side effect and good biological safety, and provides a new strategy for clinical tumor treatment.)
技术领域
本发明涉及生物医药与肿瘤学技术领域，具体地说，是一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤恶性黑色素瘤是一种由皮肤和其他器官的黑色素细胞产生的恶性肿瘤，约占全部肿瘤3％，具有较强的侵袭性和转移性；发病率高，预后差，晚期黑色素瘤死亡率高达70～90％，居皮肤恶性肿瘤首位。根据2021年美国癌症协会的统计数据，2020年全球皮肤原位黑色素瘤新增诊断病例106110例，死亡病例7180例，并以每年3～5％的速度增长，成为全球增速最快的恶性肿瘤之一，晚期黑色素瘤五年生存率仅为25％。目前恶性黑色素瘤的治疗方法主要有化疗、放疗、手术切除、免疫疗法和靶向治疗等。化疗仍是目前治疗黑色素瘤的主要方法，主要化疗药物包括达卡巴嗪、替莫唑胺、卡铂、紫杉醇、福莫司汀和顺铂等，但在黑色素瘤中的单药或联合用药有效率均不高，约10～15％，而且损伤人体正常免疫功能和产生严重的毒副作用。因此，亟需新型、有效且安全的黑色素瘤治疗方法。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)属于肿瘤坏死因子超家族成员，对多种人源肿瘤细胞有促凋亡效果，包括黑色素瘤、肺癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌和胆管癌。
死亡受体5(Death receptor 5，DR5)是TRAIL的主要作用受体，在多种肿瘤细胞表面高表达，而在正常细胞中低表达或不表达。DR5含有死亡结构域(Death domain，DD)，与TRAIL结合后，通过DD与Fas相关死亡功能域蛋白(Fas-associated death domainprotein，FADD)结合，募集pro-caspase 8，生成死亡诱导信号复合体(Death inducingsignaling complex，DISC)，DISC中的pro-caspase 8自我剪切成具有活性的caspase 8，通过caspase级联反应和线粒体依赖途径激活caspase 3，从而介导细胞凋亡。
目前基于TRAIL的疗法包括重组人可溶性TRAIL(Recombinant human TRAIL，rhTRAIL)，并已经用于多种人源肿瘤的临床前研究和临床试验中。但rhTRAIL的肿瘤靶向性差，体内半衰期短，易引起细胞耐药性，导致疗效较差。因此，鉴于rhTRAIL的不足，需要开发有效安全的TRAIL递送形式，以规避TRAIL抗性和提高疗效。
巨噬细胞作为天然的免疫细胞和抗原呈递细胞，在调节肿瘤免疫微环境中发挥重要作用。M1型巨噬细胞，如Raw264.7，可与肿瘤组织特异性结合，因此，被广泛用于肿瘤靶向治疗。M1型巨噬细胞肿瘤靶向能力来自其表面膜蛋白，同时其产生的外泌体具有与巨噬细胞相似的表面膜特性，并保留细胞的靶向能力和肿瘤渗透能力。此外，外泌体可以作为一种天然的内源性纳米载体，也具有其他独特优势，如稳定性高、毒性小、免疫原性低、生物相容性好；肿瘤渗透性强，可透过血脑屏障；可递送多种治疗药物，如膜蛋白、miRNA、siRNA和小分子化学药物。研究发现，膜结合型TRAIL可以增加其稳定性和提高生物利用度和靶向性，并表现出比rhTRAIL更强的促凋亡活性，这可能由于膜结合型TRAIL超分子结构中形成寡聚促进了DR5的受体聚簇，增强了凋亡诱导效率和信号的传导。
雷公藤甲素(Triptolide，TPL)具有抗氧化、抗炎、抗生育、抗类风湿、神经保护、免疫抑制及多靶点抗肿瘤特性。此外，研究证明TPL比其他常规化疗药更有效，即使在高度耐药的细胞中，TPL在纳摩尔浓度下也能显示出强大的抗肿瘤活性。TPL对恶性黑色素瘤在体内和体外均有一定的抗治疗效果。口服羟基雷公藤内酯醇片和可溶性注射用雷公藤甲素衍生物明尼甲素(Minnelide)也已进入临床试验阶段。
但是关于一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有TRAIL和TPL在恶性黑色素瘤治疗中的不足，提供一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体及其制备方法和应用。所述的复合外泌体为具有靶向性和促凋亡能力的载药外泌体，其所包载的小分子抗肿瘤药物TPL能协同增强TRAIL对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用而对正常组织器官无明显毒性，为恶性黑色素瘤的临床治疗提供了可靠的理论依据和实验基础。
经TRAIL修饰的外泌体同时递送小分子抗肿瘤药物TPL既能克服TRAIL和TPL的耐药性、体内不稳定性和生物利用率低等不足，同时通过两者联用产生协同抗肿瘤效应，增强靶向性和促进肿瘤凋亡效果，降低TPL的毒副作用，因而具有极大的临床应用潜力。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体，外泌体的膜表面携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，膜内包载小分子抗肿瘤药物。
进一步的，所述的复合外泌体是先以过表达膜结合型TRAIL基因的病毒表达载体转染外泌体的供体细胞，获得稳定过表达TRAIL的供体细胞系；然后从过表达TRAIL的供体细胞培养上清中分离纯化外泌体，得到高纯度表达携带TRAIL的外泌体(TRAIL-Exo)，再将小分子抗肿瘤药物载入外泌体膜中制得。
