具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

本发明的实施例中所使用的试剂或原料如无特别说明均为商购产品。

实施例1非天然氨基酸NBOK的制备

NBOK的结构式如下所示：

反应过程如下图所示：

制备过程包括以下步骤：

a)在反应烧瓶中，加入对甲基苯乙酮(4.0mL,30.0mmol)，加入溶剂DCE(50.0mL)，加入NBS(6.41g,36.0mmol)和BPO(0.05g,0.3mmol)，混合物在80℃下回流24小时后，容器放入冰水中冷却，析出固体，过滤除去固体，用饱和Na₂CO₃洗涤3次，用DCM萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后得到粗产物1-1(5.46g,收率85％)，无需纯化直接用于下一步。

b)在反应烧瓶中，加入产物1-1(2.73g,12.80mmol)，加入溶剂二氧六环(40mL)和水(40mL)，再加入碳酸钙(7.68g,76.8mmol)，混合物在105℃回流24小时，冷却至室温，过滤除去固体，用DCM萃取3次，合并有机相，减压浓缩，经柱层析(洗脱剂：PE:EA＝3:1)纯化后得到产物1-2(1.80g,收率94％)。

c)在两口反应烧瓶中，加入对硝基苯基氯甲酸酯(2.90g，14.4mmol)，加入溶剂DCM(10.0mL)，降温至0℃，加入产物1-2(1.80g,12.0mmol)和吡啶(1.2mL，14.4mmol)，室温搅拌18小时后，反应液中加入饱和碳酸钠溶液(10mL)，用DCM(50mL)萃取3次，合并有机相，用水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，经柱层析(洗脱剂：PE:EA＝5:1)纯化得到产物1-3(3.14g,收率83％)。

d)在反应烧瓶中，加入产物1-3(1.26g,4.0mmol)和Fmoc-Lys-OH盐酸盐(1.40g,3.33mmol)，加入溶剂二氧六环(15mL)和水(5mL)，再加入三乙胺(1.2mL,8.3mmol)，混合物在室温下反应24小时后，加入适量1M HCl溶液，用DCM萃取，减压浓缩，得到粗产物1-4，直接用于下一步。

e)在反应烧瓶中，将产物1-4(1.10g,0.19mmol)溶于DCM(10mL)中，加入二乙胺(5.0mL)，在室温下反应6小时，产物析出，过滤后用DCM打浆3次，即得目标产物NBOK(1-5,817mg,两步收率63％)。

¹H-NMR(400MHz,重水)δ8.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.55(d,J＝8.0Hz,2H),5.21(s,2H),3.74(t,J＝6.0Hz,1H),3.17(t,J＝6.4Hz,2H),2.70(s,3H),1.95–1.83(m,2H),1.62–1.52(m,2H),1.47–1.35(m,2H).

实施例2非天然氨基酸NPAK的制备

NPAK的结构式如下所示：

反应过程如下图所示：

制备过程包括以下步骤：

a)在反应烧瓶中，加入对氯苯乙酮(1.00g,6.47mmol)，氮气氛围下，加入丙二酸二乙酯(6.84g,47.70mmol)、KHCO₃(0.97g,9.70mmol)和K₂CO₃(1.34g,9.70mmol)，然后加入Pd(dba)₂(0.019g,0.030mmol)和P(t-Bu)₃HBF₄(0.021g,0.071mmol)，加入完毕后置换氮气保护，升温至160℃反应40h。TLC检测反应完全后，反应液中加入水(30mL)，用EA萃取3次，合并有机相，用水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，过滤，在0-5℃减压浓缩，得到无色透明液体，柱层析(洗脱剂：PE:EA＝10:1)纯化得到产物2-1(0.80g,收率60％)。

b)在反应烧瓶中，加入LiOH(0.30g,11.64mmol)和水(5.0mL)，加入乙醇(10mL)，加入产物2-1(0.80g,3.88mmol)，室温搅拌2h后，TLC检测反应完全，反应液中加入2M HCl溶液调节pH＝1～2，用EA萃取3次，合并有机相，用水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到产物2-2(0.5g,收率72％)。

c)在反应烧瓶中，加入产物2-2(0.20g,1.12mmol)，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,0.19g,1.68mmol)、DIPEA(0.07g，0.56mmol)、DCM(2.0mL)。降温至0～5℃，加入DCC(0.23g,1.12mmol)和DCM(2.0mL)的溶液，保温反应2h。升至室温搅拌过夜。TLC检测反应完全后，过滤，用DCM洗涤，母液减压浓缩，柱层析(洗脱剂：PE:EA＝5:1)纯化得到产物2-3(0.19g,收率62％)。

d)在反应烧瓶中，加入产物2-3(0.10g,0.36mmol)，依次加入三乙胺(0.04g,0.36mmol)、Fmoc-Lys-OH盐酸盐(0.13g,0.36mmol)、二氧六环(2.0mL)和水(2.0mL)，室温下搅拌反应18h。TLC检测反应完全后，减压浓缩，用EA萃取3次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(洗脱剂：DCM:MeOH＝15:1)纯化得到油状液体产物2-4(0.03g,收率61％)。

e)在反应烧瓶中，加入产物2-4(0.08g,0.15mmol)、DCM(1.0mL)和哌啶(0.04g，0.47mmol)，在室温下搅拌3h。TLC检测反应完全后，减压浓缩，用石油醚(5mL)打浆1h，过滤，滤饼再用石油醚(5mL)打浆1h，过滤，滤饼用乙醇重复打浆4次除去残余的哌啶，最终得到类白色固体2-5(0.02g,收率43％)。

