具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明提供了TNFSF15在肿瘤浸润B、T细胞中的调控影响，特别是B、T细胞的共激活、迁移、浸润及其来源分化在促进肿瘤免疫应答中的用途。

TNFSF15由专利CN107541536A公开，本发明从大肠杆菌中成功纯化得到重组蛋白TNFSF15(TNFSF15-192a)，蛋白分子量大小约为23kDa。经过纯化、透析复性等过程，提取纯度非常高的目的蛋白。MTT方法证明TNFSF15能显著抑制内皮细胞的生长存活，证明TNFSF15具有良好的生物活性。

通过淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞，经TNFSF15的体外刺激后，分析淋巴细胞。

实施例1TNFSF15能够促进淋巴细胞的增殖和活化

将分离出的脾脏淋巴细胞加入6孔板，每孔5×10⁶个细胞，3mL培养基(含15％FBS，1％青链霉素混合液(100X)(Penicillin-Streptomycin Solution)双抗的RPMI 1640)。3μg/mL TNFSF15刺激细胞，对照组加入相应体积的缓冲液作为Vehicle。qPCR检测淋巴细胞的增殖(细胞周期素B1基因ccnb1；有丝分裂检测点丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BUB1基因bub1)和活化(Icos、Icosl和Fasl基因)情况。流式细胞术分析，结果如图1所示，表明TNFSF15刺激显著促进淋巴细胞增殖基因ccnb1和bub1，以及淋巴细胞免疫促进基因fasl、icos和icosl的mRNA表达的升高。

实施例2TNFSF15通过NF-κB促进B细胞的增殖和激活

将分离出的脾脏淋巴细胞加入6孔板，每孔5×10⁶个细胞混合癌细胞2×10⁵个，3mL培养基(2mL含15％FBS，1％双抗的RPMI 1640+15％FBS，1％双抗的高糖DMEM)。3μg/mLTNFSF15刺激细胞，对照组加入相应体积的缓冲液作为Vehicle。

共培养用的癌细胞(LLC)在混合淋巴细胞前，37℃CFSE孵育10min，加入40％FBS冰浴10min，终止反应。加PBS洗两次，弃上清，培养基重悬细胞。

抑制剂NF-κB(1μM)、PI3K(1μM)提前刺激免疫细胞1h后，加入含3μg/mL TNFSF15或Vehicle的癌细胞。

ICOSL中和抗体(10μg/mL)，37℃预孵育淋巴细胞2h，加入含3μg/mL TNFSF15或缓冲液的癌细胞。

细胞置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中培养72h。

收集细胞，PBS洗一次，加PI染色死细胞。PBS洗涤，PBS重悬细胞，过300目细胞筛网，流式分析检测癌细胞的死亡情况和淋巴细胞增殖、活化。

结果如图2所示，表明TNFSF15显著促进B220⁺CD19⁺双阳性B细胞以及B220⁺ICOSL⁺双阳性B细胞的百分比，表明TNFSF15促进了B细胞增殖和活化；当用NF-κB的抑制剂PDTC处理时，显著抑制B220⁺CD19⁺双阳性B细胞以及B220⁺ICOSL⁺双阳性B细胞的百分比，表明TNFSF15通过NF-κB信号促进B细胞增殖和活化。

实施例3TNFSF15通过ICOSL和PI3K激活T细胞发挥肿瘤杀伤作用

将分离出的脾脏淋巴细胞加入6孔板，每孔5×10⁶个细胞混合癌细胞2×10⁵个，3mL培养基(2mL含15％FBS，1％双抗的RPMI 1640+15％FBS，1％双抗的高糖DMEM)。3μg/mLTNFSF15刺激细胞，对照组加入相应体积的缓冲液作为Vehicle。

共培养用的癌细胞(LLC)在混合淋巴细胞前，37℃CFSE孵育10min，加入40％FBS冰浴10min，终止反应。加PBS洗两次，弃上清，培养基重悬细胞。

抑制剂NF-κB(1μM)、PI3K(1μM)提前刺激免疫细胞1h后，加入含3μg/mL TNFSF15或Vehicle的癌细胞。

ICOSL中和抗体(10μg/mL)，37℃预孵育淋巴细胞2h，加入含3μg/mL TNFSF15或缓冲液的癌细胞。

细胞置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中培养72h。

收集细胞，PBS洗一次，加PI染色死细胞。PBS洗涤，PBS重悬细胞，过300目细胞筛网，流式分析检测淋巴细胞增殖、活化。

结果如图3所示，表明TNFSF15能显著促进CD8⁺GZB⁺双阳T细胞的百分比，表明TNFSF15促进了CD8⁺T细胞增殖和活化；当用ICOSL中和抗体或PI3K的抑制剂Wortmannin处理时，显著抑制CD8⁺GZB⁺双阳性T细胞的百分比，表明TNFSF15通过ICOSL和PI3K激活T细胞。