进一步的，所述的复合外泌体中TRAIL蛋白的浓度为205.1±13.6pg/mL；所述的复合外泌体平均粒径为100～200nm；所述的小分子抗肿瘤药物的浓度为0.01～60μg/mL。
进一步的，所述的病毒表达载体为慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。
更进一步的，所述的过表达膜结合型TRAIL基因的病毒表达载体转染外泌体供体细胞的制备方法，包括：将带有TRAIL基因的慢病毒感染外泌体供体细胞，得到稳定过表达TRAIL蛋白的细胞系。在本发明的一个优选实施方式中，包括：构建慢病毒包装三质粒系统，所述的慢病毒包装三质粒系统的组成包括pSPAX2、pMD2G和携带TRAIL基因的穿梭质粒。用所述的慢病毒包装三质粒系统瞬时转染293T细胞，得到含TRAIL基因的慢病毒颗粒，再用慢病毒颗粒感染外泌体供体细胞。
进一步的，所述的供体细胞选自Raw264.7细胞、自然杀伤细胞、T细胞和树突状细胞中的一种。在本发明的一个优选实施方式中，所述的供体细胞为Raw264.7细胞。
进一步的，所述的小分子抗肿瘤药物为天然药物。
更进一步的，所述的天然药物为雷公藤甲素TPL。
本发明的第二方面，提供一种如上所述的负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体的制备方法，包括以下步骤：
S1.构建过表达膜结合型TRAIL基因的病毒表达载体，经病毒包装瞬转293T细胞，获得病毒颗粒，再用纯化的病毒颗粒感染巨噬细胞Raw264.7，获得稳定过表达TRAIL的巨噬细胞系，标记为TRAIL-Raw264.7；
S2.采用梯度超速离心法，从TRAIL-Raw264.7细胞培养上清中分离纯化外泌体，得到高纯度表达携带TRAIL的外泌体，标记为TRAIL-Exo；
S3.将小分子抗肿瘤药物TPL载入TRAIL-Exo，得到负载TRAIL和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体(TRAIL-Exo/TPL)；所述的复合外泌体的膜表面携带促肿瘤凋亡蛋白TRAIL，膜内包载小分子抗肿瘤药物TPL。
进一步的，步骤S3中所述的将小分子抗肿瘤药物TPL载入TRAIL-Exo的方法为超声法、电穿孔法或共孵育法。
在一些较为优选的实施方案中，所述的制备方法包括以下步骤：
S1.构建慢病毒包装三质粒系统，使所述的慢病毒包装三质粒系统感染293T细胞，得到带有目的基因的慢病毒颗粒。
S2.用含目的基因的慢病毒颗粒感染Raw264.7细胞，获得稳定过表达TRAIL的巨噬细胞系，标记为TRAIL-Raw264.7，从而使Raw264.7细胞分泌表达携带TRAIL的外泌体。进一步地，所述慢病毒包装三质粒系统的组成包括pSPAX2、pMD2G和携带目的基因的穿梭质粒。其中，慢病毒三质粒系统感染293T细胞，能包装产生更多带有TRAIL基因的慢病毒。利用包装完成的慢病毒颗粒感染巨噬细胞Raw264.7，使巨噬细胞在膜上过表TRAIL蛋白，从而使其分泌表达携带TRAIL的外泌体。
S3.采用梯度超速离心法，从TRAIL-Raw264.7细胞培养上清中提取细胞分泌的外泌体，得到高纯度表达携带TRAIL的外泌体，标记为TRAIL-Exo；
S4.将小分子抗肿瘤药物TPL载入TRAIL-Exo，得到载有TRAIL和小分子抗肿瘤药物TPL的复合外泌体(TRAIL-Exo/TPL)；所述复合外泌体的膜表面表达携带促肿瘤凋亡蛋白TRAIL，膜内包裹小分子抗肿瘤药物TPL。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。
进一步的，所述的恶性肿瘤为皮肤恶性黑色素瘤。
与现有技术相比，本发明优点在于：
1、与仅负载TRAIL的外泌体或单纯小分子抗肿瘤药物TPL相比，本发明中用外泌体同时递送TRAIL和小分子抗肿瘤药物，增强了外泌体的肿瘤靶向性和TRAIL的促凋亡能力，提高了TPL的肿瘤杀伤活性，降低了对正常组织的毒副作用，显著提高了抗肿瘤治疗效果。
2、本发明中的负载膜结合型TARIL和小分子抗肿瘤药物TPL的复合外泌体可达到协同增效的目的，两者联用显著增强了对肿瘤细胞的杀伤效果。体内实验结果表明该复合外泌体能够有效抑制皮下恶性黑色素瘤生长，同时具有良好的生物安全性。
3、本发明中TRAIL和TPL能够通过调控外源性凋亡途径和内源性凋亡途径协同诱导细胞凋亡。体外实验结果表明该复合外泌体能够显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭和迁移。体内实验结果表明尾静脉注射复合外泌体后，裸鼠皮下异种移植瘤生长受到显著抑制，肿瘤组织发生明显病理损伤和凋亡，且未观察到对重要器官的任何毒性。
4、本发明阐述了复合外泌体协同抗肿瘤的作用机制，为相关疾病提供了新的治疗策略。
5、本发明的制备工艺成熟、高效、重现性好、成本低；复合外泌体的体外和体内抗肿瘤效果显著，药物用量低且无毒副作用，生物安全性良好，为黑色素瘤的临床治疗提供了新的策略。
附图说明
图1为实施例1构建的含TRAIL基因的慢病毒表达载体图谱；
图2中各图分别为实施例4建立的过表达TRAIL的Raw264.7细胞的荧光成像图(a)、RT-qPCR相对表达定量图(b)、蛋白质印迹图(c)和TRAIL流式检测图(d)、TRAIL表达浓度(e)；
图3中各图分别为实施例5获得的TRAIL-Exo的透射电镜图(a)、粒径分布图(b)、蛋白质印迹图(c)、免疫电镜图(d)、流式图(e)和TRAIL表达浓度(f)；