¹H-NMR(400MHz,重水)δ7.85(d,J＝8.2Hz,2H),7.33(d,J＝8.2Hz,2H),3.94(t,J＝6.3Hz,1H),3.56(s,2H),3.12(t,J＝6.8Hz,2H),2.54(s,3H),1.80–1.70(m,2H),1.54–1.45(m,2H),1.40-1.224(m,2H).

实施例3非天然氨基酸NBPK的制备

NBPK的结构式如下所示：

反应过程如下图所示：

制备过程包括以下步骤：

a)在反应烧瓶中，加入对甲基苯乙酮(4.0mL,30.0mmol)，加入溶剂DCE(50.0mL)，加入NBS(6.41g,36.0mmol)和BPO(0.05g,0.3mmol)，混合物在80℃下回流24小时。TLC检测反应完全后，容器放入冰水中冷却，析出固体，过滤除去固体，用饱和Na₂CO₃洗涤3次，用DCM萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后得到粗产物3-1(5.46g,收率85％)，无需纯化直接用于下一步。

b)在反应烧瓶中，加入NaH(0.58g,14.64mmol,60％)，加入干燥的溶剂THF(20mL)，冰浴冷却下，缓慢加入乙二醇(6.7mL,122.0mmol)，在室温条件下搅拌1小时。然后加入产物3-1(2.60g,12.2mmol)，70℃加热回流48小时至反应完全。冰浴冷却下，缓慢滴入饱和NH₄Cl淬灭NaH，用水洗涤，EtOAc萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后，经柱层析(洗脱剂：PE:EA＝2:1)纯化得到产物3-2(1.39g,收率59％)。

c)在反应烧瓶中，加入产物3-2(1.39g,7.2mmol)，加入溶剂DCM(10mL)，冰浴冷却下，加入对硝基苯基氯甲酸酯(1.74g,8.64mmol)和吡啶(0.7mL,8.64mmol)，室温搅拌18小时。TLC检测反应完全后，加入水洗涤，EtOAc萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后，经柱层析(洗脱剂：PE:EA＝3:1)纯化得到产物3-3(2.27g,收率88％)。

d)在反应烧瓶中，加入产物3-3(2.27g,6.32mmol)，加入溶剂二氧六环(16mL)和水(4mL)，加入Fmoc-Lys-OH盐酸盐(2.13g,5.27mmol)，再加入三乙胺(1.85mL,13.2mmol)，在室温下搅拌18小时至反应完全。加入适量1M HCl调pH至2左右，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到粗产物3-4，直接用于下一步。

e)在反应烧瓶中，将上一步的产物3-4溶于DCM(10mL)，加入二乙胺(5mL)，在室温下反应6小时。TLC检测反应完全后，减压浓缩，经柱层析(洗脱剂：DCM:MeOH:H₂O＝40:10:1)纯化得到产物白色固体(3-5,0.95g,两步收率49％)。

¹H-NMR(400MHz,重水)δ8.04(d,J＝8.0Hz,2H),7.56(d,J＝8.0Hz,2H),4.72(s,2H),4.25(s,2H),3.81(s,2H),3.74(t,J＝6.0Hz,1H),3.16–3.08(m,2H),2.70(s,3H),1.97–1.79(m,2H),1.60–1.48(m,2H),1.48–1.35(m,2H).

实施例4非天然氨基酸NPOK的制备

NPOK的结构式如下所示：

反应过程如下图所示：

制备过程包括以下步骤：

a)在反应烧瓶中，加入三光气(BTC,2.18g,7.35mmol)，加入溶剂THF(10.0mL)，在冰浴冷却下，加入对羟基苯乙酮(2.0g,14.7mmol)和吡啶(1.5mL,17.64mmol)，混合物在室温下反应24小时。TLC检测反应完全后，加入适量水，用EtOAc萃取3次，合并有机相。加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后得到粗产物4-1(1.20g)，直接用于下一步。

b)在反应烧瓶中，加入Boc-赖氨酸(1.1g,5.0mmol)，加入溶剂DCM(10.0mL)，加入产物4-1(1.20g)和三乙胺(2mL,15mmol)。在室温下搅拌24小时，TLC检测反应完全后，加入适量1M HCl调pH至弱酸性，用DCM萃取3次，合并有机相。加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后，经柱层析(洗脱剂：DCM:MeOH＝5:1)得到产物4-2(1.70g,收率84％)。

c)在反应烧瓶中，加入产物4-2(1.70g,4.2mmol)，加入溶剂DCM(5mL)，加入三氟乙酸(5mL)，混合物在室温下反应1小时。TLC检测反应完全后，直接减压浓缩，经柱层析(洗脱剂：DCM:MeOH:H₂O＝40:10:1)后得到产物4-3(1.19g,收率92％)。