实施例4TNFSF15体内调控B细胞和T细胞抗肿瘤

LLC(Lewis Lung Cancer)荷瘤小鼠模型：在培养皿中的汇合度达到80％时，进行传代处理。消化成单悬细胞后，离心收集细胞，10倍体积PBS洗两次。最后弃去PBS，加无血清无双抗的基础培养基，浆细胞重悬至3×10⁶mL^-1的细胞悬液。在6-8周的C57BL/6小鼠右后腿的皮下接种细胞，每只小鼠100μL上述细胞悬液。

肿瘤接种时间第四天，肿瘤能够被肉眼观察到时，将小鼠随机分配成两组，进行瘤旁给药。每隔两天给一次药并监测小鼠体重和肿瘤体积(游标卡尺测量最长和最短直径)。分别于肿瘤接种后的第19天和第30天收取肿瘤组织。

实验组：每只鼠瘤旁注射5mg/kg TNFSF15；对照组：每只鼠瘤旁注射等体积的缓冲液(Vehicle)。

肿瘤体积(mm³)＝L×W×W/2；其中，L代表肿瘤最长的直径，W代表肿瘤最短的直径。

流式检测分析细胞

为获取单悬细胞，我们均匀地取肿瘤组织的一半，尽可能剪碎，加入提前配置好放置在4℃冰箱的肿瘤组织消化液(1：5，g：mL)。

肿瘤组织消化液：20mg胶原酶Ⅳ(1mg/mL)，2mg/mL透明质酸酶(0.1mg/mL)，0.1μLDNaseⅠ(5μU/mL)溶于20mL含钙镁的Hank缓冲液中。37℃水浴锅加热，30min；或4℃，过夜(约16h)，中间不断摇晃消化液使组织尽可能充分被消化成单悬细胞。加10％FBS终止消化，4℃，400g离心5min。加入含2％FBS和1％双抗的培养液重悬组织。注射器橡胶头在200目细胞筛网上研磨组织，注意避免组织长时间脱水。将细胞液转移至离心管中，4℃，400g离心5min，收集细胞。含2％FBS、1％双抗和0.5μM EDTA(pH 8.0)的培养液重悬细胞，4℃存放备用。

将准备好的肿瘤单悬细胞，均分到1.5mL EP管中，每管约含5×10⁶个细胞，PBS洗一次，400g，5min，离心弃上清。加入100μL稀释好的抗体。冰上30min，加十倍体积的PBS洗一次，400g，5min，离心弃上清。加流式200μL固定液(4％多聚甲醛)重悬混匀细胞。上机分析前过300目的细胞筛网。

如果抗体无荧光，需要在一抗孵育完，PBS洗过后，加相应的荧光二抗，室温，20min。

抗体ICOSL的流式染色，先孵育ICOSL的荧光二抗后，再孵育其他荧光直标的抗体。

胞内抗体流式染色：流式固定剂(PBS稀释至1×)在室温下固定细胞20-60min，PBS洗一次，弃上清。将抗体使用透膜剂(蒸馏水稀释至1×)，室温染色20min，PBS洗一次，弃上清。PBS重悬细胞，上机分析前过300目的细胞筛网。

核内抗体流式染色：流式核膜固定剂(固定透膜剂+稀释液，1:3)在室温下固定细胞20-60min，PBS洗一次，弃上清。将抗体使用固定剂透膜剂(蒸馏水稀释至1×)，室温染色20min，PBS洗一次，弃上清。PBS重悬细胞，上机分析前过300目的细胞筛网。

结果如图4-5所示，表明TNFSF15能够促进LLC肿瘤内B220⁺CD19⁺双阳性B细胞以及CD8⁺CD45⁺双阳T细胞的百分比，并显著抑制LLC肿瘤体积和重量，表明TNFSF15促进B细胞和CD8⁺T细胞浸润肿瘤并抑制LLC肿瘤生长；TNFSF15也能促进LLC肿瘤内B220⁺ICOSL⁺双阳性B细胞、CD8⁺GZB⁺双阳T细胞、CD4⁺T-bet⁺双阳T细胞和CD8⁺GFN-B⁺双阳T细胞的百分比，表明TNFSF15能通过促进肿瘤中B细胞和T细胞的活化，发挥抗肿瘤作用。

实施例5TNFSF15促进骨髓源B、T细胞浸润肿瘤

1)在无菌条件下，取6～8周的C57BL/6雄鼠的胫骨和股骨，无菌纱布剥离肌肉组织，将骨头放在PBS中。

1mL无菌注射器将骨髓冲到含2％FBS的PBS中，反复吹打使细胞尽可能分散为单悬细胞。过300目无菌细胞筛网，400g，离心5min，弃上清。

十倍体积PBS洗一次，400g，离心5min，弃上清。

两只鼠的骨髓细胞加1mL ACK红细胞裂解液，吹打混匀，冰上5min。加入十倍体积的含10％FBS的PBS，400g，离心5min，弃上清。含10％FBS的RPMI 1640重悬细胞，备用。