图4中各图分别为实施例5获得的TRAIL-Exo细胞摄取激光共聚焦成像图(a)、激光共聚焦细胞平均荧光强度(b)、流式摄取图(c)和流式细胞平均荧光强度(d)；
图5为实施例7中的BCA蛋白标准曲线图；
图6为实施例7中的TPL标准曲线图；
图7中各图分别为实施例7制备的TRAIL-Exo/TPL的透射电镜图(a)、粒径分布图(b)和TRAIL流式检测图(c)；
图8为人恶性黑色素瘤A375细胞经不同制剂处理24h后的细胞活力检测；
图9中(a)为A375细胞经不同制剂处理后的凋亡流式图；(b)为A375细胞经不同制剂处理后的凋亡率；
图10中(a)为A375细胞经不同制剂处理后的Transwell侵袭图；(b)为A375细胞经不同制剂处理后的相对侵袭率；
图11中(a)为A375细胞经不同制剂处理后的迁移图；(b)为A375细胞经不同制剂处理后的迁移率；
图12为实施例12中TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL体内抗黑色素瘤效果图，包括尾静脉注射不同制剂后裸鼠的实体瘤图(a)、肿瘤生长曲线图(b)、肿瘤质量图(c)、抑瘤率(d)和体重变化图(e)；
图13为尾静脉注射不同制剂后裸鼠的肿瘤组织H&E、TUNEL免疫荧光和Ki67免疫组化图；
图14为尾静脉注射不同制剂后裸鼠的心、肝、脾、肺、肾H&E染色图；
图15中各图分别为TRAIL-Exo/TPL调控凋亡通路相关蛋白表达的蛋白质印迹图(a)及其促进肿瘤细胞凋亡的分子机制示意图(b)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：构建过表达TRAIL慢病毒载体
将TRAIL(Homo sapiens TNF superfamily member 10，TNFSF10)核苷酸序列(NM_003810)合成至pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO慢病毒表达载体上。具体过程如下：选择载体酶切体系→载体37℃酶切，胶回收→片段PCR回收→将TRAIL的核苷酸序列与慢病毒表达载体连接反应体系置于50℃温浴20min→转化(感受态细胞DH 5a；抗性：氨苄青霉素，37℃，230rpm，24h)→对转化后的平板挑菌，37℃，250rpm摇菌14h→菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液进行过表达测序。
图1为实施例1中构建的TRAIL慢病毒表达载体图谱。
实施例2：慢病毒包装
用质粒DNA抽提试剂盒大量抽提构建好的慢病毒表达载体和辅助质粒，质粒浓度需大于1μg/μL，A260/280在1.7～1.8之间可用于病毒包装。将293T细胞消化，离心，用完全培养液重悬，按1：10传代分到培养皿中，置于培养箱中继续培养。待293T细胞密度达到70～80％即可进行转染。将培养液换成无血清培养基，做脂转complex：10μg pSPAX2，5μgpMD2G，含目的基因的穿梭质粒10μg，75μL LipofiterTM试剂。转染6h后，更换为含10％FBS的完全培养液。转染后48h和72h分别两次收集病毒上清。在48h收毒时，将培养皿中的培养基倒入离心管中，随后补入完全培养基，置于恒温养箱中继续培养。在72h收毒时，直接将培养皿中的培养基倒入离心管中。将含病毒的上清，1000～2000×g离心5～10min；然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4℃，80000～100000×g，离心60～120min，最后将慢病毒超离液分装到病毒管中，-80℃冰箱保存。
实施例3：病毒滴度检测
将293T细胞消化计数后稀释至1～3×105/mL,加入96孔板，100μL/孔，为每个病毒准备6个孔。次日，准备6个1.5mL EP管，第一个EP管中加入10μL病毒液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度。第三天，有需要加嘌呤霉素筛选的孔，先吸去100μL含慢病毒颗粒的培养基，再加入100μL含嘌呤霉素的完全培养基。第五天，在荧光显微镜下观察，在观察前6h需更换新鲜完全培养基，从孔中吸出80μL培养基，然后加入80μL新鲜完全培养基，放入培养箱中培养。6h后荧光显微镜下观察结果，选择荧光百分比在10～50％的孔计算病毒滴度。经计算，实施例3中的病毒滴度为1.5×108TU/mL。
实施例4：稳定过表达TRAIL巨噬细胞系的建立及鉴定
1.待Raw264.7细胞长满后，消化、离心、重悬，调整细胞密度为1～5×105/mL，接种于6孔板，置于培养箱中待其长至密度约为60％时开始感染。每孔加入1～5mL(最优为2mL)病毒原液，同时加入2～20μg/mL聚凝胺(最优为5μg/mL)。感染24h后，吸去病毒原液，加入完全培养基。病毒感染48h后待细胞的融合率达到90％，进行传代。
2.将Raw264.7细胞接种于24孔板，待融合率约为60％时，更换含0.2～10μg/mL(最优为2μg/mL)嘌呤霉素的完全培养基，处理细胞24～48h。待细胞密度达到70～80％时传代，继续用含嘌呤霉素的完全培养基培养。感染4天后，更换新鲜完全培养基继续培养2天，进行细胞传代培养，即得到过表达TRAIL的Raw264.7巨噬细胞系(TRAIL-Raw264.7)。
