以蟹壳为原料联产壳寡糖和海鲜风味料基料的生产方法
阅读说明：本技术 以蟹壳为原料联产壳寡糖和海鲜风味料基料的生产方法 (Production method for co-producing chitosan oligosaccharide and seafood flavor base material by taking crab shells as raw materials ) 是由 陈丽花 曾文华 蔡孝文 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种以蟹加工的下脚料蟹壳等为原料联产壳寡糖和海鲜风味料基料的生产方法。本发明的处理步骤包括粉碎、脱钙、脱蛋白、酶解提糖、浓缩冻干等工艺,同时制得了壳寡糖和海鲜风味料蛋白水解物基料两种产品。通过本方法,既可以获得与市售的食品级壳寡糖在纯度及平均聚合度方面相似、但抗氧化活性更高的壳寡糖,也可以同时获取制备海鲜风味料的蛋白水解物基料,不仅有效利用了蟹加工的下脚料蟹壳等废弃物,提高了蟹产品的加工附加值,而且减少了环境污染,工艺过程绿色、无污染,且生产设备简单、成本低,易于实现工业化生产,对于蟹产业的健康发展具有十分重要的意义。(The invention discloses a production method for co-producing chitosan oligosaccharide and seafood flavor base stock by taking crab shells and the like which are leftovers of crab processing as raw materials. The processing steps of the invention comprise the processes of crushing, decalcification, deproteinization, enzymolysis sugar extraction, concentration, freeze-drying and the like, and two products of chitosan oligosaccharide and seafood flavor material protein hydrolysate base materials are simultaneously prepared. By the method, the chitosan oligosaccharide which is similar to the food-grade chitosan oligosaccharide sold in the market in the aspects of purity and average polymerization degree but has higher antioxidant activity can be obtained, and the protein hydrolysate base material for preparing the seafood flavor material can be obtained at the same time, so that wastes such as crab shells, which are leftovers in crab processing, are effectively utilized, the processing added value of crab products is improved, the environmental pollution is reduced, the process is green and pollution-free, the production equipment is simple, the cost is low, the industrial production is easy to realize, and the method has very important significance for the healthy development of the crab industry.)
技术领域
本发明涉及一种以蟹壳为原料联产壳寡糖和海鲜风味料基料的生产方法，属于食品加工技术领域。
背景技术