2)构建td-Tomato⁺骨髓细胞移植模型小鼠，具体如下：

选择8-10周(体重为20-22g)的C57BL/6雌鼠作为骨髓移植模型受体小鼠。9.0GyCs137放射(时间约10min)。放射六小时后，尾静脉注射6-8周td-Tomato⁺荧光C57BL6雄鼠的红色荧光(td-Tomato⁺)骨髓细胞。受体小鼠需td-Tomato+骨髓细胞约5×10⁶个细胞。随后观察两周，如果小鼠体重都在18g以上且状态良好，即骨髓移植模型构建成功。

流式分析td-Tomato⁺骨髓细胞在外周血和骨髓中的比例。td-Tomato在流式中的通道为PE(激发光：488nm；发射光：561nm)。

3)皮下移植瘤LLC模型小鼠的构建

LLC细胞的完全培养基是含有10％胎牛血清，1％双抗的高糖DMEM。培养条件：37℃，5％CO₂的恒温孵育培养箱。

显微镜下观察细胞，待LLC细胞在培养皿中的汇合度达80％时进行传代(1：3)。自细胞株复苏后，传代3-10次间的细胞可用于实验或冻存。传代细胞时，首先，移除培养皿中的培养基，无菌的PBS(10cm细胞培养皿加4mL)洗细胞进行清洗一次，弃去PBS。加入胰酶消化液(10cm细胞培养皿加2mL)，将加入胰酶的培养皿置于37℃培养箱2min，10％FBS培养基将消化成单悬细胞的肿瘤细胞在10倍体积PBS中洗三次，200g，5min，弃上清，加入无血清无双抗的培养基重悬细胞至5×10⁶mL^-1。每只小鼠(接受骨髓细胞移植两周后)皮下接种100μL上述重悬的细胞。

肿瘤接种时间第四天，肿瘤能够被肉眼观察到时，将小鼠随机分配成两组，进行瘤旁给药。每隔两天给一次药并监测小鼠体重和肿瘤体积(游标卡尺测量最长和最短直径)。分别于肿瘤接种后的第19天和第30天收取肿瘤组织。

实验组：每只鼠瘤旁注射5mg/kg TNFSF15；对照组：每只鼠瘤旁注射等体积的缓冲液(Vehicle)。

肿瘤体积(mm³)＝L×W×W/2；其中，L代表肿瘤最长的直径，W代表肿瘤最短的直径。

4)流式检测分析

为获取单悬细胞，均匀地取肿瘤组织的一半，尽可能剪碎，加入提前配置好放置在4℃冰箱的肿瘤组织消化液(1：5，g：mL)。

肿瘤组织消化液：20mg胶原酶Ⅳ(1mg/mL)，2mg/mL透明质酸酶(0.1mg/mL)，0.1μLDNaseⅠ(1μU/mL)溶于20mL含钙镁的Hank缓冲液中。37℃水浴锅加热，30min；或4℃，过夜(约16h)，中间不断摇晃消化液使组织尽可能充分被消化成单悬细胞。加10％FBS终止消化，4℃，400g离心5min。加入含2％FBS和1％双抗的培养液重悬组织。注射器橡胶头在200目细胞筛网上研磨组织，注意避免组织长时间脱水。将细胞液转移至离心管中，4℃，400g离心5min，收集细胞。含2％FBS、1％双抗和0.5μM EDTA(pH 8.0)的培养液重悬细胞，4℃存放备用。

将准备好的肿瘤单悬细胞，均分到1.5mL EP管中，每管约含5×10⁶个细胞，PBS洗一次，400g，5min，离心弃上清。加入100μL稀释好的抗体。冰上30min，加十倍体积的PBS洗一次，400g，5min，离心弃上清。加流式200μL固定液(4％多聚甲醛)重悬并混匀细胞。上机分析前过300目的细胞筛网。

如果抗体无荧光，需要在一抗孵育完，PBS洗过后，加相应的荧光二抗，室温，20min。

抗体ICOSL的流式染色，先进行，孵育ICOSL的荧光二抗后，再孵育其他荧光直标的抗体。

胞内抗体流式染色：流式固定剂(PBS稀释至1×)在室温下固定细胞20-60min，PBS洗一次，弃上清。将抗体使用透膜剂(蒸馏水稀释至1×)，室温染色20min，PBS洗一次，弃上清。PBS重悬细胞，上机分析前过300目的细胞筛网。