3.总RNA提取：待TRAIL-Raw264.7细胞在6孔板中长满后，吸去培养液，每孔加入适量Trizol试剂提取细胞总RNA。将裂解液移入离心管中，室温放置10～15min。加入200μL氯仿，震荡混匀，室温放置10～15min。13780×g离心10min，吸取上层清液至离心管中，加入等体积的异丙醇，室温沉淀10min。13780×g离心15min，弃上清。加入75％乙醇洗涤沉淀1次。13780×g离心5min，弃上清并回收沉淀。常温倒置晾干10min。用DEPC-H2O溶解沉淀，混匀后-80℃保存备用。用紫外可见分光光度计测定其在260nm和280nm波长下的吸光度，计算细胞总RNA浓度。
4.反转录：使用ReverTraqPCR RT Kit逆转录反应试剂盒逆转录RNA。反转录反应条件为37℃，20min和95℃，5min。反转录反应体系如下：
5.Real-time qPCR(RT-qPCR)：使用Hanbio miRNA qPCR Detection Primer kit试剂盒检测miRNA。用LightCycler 96实时荧光定量PCR仪进行TRAIL基因检测，并计算表达水平。引物序列如下：
RT-qPCR反应体系如下：
RT-qPCR反应条件如下：
4.Western blot检测：将过表达TRAIL-Raw264.7细胞接种于6孔板，待贴壁后，弃上清，PBS洗涤3遍，加入适量PMSF，加入RIPA裂解液。用刮刀将细胞刮下，收集到离心管中。12000rpm离心10min，收集上清，得总蛋白溶液。用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。将蛋白样本按体积比1：1加入2×上样缓冲液，煮沸变性15min。配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，将20μL蛋白样本加入上样孔，电泳30min。将甲醇活化的PVDF膜盖于胶上，恒流转膜30min。将膜置于摇床上用5％脱脂牛奶封闭1h，加入anti-TRAIL一抗(1：1000，Abcam)4℃孵育过夜。加入HRP goat anti-rabbit IgG二抗(1：3000，Abcam)，室温下孵育1h，将膜加入ECL试剂反应2min后曝光。曝光后的胶片进行显影成像。
5.流式检测：将6孔板中的TRAIL-Raw264.7细胞消化离心，用PBS重悬，调整细胞密度为1×107/mL。取100μL细胞悬液，加入5μL PE anti-human TRAIL Antibody染色液，混匀。对照管加入20μL PE Mouse IgG1同型对照抗体染色液，避光染色15min。各管加入2mLPBS洗涤细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用400μL PBS重悬，转移至5mL流式管中，用流式细胞仪检测TRAIL阳性率。
6.ELISA检测：依次配制浓度为0、15.9、31.2、62.50、125.00、250.00、500.00、1000.00pg/mL的TRAIL蛋白标准溶液。将TRAIL-Raw264.7细胞消化、离心、重悬，反复冻融3次，10 000×g离心5min，收集细胞上清。将以上TRAIL蛋白标准溶液和细胞上清各取100μL分别加入anti-human TRAIL预包被的96孔酶标板中，室温下孵育120min(或37℃孵育90min)。弃上清，向每孔中加入100μL 1×Biotinylated anti-human TRAIL antibody，室温下孵育90min(或37℃孵育60min)。用1×Wash Buffer洗板3次，每孔加入100μL1×Avidin-Biotin-Peroxidase Complex，在室温下孵育40min(或在37℃孵育30min)。用1×Wash Buffer洗板5次，每孔中加入90μL Color Developing Reagent，室温下避光孵育30min(或在37℃下孵育15～25min)。每孔中加入100μL终止溶液，反应30min，在450nm波长下测定每孔的吸光度值，计算TRAIL-Raw264.7细胞中TRAIL的表达水平。
图2中各图分别为实施例4建立的过表达TRAIL的Raw264.7细胞的荧光显微镜图(a)、TRAIL的RT-qPCR表达相对定量(b)、TRAIL蛋白质印迹图(c)、TRAIL流式图(d)和TRAIL表达浓度(e)。由图可知，经过表达TRAIL慢病毒表达载体转染和嘌呤霉素筛选后的Raw264.7细胞生长状态良好(图2(a))。TRAIL基因在转染的Raw264.7细胞中有过表达效果(图2(b))。TRAIL在转染的Raw264.7细胞中有表达(图2(c))。转染的Raw264.7细胞表面TRAIL阳性率较高(图2(d))，同时也有较高的TRAIL表达浓度，为125.3±10.5pg/1μg蛋白(图2(e))，进一步证明了TRAIL在转染的Raw264.7细胞中表达，表明过表达TRAIL-Raw264.7稳转细胞系构建成功。
实施例5：TRAIL-Exo的提取与表征
1.外泌体提取：待TRAIL-Raw264.7细胞达到80％的汇合度后，弃去培养液，PBS洗3遍，添加含10％无外泌体血清的完全培养液继续培养24～48h，收集上清。先将上清液以300×g离心10min除去活细胞；再以2000×g离心10min除去死细胞；然后以10 000×g离心30min以去除细胞碎片。将上清液以120 000×g离心70min，得到杂蛋白和外泌体沉淀。将沉淀重悬于PBS中，120000×g再次离心70min，除去杂蛋白。最后将外泌体沉淀重悬于PBS中，并保存在-80℃冰箱中。所有离心程序均在4℃下进行。
2.透射电镜：用2％多聚甲醛重悬外泌体，取5～10μL外泌体悬液滴到Formvar-carbon铜网上，室温放置10min；PBS洗涤2次，每次3min。将铜网置于50μL 0.3％醋酸双氧铀液滴上负染5min；将铜网置于100μL PBS液滴上清洗1min，洗涤3次。再置于2％甲基纤维素液滴上10min。待自然晾干后，用透射电镜在80kV电压下观察并拍摄外泌体形态。