¹H-NMR(400MHz,重水)δ8.09(d,J＝8.6Hz,2H),7.31(d,J＝8.6Hz,2H),3.78(t,J＝6.0Hz,1H),3.27(t,J＝6.8Hz,2H),2.70(s,3H),1.98–1.87(m,2H),1.72–1.60(m,2H),1.55–1.43(m,2H).

实施例5非天然氨基酸NBGK的制备

NBGK的结构式如下所示：

反应过程如下图所示：

制备过程包括以下步骤：

a)在反应烧瓶中，加入对甲基苯乙酮(8.0mL,60.0mmol)，加入溶剂DCE(80.0mL)，加入NBS(12.82g,72.0mmol)和BPO(145mg,0.6mmol)，混合物在90℃下回流24小时。TLC检测反应完全后，容器放入冰水中冷却，析出固体，过滤除去固体，用饱和Na₂CO₃洗涤3次，用DCM萃取3次，合并有机相。加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后得到粗产物5-1(11.12g,收率87％)，无需纯化直接用于下一步。

b)在反应烧瓶中，将MS(14g)和LiOH(1.45g,34.54mmol)用DMF(70mL)溶解，在室温下搅拌20min后，加入甘氨酸甲酯盐酸盐(2.0g,15.7mmol)，再搅拌45min后，加入产物5-1(4.0g,18.8mmol)，室温搅拌18小时。TLC监测反应完全后，过滤除去固体，用EA洗滤饼，滤液用水洗涤两次。无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得粗产物5-2，直接用于下一步。

c)在反应烧瓶中，将上一步产物5-2溶于二氧六环(20mL)，缓慢滴加1M NaOH，反应2小时后，TLC监测到水解反应完成得到产物5-3。加入20mL饱和NaHCO₃后，缓慢加入溶于二氧六环(10mL)的Fmoc-OSu，室温搅拌过夜，TLC监测反应完全后，用1M HCl调至弱酸性，用EA萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经柱层析(洗脱剂：DCM:MeOH＝10:1)得到产物5-4(3.60g,收率89％)。

d)在反应烧瓶中，加入产物5-3(3.60g,8.0mmol)、NBS(1.10g,9.6mmol)、EDCI(1.85g,9.6mmol)，加入溶剂DCM(50mL)，混合物在室温下反应18小时。TLC监测反应完全后，用水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到产物5-5(3.20g,收率75％)。

e)在反应烧瓶中，加入产物5-5(3.20g,6.0mmol)，加入溶剂二氧六环(40mL)和水(10mL)，加入Fmoc-Lys-OH盐酸盐(3.0g,7.2mmol)，再加入三乙胺(2.0mL,15.0mmol)，在室温下搅拌18小时至反应完全。加入适量1M HCl调pH至2左右，用EA萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，经柱层析(洗脱剂：DCM:MeOH:AcOH＝20:1:0.5)得到产物5-5(3.50g,收率75％)。

f)在反应烧瓶中，将产物5-5溶于DCM(20mL)，加入二乙胺(20mL)，在室温下反应6小时。TLC监测反应完全后，减压浓缩，经柱层析(洗脱剂：DCM:MeOH:H₂O＝30:10:1)得到终产物白色粉末5-7(0.55g,收率37％)。

¹H-NMR(400MHz,重水)δ7.98(d,J＝8.2Hz,2H),7.50(d,J＝8.2Hz,2H),3.84(s,2H),3.71(s,1H),3.31(s,2H),3.17(t,J＝6.9Hz,2H),2.67(s,3H),1.97–1.73(m,2H),1.58–1.45(m,2H),1.44-1.27(m,2H).

实施例6非天然氨基酸NPOK-2的制备

NPOK-2的结构式如下所示：

反应过程如下图所示：

制备过程包括以下步骤：

a)在反应烧瓶中，加入对乙酰基苯酚(2.05g,15.0mmol)和溴乙酸(2.50g,18.0mmol)，再加入NaOH(1.20g,30mmol)的水溶液(6mL)。混合物在100℃下回流24小时至反应完全。反应冷却至室温，加1M盐酸调至酸性，析出固体，过滤得到白色粗产物6-1(3.32g,收率113％)，无需纯化直接用于下一步。

b)在反应烧瓶中，将上一步粗产物6-1(3.32g,17.0mmol)溶于DCM(50mL)中，加入NHS(2.35g,20.4mmol)和EDCI(3.90g,20.4mmol)。混合物在常温下搅拌18小时至反应完全。用DCM萃取,合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。再经柱层析(洗脱剂：DCM:MeOH:AcOH＝20:1:0.5)纯化，得到产物6-2(1.67g,收率38％)。