壳聚糖是一种天然的阳离子多糖，可由自然界中含量丰富的几丁质脱乙酰而产生。壳寡糖(chitooligosaccharide，COS)是由D－氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)之间通过β-1,4－糖苷键连接而成的聚合度(Degree of polymerization，DP)在2-20的低聚糖。壳寡糖作为一种重要的功能性低聚糖，其具有毒性低、体内蓄积效应弱、水溶性好等特点。同时，还被证实有提高机体免疫、肝脏保护和肿瘤抑制等重要生理活性，是一种重要的新食品原料，其在医学、化妆品、食品和农业等多个领域也有很多相关的应用。近几年成为国内外食品健康领域的研究热点。
我国拥有约300万平方公里的领海面积以及1.8万多公里长的大陆海岸线，水产资源丰富。沿海地区如浙江舟山等地海洋渔业资源丰富，其中蟹蟹类产量约占海水产品总产量的20-25％。舟山群岛也遍布着许多海鲜餐馆和加工厂，由于可食用部分仅占总重量的约40％，蟹类被食用或加工后产生了大量的蟹壳。虽然有部分蟹壳被作为生产饲料、肥料的原料，但大部分蟹壳都没有得到充分利用，被废弃在垃圾场或倾倒回大海。这些废弃蟹壳不但造成了环境污染，也造成了资源的浪费。据统计，废弃蟹壳干重中钙类物含量含约占30-60％，蛋白质约占20-40％，甲壳素占20-30％，剩下为脂肪、蟹青素等色素。甲壳类海鲜作为海鲜产品的代表，其甲壳中含有的甲壳素经过提取和转化可得到壳聚糖、壳寡糖等多糖，在食品、生物医疗等领域有广泛的应用。如何更好地对这些废弃蟹壳进行资源化利用，将其转化为重要的工业产品，无论对促进渔业长期健康的发展，提高经济附加值，还是对海洋环境的保护，都有着潜在的巨大价值。
发明内容
本发明所要解决的问题是：提供一种以蟹壳为原料联产壳寡糖和海鲜风味料的蛋白水解物基料的生产方法。
为了解决上述问题，本发明提供了一种以蟹壳为原料联产壳寡糖和海鲜风味料基料的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将蟹壳烘干至恒重，然后粉碎，过筛，即得到蟹壳粉；
步骤2)：在蟹壳粉中加入L-苹果酸反应，离心，取沉淀物，将沉淀物烘干至恒重，即得脱钙蟹壳粉；
步骤3)：将脱钙蟹壳粉加水混合调糊，调节pH值为7，然后添加中性蛋白酶与碱性蛋白酶的复合蛋白酶，酶解，将酶解液离心，离心所得上清液即为海鲜风味料基料，离心所得沉淀物烘干至恒重，即得脱蛋白蟹壳粉；
步骤4)：将脱蛋白蟹壳粉与水混合调糊，调节pH值为5，然后添加胃蛋白酶，反应，再加入纤维素酶和α-淀粉酶，酶解，将酶解液离心，取上清液；
步骤5)：将步骤4)所得上清液加热进行灭酶处理，然后进行超声处理，离心，所得上清液即为壳寡糖水溶液；
步骤6)：取壳寡糖水溶液置于水浴锅内加热浓缩，浓缩物用等体积的无水乙醇洗涤后，冷冻，待完全冷冻后放入冷冻干燥机中干燥，即得壳寡糖成品。
优选地，所述步骤1)、步骤2)、步骤3)中烘干的方法均为：50℃烘干至恒重；所述步骤2)、步骤3)、步骤4)、步骤5)中离心的工艺参数均为：4000rpm，5min。
优选地，所述步骤2)中L-苹果酸的浓度为0.5-3.0mol/L，蟹壳粉与L-苹果酸的比例为1g:10-50mL；所述反应的时间为10-60min。
更优选地，所述L-苹果酸的浓度为1mol/L L-苹果酸，蟹壳粉与L-苹果酸的比例为1g:10mL；所述反应的时间为20min。
优选地，所述步骤3)中脱钙蟹壳粉与水的比例为1g:10-26mL；所述中性蛋白酶与碱性蛋白酶的质量比为3:1，复合蛋白酶的添加质量浓度为1-5％；所述酶解的温度为45-65℃，时间为3.0-5.0h。
更优选地，所述脱钙蟹壳粉与水的比例为1g:10mL；所述复合蛋白酶的添加质量浓度为3％；所述酶解的温度为55℃，时间为4.5h。
优选地，所述步骤4)中脱蛋白蟹壳粉与水的比例为1g:10-26mL；所述胃蛋白酶的添加质量浓度为1-5％；所述反应的温度为35℃，时间为1.5h；所述纤维素酶、α-淀粉酶的添加质量浓度均为3％；所述酶解的温度为35-55℃，时间为4.0-6.0h。
更优选地，所述脱蛋白蟹壳粉与水的比例为1g:14mL；所述胃蛋白酶的添加质量浓度为4％；所述酶解的温度为50℃，时间为3.5h。
优选地，所述步骤5)中灭酶处理具体为：100℃沸水中加热5-25min；所述超声处理的功率为500W，时间为5-25min。更优选地，100℃沸水中加热5min；所述超声处理的功率为500W，时间为10min。
优选地，所述步骤6)中水浴锅的温度为45-65℃，浓缩至体积缩小为浓缩前的30％；所述冷冻的温度为-80℃，时间为4.0h；所述干燥的时间为48h。