3.免疫电镜：用2％多聚甲醛重悬外泌体，取5～10μL外泌体悬液滴到Formvar-carbon铜网上，室温放置10min。PBS洗涤2次，每次3min。将网格转移到50mM甘氨酸中孵育3min。用1％BSA封闭缓冲液封闭网格10min。将5μL稀释后的TRAIL一抗(1:100)滴加至网格上，并孵育30min.将网格转移到PBS中洗涤5次，每次3min。用稀释后的5nm胶体金偶联山羊抗小鼠IgG(1:50)孵育20min。将网格用PBS洗涤8次，每次2min。将网格置于1％戊二醛液滴中固定5min。将网格置于到100μL蒸馏水上，洗涤8次，每次2min。将铜网置于50μL 0.3％醋酸双氧铀液滴上负染5min；将铜网置于100μL PBS液滴上清洗1min，洗涤3次。再置于2％甲基纤维素液滴上10min。待自然晾干后，用透射电镜在80kV电压下观察并拍摄外泌体形态。
4.粒径测定：取适量外泌体用1mL PBS稀释，将其置于比色皿中，在室温下用马尔文激光粒度仪对其粒径进行检测。
5.Western blot检测：将适量的PMSF加入外泌体，再加入适量RIPA裂解液并在冰上充分裂解，100 000×g离心1h，取上清。配制12％分离胶和配制5％浓缩胶，待胶凝固。将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳缓冲液。取外泌体悬液，与等体积2×上样缓冲液混合，煮沸变性5min。每孔加上样液20μg，设置70V恒压。当指示剂溴芬兰进入分离胶后改用90V恒压电泳。当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。预先将PVDF膜用甲醇活化，用ddH2O洗膜，将胶浸泡于转移缓冲液中平衡15min。按黑面(负极)→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵→红面(正极)的顺序制备转膜“三明治”。200mA恒流转膜70min。转膜结束后，取出PVDF膜，用5％BSA室温封闭PVDF膜2h，用TBST缓冲液在摇床上洗膜5min×3次。分别加入稀释的Anti-CD9一抗(Abcam，1：2000)、Anti-CD63一抗(Abcam，1：1000)、Anti-TSG101一抗(Abcam，1：1000)、Anti-TRAIL一抗(Abcam，1：1000)，4℃孵育过夜。之后置于摇床上用TBST缓冲液洗膜5min×3次。加入HRP Goat anti-Rabbit二抗(Abcam，1：2000)室温孵育2h。再置于摇床上用TBST缓冲液洗膜10min×3次。将膜用ECL化学发光试剂盒反应2min，对PVDF膜进行曝光，用ChemiDoc成像系统进行成像。
6.流式检测：取100μL TRAIL-Exo溶液，加入5μL PE anti-human TRAIL antibody染色液，对照管加入20μL PE mouse IgG1同型对照抗体染色液。避光4℃孵育15min后，加入2mL PBS洗涤2次，120 000×g离心70min，弃上清，用400μL PBS重悬，转移至5mL流式管中，上流式细胞仪检测。
7.TRAIL浓度测定：按照实施例4中的方法使用ELISA试剂盒对TRAIL-Exo中的TRAIL的表达水平进行测定。
图3中各图分别为实施例5获得的TRAIL-Exo的透射电镜图(a)、粒径分布图(b)、蛋白免疫印迹图(c)、免疫电镜图(d)、流式图(e)和TRAIL表达浓度(f)。经梯度超速离心分离得到的细胞外囊泡呈典型的茶托样或球形结构(图3(a))。平均粒径为100nm，粒径分布均匀(图3(b))。可明显地检测到外泌体特异性蛋白CD9、CD63、TSG101以及TRAIL的表达(图3(c))，这些结果均符合外泌体特征范畴。免疫电镜图更直观地显示出纳米金颗粒可附着在外泌体膜外表面，外泌体的形态也未发生明显改变(图3(d))。TRAIL-Exo与TRAIL抗体的阳性结合率超过95％(图3(e))，同时TRAIL-Exo也具有较高的TRAIL表达浓度，为205.1±13.6pg/1μg外泌体蛋白(图3(f))。这些结果表明转染TRAIL巨噬细胞分泌的外泌体的膜表面可以表达或携带TRAIL，TRAIL-Exo成功获取。
实施例6：细胞摄取实验
1.PKH67荧光标记：用Diluent C稀释TRAIL-Exo溶液。取适量PKH67染色液加入Diluent C稀释液，按体积比1：1将稀释后的TRAIL-Exo和染色液混合，避光放置1-5min。用1％BSA溶液终止染色，用超滤离心管(100kDa)，分离得到PKH67标记的TRAIL-Exo。
2.激光共聚焦成像：将A375细胞接种于35mm共聚焦培养皿，待细胞贴壁后，弃上清，分别加入PKH67标记的TRAIL-Exo和未转染TRAIL的普通巨噬细胞来源的外泌体(Exo)，继续培养6h。弃上清，PBS洗涤2遍，4％多聚甲醛固定10～15min，DAPI染色5～10min，用激光共聚焦显微镜观察并拍照，用Image J计算细胞摄取平均荧光强度。
3.流式检测：将A375细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，弃上清，分别加入PKH67标记的TRAIL-Exo和Exo，继续培养6h。弃上清，PBS洗3次，消化离心后用PBS重悬至400μL，转移至5mL流式管中，上流式细胞仪检测。