c)在反应烧瓶中，加入产物6-2(1.67g,5.7mmol)，加入溶剂二氧六环(20mL)和水(50mL)，加入Fmoc-Lys-OH盐酸盐(1.9g,4.8mmol)，再加入三乙胺(1.7mL,12.0mmol)，在室温下搅拌18小时至反应完全，加入适量1M HCl调pH至2左右，用EA萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。将所得粗产物6-3直接溶于DCM(10mL)，再加入二乙胺(5mL)。混合物在常温下搅拌18小时至反应完全。减压浓缩，经柱层析(洗脱剂：DCM:MeOH:H₂O＝40:10:1)纯化得到终产物6-4(709mg,两步收率39％)。

¹H-NMR(400MHz,重水)δ7.91(d,J＝8.8Hz,2H),6.98(d,J＝8.8Hz,2H),4.60(s,2H),3.59(t,J＝6.4Hz,1H),3.19(t,J＝6.8Hz,2H),2.52(s,3H),1.87–1.65(m,2H),1.56–1.40(m,2H),1.35–1.15(m,2H).

实施例7非天然氨基酸NBGK-2的制备

NBGK-2的结构式如下所示：

反应过程如下图所示：

制备过程包括以下步骤：

a)在反应烧瓶中，加入溴乙酸(2.10g,15.0mmol)和NaOH(0.80g,20mmol)的水溶液(10mL)，搅拌10分钟。然后加入对乙酰基苯胺(1.40g,10.0mmol)，混合物在100℃下回流18小时至反应完全。反应冷却至室温，过滤，用水洗涤，得到白色粗产物7-1(1.30g,收率67％)，无需纯化直接用于下一步。

b)在反应烧瓶中，加入产物7-1(1.30g,6.7mmol)和NaHCO₃(1.70g,20.1mmol)的水溶液(20mL)。再加入Fmoc-OSu(2.80g,8.1mmol)和DMF(20mL)。混合物在60℃下搅拌18小时至反应完全。冷却至室温，用EA萃取。保留水相用1M盐酸调pH至2左右，再用EA萃取，得有机相。加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。得产物7-2，无需纯化直接用于下一步。

c)在反应烧瓶中，将上一步产物7-2(约6.7mmol)，NHS(0.90g,8.0mmol)和EDCI(1.50g,8.0mmol)溶解于DMF(50mL)。反应混合物在室温下搅拌24小时至反应完全。加水，用DCM萃取，得有机相。加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。得到产物7-3，无需纯化直接用于下一步。

d)在反应烧瓶中，加入上一步产物7-3(约6.7mmol)，Fmoc-Lys-OH盐酸盐(2.30g,5.6mmol)，以及三乙胺(2.0mL,14.0mmol)。反应混合物在室温下搅拌3小时至反应完全。然后用1M盐酸调pH至2左右，用EA萃取。加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。得到产物7-4，无需纯化直接用于下一步。

e)在反应烧瓶中，加入上一步产物7-4。加入溶剂DCM(20mL)和二乙胺(10mL)。反应混合物在室温下搅拌12小时至反应完全。先减压浓缩，再加入乙腈(50mL)重新溶解，再减压浓缩，反复3次操作除去多余二乙胺。加入DCM打浆两次，得到最终产物7-5(1.65g，总收率51％)。

¹H-NMR(400MHz,重水)δ7.71(d,J＝8.8Hz,2H),6.51(d,J＝8.8Hz,2H),3.80(s,2H),3.53(t,J＝6.8Hz,1H),3.09(t,J＝6.8Hz,2H),2.39(s,3H),1.73–1.60(m,2H),1.42–1.33(m,2H),1.25–1.14(m,2H).

实施例8

使用实施例1-7制备的NPOK、NPAK、NBOK、NBPK、NBGK、NPOK-2、NBGK-2在原核表达系统中制备重组人生长激素，并制备PEG定点偶联物。

(1)辅助质粒的获得

辅助质粒pSupAR-MbPylRS购自质粒保藏组织Addgene(货号#91705)，该质粒可在大肠杆菌中表达特异识别吡咯赖氨酸衍生非天然氨基酸的tRNA和tRNA合成酶，经添加有37.5mg/L氯霉素的LB培养基进行摇瓶培养后提取得到辅助质粒。

(2)阅读框内部含终止密码子的重组人生长激素表达质粒构建

从美国国家生物信息中心数据库中获得智人生长激素(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的编码基因的mRNA序列，在其翻译的蛋白质C端添加6个组氨酸组成的纯化标签，同时将SEQ ID NO:1第107位氨基酸的密码子改成琥珀密码子(TAG)，再通过全基因合成的方式合成该完整的DNA序列得到重组人生长激素的基因序列(SEQ ID NO:2)。