更优选地，所述步骤6)中水浴锅的温度为65℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以蟹加工的蟹壳等下脚料为原料，利用二次酶解法来制备壳寡糖，制备壳寡糖，本工艺既可以绿色提取壳寡糖，也可联产获取制备海鲜风味料的蛋白水解物基料，工艺过程简单、绿色、无污染，且生产设备简单、成本低，易于实现工业化生产。不仅提高了蟹产品的加工附加值、拓展了其废弃物的综合利用途径，还有效减少了环境污染，对于蟹产业的健康发展具有重要意义。
附图说明
图1为本发明提供的生产方法的工艺流程图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
各实施例中所用的原料均为市售产品。所用原料如表1所示。
表1
品名
厂家
等级
蟹壳
上海市奉贤区海湾镇超市
食品级
碱性蛋白酶(200U/g)
晟发生物科技有限公司
食品级
中性蛋白酶酶(100U/g)
南宁庞博生物工程有限公司
食品级
胃蛋白酶(200U/g)
江苏鸿诗生物科技有限公司
食品级
α-淀粉酶(1000U/g)
邢台万达生物工程有限公司
食品级
纤维素酶(10000U/g)
湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司
食品级
L-苹果酸
常茂生物化学工程股份有限公司
食品级
本发明中的各用量百分比如无特殊说明，均为质量百分比。
本发明中的检测方法如下：
1、还原糖的测定方法：3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法
a.对照品溶液制备
准确称取20mg无水葡萄糖对照品，放之于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度定容，摇匀，即得对照品溶液(每1mL含无水葡萄糖1mg)。
b.标准曲线制备
精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别加入一定量水使体积一致为1.0mL，准备好加热设备后，分别加入DNS试液1.5mL，混匀。于沸水浴中加热5min，可见溶液颜色出现变化，用冰袋快速冷却至室温，立即取出加20mL水，此时可能会有颜色不均问题，切记摇匀后测定，以未加入对照品的试管为空白，在波长为520nm处测定吸光度，以吸光度、浓度作为两轴绘制标准曲线。
c.样品测量
量取1mL壳寡糖样品于试管中，加入1.5mL DNS试剂，摇匀。其余操作同上标准曲线的制备。并根据标准曲线可对应得到还原糖含量。
2、抗氧化活性的测定方法：DPPH自由基清除率
a.DPPH试剂配制
称取DPPH 0.0158g，用无水乙醇溶解并定容至200mL棕色容量瓶中，得到浓度为0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液。
b.L-抗坏血酸对照品配制
准确称取L-抗坏血酸0.01g，用蒸馏水溶解，并加入容量瓶中，定容至20mL。配制成对照品溶液，浓度为0.5mg/mL。
c.样品测定
分别取一定量酶解的样品溶液和Vc对照品溶液于试管，分别加入同体积DPPH无水乙醇溶液，放于室温遮光处(暗处)静置，30min后拿出，同时要准备好壳寡糖样品同无水乙醇的样品以及空白样。为防止溶液有效成分的分解，在暗处放置时间满后应立即并快速在波长为517nm处测定其吸光度值(以无水乙醇作为空白)。结果可由下式计算得出：
式中Ai为样品同DPPH溶液的吸光度；Aj为样品同无水乙醇的吸光度；Ac为DPPH溶液同无水乙醇的吸光度。
所得的蟹壳酶解脱蛋白正交优化试验因子水平表、蟹壳酶解脱蛋白正交优化试验结果分别如表2、表3所示。
表2正交优化试验条件
序号
A时间/h
B温度/℃
C料液比
D加酶量％
1
4
55
1:10
3
2
4.5
60
1:14
4
3
5
65
1:18
5
表3正交优化试验结果
序号
A时间/h
B温度/℃
C料液比
D加酶量％
蛋白去除率％
1
4
55
1:10
3
35.02
2
4
60
1:14
4
20.95
3
4
65
1:18
5
16.20
4
4.5
55
1:14
5
24.31
5
4.5
60
1:18
3
17.40
6
4.5
65
1:10
4
31.82
7
5
55
1:18
4
14.78
8
5
60
1:10
5
32.64
9
5
65
1:14
3
17.98
壳寡糖酶解提取的响应面实验安排及其还原糖实验结果见表4、5。
表4 Box-Behnken回归方程方差分析——壳寡糖还原糖含量
表5 Box-Behnken回归方程方差分析——壳寡糖抗氧化活性
实施例1
一种以蟹壳为原料联产壳寡糖和海鲜风味料基料的生产方法，具体步骤为：
(1)步骤1：将蟹壳在50℃低温烘干至恒重，然后将烘干的蟹壳粉碎，过80目筛，即得到蟹壳粉；