图4中各图分别为实施例6中A375细胞对PKH67标记的TRAIL-Exo和Exo摄取的激光共聚焦图(a)、共聚焦平均荧光强度(b)、流式摄取图(c)和流式细胞平均荧光强度(d)。从图4中可知，TRAIL-Exo在A375细胞的膜上和细胞质中表现出更广泛的绿色荧光和更强的平均荧光强度，表明A375细胞对TRAIL-Exo具有更高的摄取效率。
实施例7：TRAIL-Exo/TPL的制备与表征
1.制备：用DMSO配制1mg/mL的TPL储存液。取100～1000μL蛋白浓度为1mg/mL的TRAIL-Exo，加入10-100μL用PBS稀释后的TPL溶液，混匀，使用超声波细胞破碎仪对该混合物进行超声处理：10～40％的振幅(最优为20％)，20～50s开/关(最优为30s)，共4～8个循环(最优为6个循环)，每个循环之间有2min的冷却时间。超声处理后，将混合物在37℃条件下放置0.5～1h，再置于4℃下1～2h。以120 000×g离心60～90min沉淀外泌体，用PBS重悬，即得TRAIL-Exo/TPL，保存于-80℃。
2.浓度测定：配制浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的蛋白标准溶液。根据BCA标准曲线(图5)计算TRAIL-Exo的蛋白浓度。配制10、50、100、250、500、1000、2000、5000、10000、25000、50000、100000ng/mL的TPL标准溶液，根据TPL标准曲线(图6)用高效液相色谱仪测定TRAIL-Exo/TPL中TPL的浓度。
3.表征：按实施例4中的步骤对制备的TRAIL-Exo/TPL进行透射电镜、粒径和流式表征。
图7中各图分别为实施例7制备的TRAIL-Exo/TPL的透射电镜图(a)、粒径分布图(b)和TRAIL流式分析图(c)。从图7中可知，TRAIL-Exo/TPL仍保持外泌体的完整结构和性质(图7(a))，粒径有所增加(图7(b))，仍有较高的TRAIL阳性率(图7(c))。TRAIL-Exo与TPL质量比为10：1时，包封率为51.87±4.85％，载药量为4.93±0.48％。以上结果表明超声处理可以将TPL载入TRAIL-Exo，实现较高的药物负载。
实施例8：细胞毒性实验
将A375细胞以1×104/孔接种于96孔板，培养24h。弃上清，加入不同浓度的TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL溶液。TRAIL-Exo组的蛋白浓度依次为5、10、20、50、100、200μg/mL；TPL和TRAIL-Exo/TPL组中的TPL浓度依次为5、10、20、50、100、200ng/mL，继续处理24h。处理结束后每孔加入10μL CCK-8溶液，振板30s，于培养箱中反应2h。用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度，计算细胞存活率。
图8为实施例8中TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL对A375细胞的毒性检测。由图8可知，TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL产生的细胞毒性均呈现浓度依赖性。与TRAIL-Exo和TPL相比，TRAIL-Exo/TPL在相同TPL浓度下表现出更低的细胞活力，表明其更强的肿瘤细胞毒性。
实施例9：细胞凋亡实验
将A375细胞以2～5×105/mL的密度接种于12孔板，待贴壁后，分别加入TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL(TPL浓度为50ng/mL)，继续培养24h。用不含EDTA的0.25％胰酶消化细胞，1000rpm离心5min，弃上清。用预冷的PBS重悬，再次离心。吸去PBS，加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/mL。依次加入5μL Annexin V-APC和10μL 7-AAD，振荡混匀，室温下避光染色15min，加入385μL 1×Binding Buffer混匀，转移至5mL流式管，上流式细胞仪检测。
图9为实施例9中TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL对A375细胞的凋亡效果检测。由图9可知，与对照组相比，TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL组均可诱导A375细胞凋亡，TRAIL-Exo/TPL表现出更强的诱导肿瘤细胞凋亡的效果。
实施例10：细胞侵袭实验
将A375细胞以5×105/mL的密度接种于12孔板中。待贴壁后，分别用TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL(TPL浓度均为50ng/mL)处理6h。消化、离心后用空白培养基重悬，调整细胞密度为1×105/mL。将50μL稀释后的基质胶加入Transwell上室，37℃放置1h，使胶凝固。在上室中分别加入200μL经TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL处理过的单细胞悬液，在下室中各加入600μL含10％FBS的完全培养基，继续培养24h。取出小室，用棉签擦去膜上层未穿膜的细胞，4％多聚甲醛固定15min，PBS洗膜2次，0.1％结晶紫染色15min，PBS洗涤，晾干后用荧光显微镜拍照并计数5个随机视野下的穿膜细胞数。与对照组穿膜细胞数量之比，计算细胞相对侵袭率。