智人生长激素的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)如下：

FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF

重组人生长激素的基因序列(SEQ ID NO:2)如下：

ATGTTTCCTACTATACCACTATCTCGTCTATTCGATAACGCTATGCTTCGGGCCCATCGTCTTCATCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTTAGAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTAA

通过一步亚克隆，将重组人生长激素的基因序列(SEQ ID NO:2)克隆至pET21a(Novagen，货号#69740-3)的Nde I和Xho I两个酶切位点之间，得到表达质粒pET21-rhGH107，经测序验证与预期序列一致。pET21-rhGH107可以用于表达第107位氨基酸密码子被替换为琥珀密码子的重组人生长激素，且在该蛋白的C端包含6个组氨酸纯化标签。重组人生长激素表达质粒pET21-rhGH107的图谱如图1所示。

(3)目的表达菌株的获得

将上述辅助质粒pSupAR-MbPylRS和表达质粒pET21-rhGH107共转化至大肠杆菌OrigamiB(DE3)(Novagen，货号#70911-3)感受态细胞，并使用含100mg/L氨苄青霉素和37.5mg/L氯霉素的LB培养基筛选获得双抗性菌株，即为重组人生长激素表达菌株。

(4)插入非天然氨基酸的重组蛋白质表达

将筛选后的重组人生长激素表达菌株接种至8份2×YT培养基(酵母提取物16g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，含100mg/L氨苄青霉素和37.5mg/L氯霉素)中，37℃培养至菌液OD600为2.0±0.2，向8份菌液中分别添加IPTG(终浓度为1mM)和阿拉伯糖(终浓度为0.2％)，向第1份菌液中添加NBOK(终浓度为1mM)、向第2份菌液中添加NPAK(终浓度为1mM)、向第3份菌液中添加NBPK(终浓度为1mM)、向第4份菌液中添加NBGK(终浓度为1mM)、向第5份菌液中添加NPOK(终浓度为1mM)、向第6份菌液中添加NPOK-2(终浓度为1mM)，向第7份菌液中添加NBGK-2(终浓度为1mM)，第8份菌液不添加非天然氨基酸，作为阴性对照。37℃培养诱导表达5-6小时后取各培养液1ml，10000rpm离心1min，用PBS重悬至OD600为10，分别取各菌悬液进行SDS-PAGE电泳，各个菌株的SDS-PAGE电泳图见图2。图2结果表明表达菌株在分别添加了7种非天然氨基酸的情况下可以表达目的蛋白。

(5)插入非天然氨基酸的重组蛋白质的纯化

上述诱导表达后的各菌液10000rpm离心5min，取沉淀，加入1/20细胞生长体积的NTA Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油)和终浓度为1mM的PMSF，超声波匀浆破碎细胞，10000rpm离心20min，取上清，使用Ni-NTA层析柱吸附带有His标签的目的蛋白，再用洗脱液NTA Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油，250mM咪唑)洗脱，得到纯度约90％的目的蛋白(即，插入非天然氨基酸的重组蛋白质)样品。将各样品置于10K硝酸纤维素透析袋，置于pH7.0的PBS缓冲液中透析(每1ml蛋白溶液对应200ml透析液)过夜，并换液1次，收集透析后的蛋白溶液，SDS-PAGE检测蛋白浓度。

(6)插入非天然氨基酸的重组蛋白质与PEG偶联反应

如上述合成路线所示(其中R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向)。

以30KD氨氧基PEG肟化反应偶联插入非天然氨基酸的重组蛋白质为例，偶联反应操作如下：在偶联反应前，用pH7.0 PBS缓冲液调节上述获得的目的蛋白至0.5mg/ml，按照1：15(摩尔比，重组蛋白：氨氧基PEG)加入30KD氨氧基PEG固体(来源北京键凯科技有限公司)，充分摇晃溶解，得到澄清透明溶液，之后将反应液密封，在恒温摇床(25℃，100rpm)中摇晃反应。48h后使用SDS-PAGE分析偶联情况，见图3。图3结果显示6种目标蛋白均实现了30KD PEG偶联，进一步表明了上述7种非天然氨基酸插入了目标蛋白中。插入非天然氨基酸的重组蛋白质与PEG偶联产物简写为“PEG-rhGH”。

(7)PEG-rhGH的纯化

偶联后的PEG-rhGH经Butyl HP疏水层析柱分离纯化(上样缓冲液：50mM NaH₂PO₄·2H₂O，0.8M(NH₄)₂SO₄，pH8.5；洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH8.5，40倍柱体积梯度洗脱)，获得电泳纯级(>95％)纯品PEG-rhGH。以含有NPOK和含有NBOK的PEG-rhGH为例，电泳图见图4。