核内抗体流式染色：流式核膜固定剂(固定透膜剂+稀释液，1:3)在室温下固定细胞20-60min，PBS洗一次，弃上清。将抗体使用固定剂透膜剂(蒸馏水稀释至1×)，室温染色20min，PBS洗一次，弃上清。PBS重悬细胞，上机分析前过300目的细胞筛网。

5)用于组织形态、免疫荧光、免疫组化分析细胞的表达

将肿瘤组织置于10倍体积的4％多聚甲醛中，4℃固定24h。自来水轻轻地冲洗5min，将组织置于30％蔗糖水溶液中，4℃脱水12h。避免过度固定和过度脱水而影响组织样本的蛋白和结构。冰冻切片OCT包埋剂完全包埋组织后，于液氮表面快速冷冻组织样本。冰冻后的样本置于-80℃超低温冰箱保存、备用。

切片恢复至室温。-20℃下，冰甲醇(-20℃预冷)固定切片组织20min。自来水缓慢水流冲洗5min，注意避免破坏组织切片。

PAP笔画防水圈，为后续孵育抗体做准备。注意防水圈不能太小，以免抗体挥发。每个防水圈内的组织内需要大约30-50μL液体。

PBST稀释Triton-X100(0.25％)，室温，30min。PBST洗3次，每次5min。

轻甩片子，滤纸吸走多余液体。防水圈明显成闭合的包围组织时，向防水圈内滴加5％BSA(PBST稀释)封闭非特异性抗原，置于湿盒内，室温，1h。

甩干，勿洗。向防水圈内滴加稀释好的抗体，使组织被完全覆盖。置于湿盒内，4℃，过夜(或者37℃，1h)。

PBST洗三次，每次5min。

向防水圈内滴加稀释好的荧光二抗，室温孵育，2h。PBST洗三次，每次5min。

封片：滤纸吸走多余液体，滴加抗荧光淬灭封片剂(每张片子约20μL)，轻压盖玻片，注意避免气泡出现和组织完全干裂。

共聚焦显微镜镜下观察目标抗体在组织中的表达及定位。

结果如图6-8所示，表明TNFSF15促进td-Tomato⁺骨髓源细胞在肿瘤中的比例；TNFSF15也能促进B220⁺B细胞及td-Tomato⁺骨髓源B细胞浸润肿瘤；TNFSF15促进CD8⁺T细胞及td-Tomato⁺骨髓源CD8⁺T细胞浸润肿瘤。

实施例6TNFSF15在调控骨髓细胞分化B细胞和活化中的作用

培养基：RPMI 1640+10％FBS+1％双抗。

培养条件：37℃，5％CO₂的恒温孵育培养箱。

12孔板，每孔加入10⁶个细胞，TNFSF15(3μg/mL)刺激72h。

抑制剂组：抑制剂NF-κB(1μM)和细胞预孵育1h，37℃。之后加入相应的培养基(含Vehicle或TNFSF15)，37℃，72h。

中和抗体组：ICOSL中和抗体(10μg/mL)和细胞预孵育2h，37℃。之后加入相应的培养基(含Vehicle或TNFSF15)，37℃，72h。

收取细胞，PBS洗涤，流式染色分析B220⁺和ICOSL⁺B220⁺细胞。

结果如图9所示，表明TNFSF15能促进骨髓细胞分化B220⁺的B细胞的百分比，以及促进骨髓细胞分化为B220⁺ICOSL⁺双阳性活化B细胞的百分比，表明TNFSF15促进了骨髓细胞向B细胞的分化和活化；当用NF-κB的抑制剂PDTC处理时，显著抑制骨髓细胞向B220⁺阳性B细胞以及B220⁺ICOSL⁺双阳性B细胞分化的百分比，表明TNFSF15通过NF-κB信号促进骨髓细胞向B细胞分化和活化。

实施例7TNFSF15在调控骨髓细胞分化T细胞的作用

培养基：RPMI 1640+10％FBS+1％双抗。

培养条件：37℃，5％CO₂的恒温孵育培养箱。

12孔板，每孔加入10⁶个细胞，TNFSF15(3μg/mL)刺激72h。

抑制剂组：抑制剂NF-κB(1μM)和细胞预孵育1h，37℃。之后加入相应的培养基(含Vehicle或TNFSF15)，37℃，72h。

中和抗体组：ICOSL中和抗体(10μg/mL)和细胞预孵育2h，37℃。之后加入相应的培养基(含Vehicle或TNFSF15)，37℃，72h。

收取细胞，PBS洗涤，流式染色分析CD4⁺和CD8⁺细胞比例。

结果如图10所示，表明TNFSF15增加了骨髓细胞CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的百分比，表明TNFSF15能促进骨髓细胞向CD8⁺和CD4⁺T细胞的分化。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。