图10为实施例10中TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL对A375细胞侵袭抑制效果检测。由图10可知，与对照组相比，TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL均可抑制A375细胞侵袭与趋化作用，TRAIL-Exo/TPL的抑制效果最显著。
实施例11：细胞迁移实验
将A375细胞以5×105/mL的密度接种于12孔板中。待贴壁后，分别用TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL(TPL浓度为50ng/mL)处理细胞6h。收集细胞，接种于专用培养插件孔内。24h贴壁后移除插件，用无血清培养基继续培养48h。用荧光显微镜测量观察不同时刻细胞划痕距离，计算肿瘤细胞迁移率。
图11为实施例11中TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL对A375细胞迁移抑制效果检测。由图11可知，与对照组相比，TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL均有可抑制A375细胞迁移，TRAIL-Exo/TPL抑制细胞迁移效果最显著。
实施例12：体内抗黑色素瘤效果评价
1.A375裸鼠移植瘤模型：雄性BALB/C裸鼠，4～6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。将约4×106个A375细胞接种于裸鼠右肢腋下，待其肿瘤体积长至约100mm3，随机分为对照组、TRAIL-Exo组、TPL组和TRAIL-Exo/TPL组(n＝6)。
2.体内给药：每2天分别经尾静脉注射0.9％生理盐水、TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL(TRAIL-Exo剂量为200mg/kg，TPL剂量0.6mg/kg)，共给药8次。每次用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，根据公式V＝(a×b2)/2计算肿瘤体积，并称量裸鼠体重，绘制肿瘤生长曲线和体重变化曲线。给药结束后24h将裸鼠处死，取心肝脾肺肾和肿瘤，并称量各组肿瘤重量。计算肿瘤生长抑制率。
图12为实施例12中TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL体内抗黑色素瘤效果图，包括每组裸鼠经不同治疗后的实体瘤图(a)、肿瘤生长曲线图(b)、瘤重图(c)、抑瘤率(d)和体重变化图(e)。从图12中可知，单独尾静脉注射TRAIL-Exo或TPL后，肿瘤生长均受到一定程度的抑制，而注射等剂量的TRAIL-Exo/TPL后，肿瘤生长受到更明显的抑制，表现出最小且最稳定的肿瘤体积、最轻的瘤重和最高的肿瘤抑制率，也未对裸鼠的体重产生明显影响，表明TRAIL-Exo/TPL具有最明显的体内抗肿瘤效果和良好的耐受性。
实施例13：肿瘤及主要器官H&E
取每组裸鼠肿瘤组织和主要器官(心、肝、脾、肺、肾)并用福尔马林固定过夜。石蜡包埋后切成3～5μm薄片，对切片进行脱蜡、水化处理。将切片用苏木素染色，自来水洗，分化液分化，返蓝，再用伊红染色，用透明中性树胶封片。
实施例14：肿瘤组织TUNEL免疫荧光
肿瘤组织石蜡切片加入适量蛋白酶K覆盖，室温放置15min。再置于脱色摇床中用PBS洗涤3次。切片稍干后，滴加破膜工作液覆盖组织，常温下放置10min，再置于脱色摇床上用PBS洗涤3次。按切片数量和组织大小，取TdT试剂和dUTP试剂按1：9体积比混合，覆盖组织，置于湿盒内，37℃孵育2h。DAPI复染细胞核，避光室温孵育10min。将玻片置于PBS中在摇床上洗涤3次。切片稍干后，抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察。
实施例15：肿瘤Ki67免疫组化
将肿瘤切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液的修复盒中，再置于微波炉内进行抗原修复。冷却后将玻片置于PBS中在摇床上洗涤3次。切片放入3％H2O2中，室温避光孵育30min。将玻片置于PBS中在摇床上洗涤3次。切片稍干后滴加3％BSA覆盖，室温下封闭30min。在切片上滴加anti-Ki67抗体稀释液(1：200)，放于湿盒内4℃孵育过夜。切片置于PBS中在摇床上洗涤3次，加入稀释后的HRP标记goat anti-rabbit二抗(1：2000)覆盖组织，室温下孵育1h，置于PBS中在摇床上洗涤3次。切片稍干后滴加DAB显色液，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染3min，自来水洗净，1％的盐酸乙醇液分化，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。将切片进行脱水处理，晾干后用中性树胶封片，在荧光显微镜下观察。
图13为实施例13、实施例14和实施例15中获得的每组裸鼠的肿瘤组织H&E、TUNEL免疫荧光和Ki67免疫组化分析。从图13可知，H&E结果显示，与对照组相比，TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL组的肿瘤组织均表现出病理损伤和坏死特征，其中TRAIL-Exo/TPL组的肿瘤组织损伤最明显。TUNEL结果显示，TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL组的绿色荧光强度依次增强，表明肿瘤组织的凋亡率依次升高，且TRAIL-Exo/TPL组具有最高的凋亡率。Ki67结果显示，TRAIL-Exo、TPL和TRAIL-Exo/TPL组细胞核中的棕黄色颗粒依次减少，表明Ki67阳性率依次降低；其中，TRAIL-Exo/TPL组细胞核中的棕黄色颗粒最少，阳性率最低且低于10％，说明该组肿瘤恶性增殖指数最低。