其他的含有本发明的非天然氨基酸的PEG-rhGH在纯化后也达到了电泳纯级。

(8)PEG-rhGH的活性分析

具体过程如下：HEK293-GHR细胞(细胞株来源见中国专利：2020112649827)用含0.1mg/mL潮霉素B(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A600230-0001)、0.75mg/mL的G418(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A600958-0005)、10％胎牛血清(Gibco，货号10099141)的DMEM(Gibco，货号11995040)培养基，于37℃、5％二氧化碳条件下培养至足够量，在黑色96孔细胞培养板(Corning，货号3904)中每孔接入9×10⁴个HEK293-GHR细胞，90μL/孔，37℃、5％二氧化碳条件下饥饿培养16h。将rhGH标准品(购自中国食品药品检定研究院，简称“中检院”)、含NPOK的rhGH(即，rhGH(NPOK))、PEG修饰NPOK的PEG-rhGH(即，PEG-rhGH(NPOK))、含NBOK的PEG-rhGH(即，rhGH(NBOK))、PEG修饰NBOK的PEG-rhGH(即，PEG-rhGH(NBOK))、市售的rhGH药品(长春金赛药业有限责任公司)、市售的PEG-rhGH药品(长春金赛药业有限责任公司)样品进行梯度稀释，共9个浓度，于37℃、5％二氧化碳条件下培养4h。每孔加入50μL ONE-Glo^TM(Promega，货号E6120)检测试剂，酶标仪读取化学发光值。根据样品浓度和酶标仪的读值拟合曲线，计算EC50。结果见图5A-图5G和表1。结果表明偶联前各位点细胞活性与中检院rhGH标准品相当。偶联后细胞活性降低，约为标准品的25％～50％，其生物学活性变化规律与上市的PEG-rhGH一致。

其他的含有本发明的非天然氨基酸的PEG-rhGH在偶联之后细胞活性也降低为标准品的25％～50％，生物学活性变化规律也与上市的PEG-rhGH一致。

表1

实施例9

使用实施例1-7制备的非天然氨基酸NPOK、NPAK、NBOK、NBPK、NBGK、NPOK-2和NBGK-2在真核表达系统中制备重组GFP蛋白。

(1)辅助质粒的获得

辅助质粒pCMV-MbPylRS购自质粒保藏组织addgene(货号#91706)，该质粒编码哺乳动物细胞中特异性识别吡咯赖氨酸衍生非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶及对应的tRNA(识别琥珀密码子UAG)。

(2)基因阅读框内部含有琥珀密码子的绿色荧光蛋白表达载体的构建

将表达含有纯化标签的野生型绿色荧光蛋白(其基因编码序列如SEQ ID NO:3所示)的表达载体进行点突变，获取阅读框第40位氨基酸密码子被突变为琥珀密码子的表达质粒pEGFP40，其完整序列见SEQ ID NO:4。

含有纯化标签的野生型绿色荧光蛋白的基因序列(SEQ ID NO:3)如下：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTAGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAGTACGAAGATTACAAGGATGACGACGATAAGTAA

表达质粒pEGFP40的基因序列(SEQ ID NO:4)如下：

GTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCCCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTAGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAGTACGAAGATTACAAGGATGACGACGATAAGTAAGAATTCCGGAAGGGTTCGATCCCTACCGGTTAGTAATGAGTTTAAACGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCAGATCTGCGCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGG

(3)插入非天然氨基酸的重组GFP蛋白表达

从美国模式培养物集存库(ATCC)购买中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(货号#CCL-61-ATC)，并使用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基进行贴壁培养。提取上述步骤的辅助质粒pCMV-MbPylRS与绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP40，使用lipo2000转染试剂(invitrogen公司，货号#12566014)，根据说明书进行瞬时转染，(将细胞以50000个细胞/孔的接种量接种到24孔板中，共8个孔，在接种培养24h后进行转染，每孔500ng质粒)并在转染的同时向第1孔中添加NPOK(终浓度为1mM)、向第2孔中添加NPAK(终浓度为1mM)、向第3孔中添加NBOK(终浓度为1mM)、向第4孔中添加NBPK(终浓度为1mM)、向第5孔中添加NBGK(终浓度为1mM)，向第6孔中添加NPOK-2(终浓度为1mM)，向第7孔中添加NBGK-2(终浓度为1mM)，第8孔不添加非天然氨基酸，作为阴性对照。在二氧化碳培养箱中静置培养48h后在荧光显微镜下观察细胞，结果显示第1孔～第7孔存在明显的绿色荧光(见图6)，证明非天然氨基酸能够插入到绿色荧光蛋白中，得到完整的绿色荧光蛋白，且不影响荧光蛋白的功能。

实施例10

使用实施例1-7制备的NPOK、NPAK、NBOK、NBPK、NBGK、NPOK-2、NBGK-2在真核表达系统中表达含非天然氨基酸的抗HER2单抗，并制备与毒素的偶联物。

(1)辅助质粒的获得

辅助质粒pCMV-MbPylRS购自质粒保藏组织addgene(货号#91706)，该质粒编码哺乳动物细胞中特异性识别吡咯赖氨酸衍生非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶及对应的tRNA(识别琥珀密码子UAG)。

