一种牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊及其制备方法
阅读说明：本技术 一种牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊及其制备方法 (Bovine serum albumin-hydrophobic modified chitosan nano microcapsule and preparation method thereof ) 是由 秦大伟 王利振 于 2021-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及多糖技术领域,尤其涉及一种牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊及其制备方法,以正十六烷酸改性壳聚糖,并进一步制备负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊。本发明所制备的纳米微囊为两层结构,内层为疏水改性壳聚糖、9-O-正十八烷基小檗碱和紫杉醇,外层为牛血清白蛋白。该纳米药物能够显著增强紫杉醇对肿瘤细胞的抑制活性。(The invention relates to the technical field of polysaccharide, in particular to a bovine serum albumin-hydrophobic modified chitosan nano microcapsule and a preparation method thereof. The nano microcapsule prepared by the invention has a two-layer structure, the inner layer is hydrophobic modified chitosan, 9-O-n-octadecyl berberine and paclitaxel, and the outer layer is bovine serum albumin. The nanometer medicine can remarkably enhance the inhibiting activity of paclitaxel on tumor cells.)
技术领域
本发明涉及多糖技术领域，尤其涉及一种牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊及其制备方法。
背景技术
紫杉醇是世界闻名的抗肿瘤药物之一，具有独特的作用机制和广泛的抗肿瘤活性。但是，紫杉醇微溶于水，为了提高其溶解性，临床上使用时需要联合乙醇和聚氧乙烯蓖麻油使用，但是联合乙醇和聚氧乙烯蓖麻油使用会增加化疗期间的超敏反应。
现有技术中，通常将紫杉醇做成脂质体制剂，如中国专利CN101011357公开的一种紫杉醇脂质体制剂的制备方法，采用薄膜分散法或喷雾干燥法制备长循环紫杉醇脂质体，以胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱和十四酸为稳定剂，蔗糖为冻干保护剂，氯仿、甲醇为有机溶剂；并且采用两亲性聚乙二醇衍生物修饰脂质体膜，同时采用挤压或高压均质的方法使脂质体粒径≤100nm，包封率≥85%。该方法制得的紫杉醇脂质体制剂具有毒性小，稳定性高的优点，提高了紫杉醇的溶解性，但是脂质体在体内分解、代谢较快，且脂质体紫杉醇仍有严重的副作用，易产生过敏反应、恶心呕吐等症状，限制了使用。
纳米载体载药率高、可延长紫杉醇在体内的循环时间。壳聚糖是天然存在的多糖，具有无毒副作用、生物相容性好、可降解、细胞粘附性好等优点，是一种制备纳米药物载体的理想材料。牛血清白蛋白是来自于血清中的一种球蛋白，起到维持血液渗透压、pH缓冲作用和载体作用，具有出色的生物相容性，因此可用于制备纳米载体，对抗肿瘤药物具有较好的物理保护作用，延长药物在体内的作用时间。但是，壳聚糖和牛血清白蛋白都由亲水性单体组成，制备成纳米载体后，对于疏水性的紫杉醇，其载药率不高，且在体内容易发生渗漏。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中的问题，提供一种在壳聚糖结构中引入疏水性烷基，可以高效负载疏水性紫杉醇，延长药物在体内的运输时间，防止药物渗漏的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊的制备方法。
本发明的技术方案是：
一种牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊的制备方法，包括以下步骤：
⑴疏水改性壳聚糖的制备：称取正十六烷酸和壳聚糖，加入到溶剂一中，搅拌10~20分钟，控制温度在15~25℃，加入缩合剂和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5~1.5小时，升温至60~90℃，搅拌12~24小时，降温至20~40℃，得到混合液，将所得混合液倾入到溶剂二中，搅拌20~40分钟，过滤，滤饼用洗涤剂洗涤，真空干燥得疏水改性壳聚糖；
所述溶剂一为二甲亚砜或乙醇；