图14为实施例13中经不同药物治疗后主要器官的H&E染色分析。从图14可知，与对照组相比，TRAIL-Exo/TPL组裸鼠各组织没有明显的损伤，肝肾均未发现炎症或水肿，表明TRAIL-Exo/TPL没有明显的器官毒性，具有良好的生物安全性。
实施例16：促进肿瘤细胞凋亡的相关蛋白表达检测
将A375细胞以1×106/mL接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分别加入TRAIL-Exo，TPL或TRAIL-Exo/TPL(TPL浓度均为50ng/mL)与细胞共培养，对照组细胞不加任何药物处理。收集各组细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞1min，12000rpm离心10min，收集上清。用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。配制12％分离胶和5％浓缩胶，恒压75V电泳30min。将甲醇活化的PVDF膜盖于胶上，300mA恒流转膜30min，用5％脱脂奶粉封闭膜1h，每组分别加入Anti-Caspase 8一抗(1：1000)、Anti-Caspase 3一抗(1：1000)、Anti-Bax一抗(1：1000)、Anti-Bcl 2一抗(1：1000)、Anti-Caspase 9一抗(1：2000)、Anti-Bid一抗(1：1000)、Anti-Cytochrome c一抗(1：1000)、NF-κB antibody(1：1000)、anti-Survivin一抗(1：5000)和VEGF抗体(1：1000)，4℃孵育过夜。用TBST在摇床上洗膜3次。按照一抗种属分别加入对应的HRP goatanti-mouse IgG(1：3000)和HRP goat anti-rabbit IgG(1：3000)二抗，室温孵育1h。用TBST缓冲液在脱色摇床上洗膜3次，每次10min。在暗室中将ECL A和ECL B两种试剂等体积混合，与膜反应5min，以β-actin为内参，使用凝胶成像系统成像，分析每个蛋白相对表达水平。
图15中各图分别为实施例16中凋亡相关蛋白表达的检测结果(a)及协同抗肿瘤的分子机制示意图(b)。由图15可知，与对照组相比，经TRAIL-Exo或TPL处理的细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、Bid和cytochrome c的表达增加，再经TRAIL-Exo/TPL处理后这些蛋白的表达水平进一步增加。经TPL处理后Bcl-2、NF-κB、VEGF和survivin的表达下降，再经TRAIL-Exo/TPL处理后这些蛋白的表达水平进一步降低。具体机理为：DR5胞内区含有死亡结构域(Death domain，DD)，TRAIL-Exo/TPL与DR5结合后，可募集Fas死亡结构域相关蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain，FADD)和pro-caspase 8，形成死亡诱导信号复合物(Death-inducing signaling complex，DISC)，DISC激活大量caspase 8，caspase 8又激活下游caspase 3，caspase 3作用于各种可以引起细胞凋亡的底物，从而导致细胞凋亡；另外，部分活化的caspase 8可以激活Bid转化成tBid，tBid转移至线粒体膜，激活促凋亡因子(Bax和Bak)并抑制抗凋亡因子(Bcl-2和Bcl-XL)，同时释放细胞色素c(Cytochrome c，Cyto c)，Cyto c与凋亡酶激活因子(Apoptotic proteaseactivating facter-1，APAF-1)相互作用形成凋亡复合体以激活下游caspase 9，从而进一步激活caspase 3诱导细胞凋亡。TPL也可通过上述caspase 8介导的caspase级联反应和线粒体途径诱导细胞凋亡。此外，TPL能同时下调VEGF、NF-κB和survivin的表达起到协同作用。
以上结果显示TRAIL-Exo/TPL复合外泌体能在体内和体外能显著抑制黑色素瘤发展，具有显著的协同抗肿瘤效果，同时降低了TPL的毒副作用，为临床治疗黑色素瘤提供了新的方法和思路。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 复旦大学附属肿瘤医院
<120> 一种负载膜结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和小分子抗肿瘤药物的复合外泌体
<130> /
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
cggtgaattc gccaccatgg ctatga 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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ccgaggatcc ttagccaact 20