(2)基因阅读框内部含有琥珀密码子的抗HER2抗体(曲妥珠单抗)表达载体的构建

通过全基因合成的方式合成编码曲妥珠单抗的重链和轻链DNA(对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)，并亚克隆至真核表达载体pCDNA3.1+，再将得到的表达载体进行点突变，获取重链阅读框第142位氨基酸密码子被突变为琥珀密码子的表达质粒pCDNA3.1-Trastuzumab-UAG142，其图谱见图7，其完整序列见SEQ ID NO:7。

曲妥珠单抗的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:5)如下：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

曲妥珠单抗的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:6)如下：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

表达质粒pCDNA3.1-Trastuzumab-UAG142的基因序列(SEQ ID NO:7)如下：

GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTATGTACCGGATGCAGCTGCTGAGCTGTATCGCCCTGTCTCTGGCCCTCGTGACCAACAGCGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGAATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTAGTAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCTAGTGCGTAGACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAGTGATAAGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGTACCGCATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACGTGAACACCGCCGTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTCCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCAGATCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACCCCCCCCACATTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGAAACAGCCAGGAAAGCGTGACAGAGCAGGATTCCAAGGATTCCACATACAGCCTGAGCAGCACACTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACACACCAGGGACTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTCAACAGAGGAGAATGCTGATGATCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGC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(3)插入非天然氨基酸

使用悬浮驯化的HEK293细胞，以0.3×10⁵/mL密度接种至Wayne293^TM培养基(Quacell Biotechnology，货号A21501)，使用1L的摇瓶，装液量240mL，在120rpm、5％CO₂、80％湿度的条件下震荡培养，当细胞密度达到约1×10⁶/mL时进行转染，提取步骤(1)和(2)描述的辅助质粒pCMV-MbPylRS与表达质粒pCDNA3.1-Trastuzumab-UAG142，并去除内毒素备用，每个摇瓶转染时使用表达质粒和辅助质粒各120μg，将质粒加入离心管中，用1×PBS缓冲液稀释至7.2mL，再在另一个离心管中加入PEI转染试剂(聚乙烯亚胺，Polyethyleneimine)720μg，再加入1×PBS缓冲液稀释至7.2mL，混匀后将两个离心管各静置5分钟，再将两个离心管中的液体轻混匀后静置10分钟，缓慢滴加共14.4mL至1L摇瓶的240mL的细胞悬液中，并在滴加过程中不断轻轻摇匀，120rpm、5％CO₂和80％湿度的条件下震荡培养4h后添加终浓度为1mM的非天然氨基酸，再继续120rpm、5％CO₂、80％湿度的条件下震荡培养5天，收获细胞培养上清用于纯化抗体。

(4)纯化

采用HiTrap Protein A，1ml预装柱纯化细胞培养上清，洗脱缓冲液为100mmol/L甘氨酸，200mmol/L醋酸盐，pH3.5，得到纯化后的插入非天然氨基酸的曲妥珠单抗。

(5)偶联

合成路线如下所示(以NBOK为例)：

通过肟化反应将含有氨氧末端基团的毒素(DM1-PEG-ONH2)与纯化得到的插入非天然氨基酸的曲妥珠单抗(其中R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向)进行定点偶联，得到单抗-毒素偶联物。

DM1-PEG-ONH2制备过程如下：

偶联过程的具体操作如下：将纯化得到的插入非天然氨基酸的曲妥珠单抗与DM1-PEG-ONH2以1:15的摩尔比进行混合溶清，然后采用10M醋酸调节pH至4.0，在摇床上摇晃震荡(25℃，200rpm)，48h取样，采用疏水层析原理的HPLC(HIC-HPLC)检测曲妥珠单抗的反应情况。结果显示93.0％的含NBPK曲妥珠单抗被毒素修饰，93.0％的含NBOK曲妥珠单抗被毒素修饰，87.4％的含NPOK-2曲妥珠单抗被毒素修饰，如图8A-8C所示。曲妥珠单抗偶联比例＝100％-剩余未偶联原料的比例。