所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N-二异丙基碳二亚胺；
所述溶剂二为异丙醇或乙醇；
所述洗涤剂为乙醇水混合物，其中乙醇和水的质量比为2~4：1；
⑵负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊的制备：取步骤⑴所得的疏水改性壳聚糖，加入到二甲亚砜中，加入9-O-正十八烷基小檗碱和紫杉醇，搅拌5~10分钟，滴加牛血清白蛋白水溶液，滴加速度为2~3滴/秒，滴加完毕后超声10~30分钟，用分子量为3500的透析袋透析24~72小时，冻干得一种负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊；
所述牛血清白蛋白水溶液的质量浓度为0.5~1.5%；
其中正十六烷酸、壳聚糖、溶剂一、缩合剂、N-羟基琥珀酰亚胺、溶剂二、洗涤剂、二甲亚砜、9-O-正十八烷基小檗碱、紫杉醇、牛血清白蛋白水溶液的质量比为0.2~0.5：0.8~1.4：100~200：0.3~0.5：0.25~0.4：100~300：5~15：20~40：0.02~0.18：0.06~0.26：200~400。
优选的，所述壳聚糖平均分子量是20万，脱乙酰度大于80%。
优选的，所述溶剂一为二甲亚砜。
优选的，所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
优选的，所述溶剂二为异丙醇。
优选的，所述洗涤剂中，乙醇和水的质量比为3：1。
优选的，所述牛血清白蛋白水溶液中牛血清白蛋白的质量浓度为1.0%。
一种牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊为两层球状结构，内层为疏水改性壳聚糖、9-O-正十八烷基小檗碱和紫杉醇，外层为牛血清白蛋白。
本发明的有益效果为：本发明得到的产品为核壳结构，内部核层为疏水改性壳聚糖、紫杉醇和9-O-正十八烷基小檗碱，外部壳层为牛血清白蛋白。首先正十六烷酸与壳聚糖上的氨基反应，在壳聚糖分子上引入疏水性的烷基，获得两亲性高分子材料，在水中两亲性高分子可以进行自组装形成微囊结构，疏水端被包裹在核内，亲水端在外；根据相似相容原理，疏水改性壳聚糖的长链烷基与疏水的紫杉醇结合，被包裹在内部，外部被糖类化合物保护，可有效改善紫杉醇水溶性差的缺点，且在体内具有较长的循环时间，使药物缓慢释放；
其次，9-O-正十八烷基小檗碱是在小檗碱的9-O位置引入了疏水性长链烷基，根据相似相容原理，更容易与疏水改性壳聚糖结合形成微囊结构，且小檗碱具有一定的抗肿瘤作用，能够与紫杉醇协同作用实现更好的抗肿瘤效果；本发明的疏水改性壳聚糖中还剩余部分裸露氨基，在肿瘤细胞酸性微环境下可以质子化，并实现药物的快速释放；
另外，本发明在制备纳米载体时，最后加入了牛血清白蛋白，牛血清白蛋白中含有大量的羧基，可以与疏水改性壳聚糖中剩余的氨基通过静电结合，在微囊外部形成保护层，进一步防止药物过快释放，同时增加载体的生物相容性，延长其在体内的循环时间。
附图说明
图1为细胞毒性测试结果；
图2为透射电镜测定的实施例3制备的纳米材料的外观形态；
图3为原子力显微镜测定的实施例3制备的纳米材料的外观形态。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、技术特征、发明目的与技术效果易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例1：
一种牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊的制备方法，包括以下步骤：
⑴疏水改性壳聚糖的制备：称取2g正十六烷酸和8g壳聚糖，加入到1000g二甲亚砜中，搅拌10分钟，控制温度在15℃，加入3g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和2.5g N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌0.5小时，升温至60℃，搅拌12小时，降温至20℃，得到混合液，将所得混合液倾入到1000g异丙醇中，搅拌20分钟，过滤，滤饼用50g乙醇水混合物洗涤（乙醇和水的质量比为2：1），真空干燥得疏水改性壳聚糖；
⑵负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊的制备：取步骤⑴所得的疏水改性壳聚糖，加入到200g二甲亚砜中，加入0.2g9-O-正十八烷基小檗碱和0.6g紫杉醇，搅拌5分钟，滴加2000g牛血清白蛋白水溶液（质量浓度为0.5%），滴加速度为2滴/秒，超声10分钟，用分子量为3500的透析袋透析24小时，冻干得一种负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊。
实施例2：
一种牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊的制备方法，包括以下步骤：