偶联后的单抗-毒素偶联物通过50kDa超滤离心管进行换液，去除未反应的毒素原料，置换缓冲液为20mM组氨酸缓冲液(pH6.5)。

HIC-HPLC分析条件如下：

流动相A(2M硫酸铵，75mM K₂HPO₄，pH 7.2±0.2)；

流动相B(75mM K₂HPO₄，25％异丙醇，pH 7.2±0.2)。

(6)活性分析

采用BT-474细胞株(ATCC，货号HTB-20)，检测样品对细胞增殖抑制作用。

具体过程如下：BT-474细胞用含10％胎牛血清(Gibco，货号10099141)的ATCCHybri-Care Medium(ATCC，货号46-X)培养基，于37℃、5％二氧化碳条件下培养至足够量，在96孔细胞培养板(Corning，货号3599)中每孔接种1.5×10⁴个BT-474细胞(包括溶媒对照孔)，空白对照孔中加入不含细胞的培养基，80μL/孔。将含NBOK的曲妥珠单抗和DM1修饰的含NBOK曲妥珠单抗从17μg/mL梯度稀释至0.13μg/mL，共8个浓度，每一稀释度2个复孔。将稀释好的样品转移至已接种BT-474细胞的培养板内，每孔10μL，在溶媒对照孔和空白对照孔中加入10μL培养基，于37℃、5％二氧化碳条件下培养。第5天每孔加入10μL CCK-8(碧云天，货号C0043)检测试剂，于37℃、5％二氧化碳条件下显色6h，酶标仪于450nm波长下读取光密度值。用下列公式来计算检测样品的抑制率(Growth inhibition)：抑制率(％)＝(OD化合物–OD空白对照)/(OD溶媒对照–OD空白对照)×100％。在Excel中计算不同浓度化合物的抑制率，然后用GraphPad Prism7软件作抑制曲线图和计算IC50。结果见图9。该结果显示DM1修饰的含NBOK曲妥珠单抗相比含NBOK曲妥珠单抗，IC50低约3倍，肿瘤杀伤效果得到显著提升。

(7)DM1修饰的含非天然氨基酸的曲妥珠单抗的稳定性考察

偶联后的单抗-毒素偶联物通过50kDa超滤离心管(Millipore，货号UFC905024#)进行换液，去除未反应的毒素原料。置换缓冲液为20mM组氨酸缓冲液(pH6.0)。蛋白溶液分成三份，分别用1M柠檬酸溶液或1M Tris溶液调节pH4.0、pH6.0、pH8.0，置于25℃水浴中，分别于24h、48h、72h、96h和120h取样，HIC-HPLC检测(检测条件同上)，结果见表2。

表2 DM1修饰的含NBOK的曲妥珠单抗在25℃、不同pH下的稳定性

表2的结果表明，本发明提供的DM1修饰的含非天然氨基酸的曲妥珠单抗中，所形成的肟键在低pH下仍相对较稳定。

实施例11 Lys-azido的活性基团还原现象

(1)高分辨质谱分析产物分子量

参考文献(宋礼华等，生物学杂志，16(1)：6-8,1999)的分泌型生长激素表达方法，根据文献中提供的信号肽序列，在表达载体上rhGH的N端添加OmpA信号肽编码序列，结合实施例8中的辅助质粒pSupAR-MbPylRS，构建K140密码子突变为琥珀密码子(TAG)的rhGH的OrigamiB(DE3)表达菌株，通过在发酵过程中添加Lys-azido，表达第140位突变为Lys-azido的天然rhGH，编号为rhGH-Lys-azido-140；通过在发酵过程中添加NBOK，表达第140位突变为NBOK的天然rhGH，编号为rhGH-NBOK-140，并参考上述参考文献相应纯化手段提纯。将rhGH-Lys-azido-140和rhGH-NBOK-140通过液质联用(高分辨质谱仪：XevoG2-XS Q-Tof，Waters公司；超高效液相色谱：UPLC(Acquity UPLC I-Class)，Waters公司)分析完整分子量。

如图10A所示，rhGH-Lys-azido-140样品中出现了比理论分子量(22265Da)小26Da的组分，该组分推断为由Lys-azido末端的叠氮结构(-N₃)被还原为(-NH₂)的产物，说明目前常用的非天然氨基酸Lys-azido在插入蛋白时叠氮基不稳定，容易被还原形成还原产物，因此会失去偶联活性。如图10B所示，rhGH-NBOK-140样品未出现比例较高的杂质，表明NBOK相比Lys-azido，制备获得的重组蛋白产物更加稳定。

(2)偶联效率比较

如上述反应路线所示，通过Click反应将30KD BCN-PEG(参照中国专利CN112279906A自制)与rhGH-Lys-azido-140定点偶联(其中R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向)。用pH7.0 PBS缓冲液调节上述获得的目的蛋白至0.5mg/ml，分别按照1：15和1：25(摩尔比，重组蛋白：30KD BCN-PEG)，将BCN-PEG固体投入rhGH-Lys-azido溶液中，充分摇晃溶解，得到澄清透明的溶液，之后将反应液密封，在恒温摇床(25℃，70rpm)中摇晃反应。每隔一段时间，取样用SDS-PAGE检测反应结果，72h后反应停止，转化率约50％-70％。反应结果见图11A。

参考实施例8，通过肟化反应将30KD氨氧基PEG与rhGH-NBOK-140定点偶联。每隔一段时间，取样用SDS-PAGE检测反应结果，48h后反应停止，转化率约90％。反应结果见图11B。

结合高分辨质谱分子量检测结果可以判断Lys-azido的还原导致产物无法与BCN-PEG偶联，由此降低了偶联率。而包含本发明的非天然氨基酸的重组蛋白与PEG进行偶联时，转化率明显高于包含Lys-azido的重组蛋白，而且反应时间也明显缩短，因此显著提高了反应效率。

除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。