⑴疏水改性壳聚糖的制备：称取5g正十六烷酸和14g壳聚糖，加入到2000g乙醇中，搅拌20分钟，控制温度在25℃，加入5gN,N-二异丙基碳二亚胺和4gN-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1.5小时，升温至90℃，搅拌24小时，降温至40℃，得到混合液，将所得混合液倾入到3000g乙醇中，搅拌40分钟，过滤，滤饼用150g乙醇水混合物洗涤（乙醇和水的质量比为4：1），真空干燥得疏水改性壳聚糖；
⑵负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊的制备：取步骤⑴所得的疏水改性壳聚糖，加入到400g二甲亚砜中，加入1.8g9-O-正十八烷基小檗碱和2.6g紫杉醇，搅拌10分钟，滴加4000g牛血清白蛋白水溶液（质量浓度为1.5%），滴加速度为3滴/秒，超声30分钟，用分子量为3500的透析袋透析72小时，冻干得一种负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊。
实施例3：
一种牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊的制备方法，包括以下步骤：
⑴疏水改性壳聚糖的制备：称取4g正十六烷酸和10g壳聚糖，加入到1500g二甲亚砜中，搅拌15分钟，控制温度在20℃，加入4g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3.5g N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1小时，升温至80℃，搅拌18小时，降温至30℃，得到混合液，将所得混合液倾入到1500g异丙醇中，搅拌30分钟，过滤，滤饼用100g乙醇和水的混合物洗涤（乙醇和水的质量比为3：1），真空干燥得疏水改性壳聚糖；
⑵负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊的制备：取步骤⑴所得的疏水改性壳聚糖，加入到300g二甲亚砜中，加入1.2g9-O-正十八烷基小檗碱和2.0g紫杉醇，搅拌8分钟，滴加3000g牛血清白蛋白水溶液（质量浓度为1.0%），滴加速度为3滴/秒，超声20分钟，用分子量为3500的透析袋透析48小时，冻干得一种负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊。
实施例4：
纳米药物的包封率测试：
采用高效液相色谱法测定纳米载体的包封率，分别称取紫杉醇和9-O-正十八烷基小檗碱，配制成浓度为0，0.5，1，4，7，10，13，16，20μmol/L的溶液，在高效液相色谱仪上测定其液相谱图，绘制标准曲线。
称取一定量的实施例1、2、3制备的负载抗肿瘤药物的牛血清白蛋白-疏水改性壳聚糖纳米微囊，用纯水溶解，甲醇定容，采用超声波发破碎纳米微囊，使其中的紫杉醇和9-O-正十八烷基小檗碱完全释放，高效液相色谱仪上测定其液相谱图，根据峰面积和标准曲线计算紫杉醇和9-O-正十八烷基小檗碱的包封率，计算公式如下：
包封率=高效液相法测定的药品含量/药品的投入量×100%。
测试结果见表1：
表1.纳米微囊对紫杉醇和9-O-正十八烷基小檗碱的包封率测试结果
本发明所制备的纳米微囊对紫杉醇和9-O-正十八烷基小檗碱均具有较高的包封率。
细胞毒性测试：
材料的细胞毒性测试采用MTT法，用浓度为2，4，6，8，10μmol/L的样品（以紫杉醇计）处理HeLa细胞48小时，测定细胞的抑制率，如图1所示，为细胞毒性测试结果。负载有紫杉醇的纳米材料对HeLa细胞的抑制活性明显由于加入了紫杉醇，特别是实施例3制备的纳米材料，在紫杉醇浓度为4μmol/L时，对细胞的抑制率达到约76%，远高于无纳米材料包裹的紫杉醇药物的抑制率。这说明本发明制备的纳米材料可显著提高紫杉醇药物的抗肿瘤活性。
体内抗肿瘤活性评价：
选取BALB/C小鼠（辽宁长生生物技术股份有限公司），测定纳米药物在体内的抗肿瘤活性。将HeLa细胞注射入BALB/C小鼠体内，注射量为200μL，注射浓度105个细胞/mL，常温下饲养2周，构建小鼠肿瘤异种移植模型。将移植瘤小鼠分组，设置药物组、对照组和模型组，药物组给与口服灌胃纳米药物，给药量以紫杉醇含量计为2mg/kg，对照组给药纯紫杉醇或9-O-正十八烷基小檗碱，给药量2mg/kg，模型组为移植瘤小鼠，正常饲养。每天给药一次，连续给药20天，手术取出小鼠体内的肿瘤，称重，计算肿瘤的平均重量，结果见表2。
表2.负载抗肿瘤药物的纳米微囊的体内抗肿瘤活性
实施例1~3包裹紫杉醇和9-O-正十八烷基小檗碱的纳米药物抗肿瘤活性要远好于紫杉醇，其平均瘤重小于0.47g，而单纯的紫杉醇给药20天后，平均瘤重为0.71g。
材料的外观形态测试：
如图2所示，为透射电镜测定的实施例3制备的纳米材料的外观形态，本发明制备的纳米材料平均粒径在200nm左右，材料分散性较好，粒径均匀。如图3所示，为原子力显微镜测定的实施例3制备的纳米材料的外观形态，原子力显微镜检测结果表明，材料为球形结构。
综上所述仅为本发明较佳的实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化及修饰，皆应属于本发明的技术范畴。
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