(2)步骤2：称取步骤1中蟹壳粉加入1.0mol/L L-苹果酸，其料液比为1:10(g/mL)，反应20min后，在4000rpm条件下离心5min取沉淀物，将沉淀物在低温50℃下烘干至恒重得到脱钙的蟹壳粉；
(3)步骤3：将步骤2得到脱钙的蟹壳粉；按蟹壳粉与水的质量比为1:10(g/mL)混合调糊，调pH为7，添加质量浓度为3％的复合蛋白酶(中性蛋白酶：碱性蛋白酶为3:1)，55℃条件下酶解4.5h，然后将酶解液在4000rpm条件下离心5min，上清液即为制备海鲜风味料的蛋白水解物基料；将沉淀物在50℃下烘干至恒重得到脱蛋白的蟹壳粉；
(4)步骤4：将步骤3得到脱蛋白的蟹壳粉，按蟹壳粉与水的质量比为1:10(g/mL)混合调糊，调pH为5，添加质量浓度为4％的胃蛋白酶反应1.5h后，再加入3％纤维素酶和3％的α-淀粉酶，50℃条件下酶解3.5h，然后将酶解液在4000rpm条件下离心5min，取上清液；
(5)步骤5：将步骤4所得到的上清液迅速放置于100℃沸水中加热5min进行灭酶处理后进行超声处理10min，在4000rpm离心5min，取上层清液；
(6)步骤6：取步骤5中上清液于65℃水浴锅内加热浓缩，浓缩液至约30％左右时用等体积的无水乙醇洗涤，将沉淀物放入-80℃冰箱预冻4.0h后放入冷冻干燥机干燥中干燥48h，即得到壳寡糖成品。
此生产工艺所得壳寡糖，蟹壳的除蛋白率为33.98％，壳寡糖得得率为42.72％，产品的抗氧化活性(DPPH自由基清除率)为81.72％。
实施例2
一种从蟹壳中提取壳寡糖的绿色生产方法，具体步骤为：
(1)步骤1：将蟹壳在50℃低温烘干至恒重，然后将烘干的蟹壳粉碎，过80目筛，即得到蟹壳粉；
(2)步骤2：称取步骤1中蟹壳粉加入1.0mol/L L-苹果酸，其料液比为1:10(g/mL)，反应20min后，在4000rpm条件下离心5min取沉淀物，将沉淀物在低温50℃下烘干至恒重得到脱钙的蟹壳粉；
(3)步骤3：将步骤2得到脱钙的蟹壳粉；按蟹粉与水的质量比为1:18(g/mL)混合调糊，调pH为7，添加质量浓度为5％的复合蛋白酶(中性蛋白酶：碱性蛋白酶为3:1)，60℃条件下酶解3.5h，然后将酶解液在4000rpm条件下离心5min，上清液即为制备海鲜风味料的蛋白水解物基料。将沉淀物在低温50℃下烘干至恒重得到脱蛋白的蟹壳粉；
(4)步骤4：将步骤3得到脱蛋白的蟹壳粉，按蟹壳粉与水的质量比为1:10(g/mL)混合调糊，调pH为5，添加质量浓度为3％的胃蛋白酶反应1.5h后，再加入3％的纤维素酶和3％的α-淀粉酶，45℃条件下酶解5.0h，然后将酶解液在4000rpm条件下离心5min，取上清液；
(5)步骤5：将步骤4所得到的上清液迅速放置于100℃沸水中加热5min，进行灭酶处理后进行超声处理10min，在4000rpm离心5min，取上层清液；
(6)步骤6：取步骤5中上清液于65℃水浴锅内加热浓缩，浓缩液至约30％左右时用等体积的无水乙醇洗涤，将沉淀物放入-80℃冰箱预冻4.0h后放入冷冻干燥机干燥中干燥48h，即得到壳寡糖成品。
此生产工艺所得壳寡糖，蟹壳的除蛋白率为16.20％，壳寡糖得率为31.28％，抗氧化活性(DPPH自由基清除率)为46.90％。
实施例3
一种从蟹壳中提取壳寡糖的绿色生产方法，具体步骤为：
(1)步骤1：将蟹壳在50℃低温烘干至恒重，然后将烘干的蟹壳粉碎，过80目筛，即得到蟹壳粉；
(2)步骤2：称取步骤1中蟹壳粉加入1.0mol/L L-苹果酸，其料液比为1:10(g/mL)，反应20min后，在4000rpm条件下离心5min取沉淀物，将沉淀物在低温50℃下烘干至恒重得到脱钙的蟹壳粉；
(3)步骤3：将步骤2得到脱钙的蟹壳粉；按蟹壳粉与水的质量比为1:18(g/mL)混合调糊，调pH为7，添加质量浓度为4％的复合蛋白酶(中性蛋白酶：碱性蛋白酶为3:1))，55℃条件下酶解5.0h，然后将酶解液在4000rpm条件下离心5min，上清液即为制备海鲜风味料的蛋白水解物基料。将沉淀物在低温50℃下烘干至恒重得到脱蛋白的蟹粉；
(4)步骤4：将步骤3得到脱蛋白的蟹壳粉，按蟹壳粉与水的质量比为1:10(g/mL)混合调糊，调pH为5，添加质量浓度为5％的胃蛋白酶反应1.5h后，再加入3％的纤维素酶和3％的α-淀粉酶，45℃条件下酶解4.0h，然后将酶解液在4000rpm条件下离心5min，取上清液；
(5)步骤5：将步骤4所得到的上清液迅速放置于100℃沸水中加热5min，进行灭酶处理后进行超声处理10min，在4000rpm离心5min，取上层清液；
(6)步骤6：取步骤5中上清液于65℃水浴锅内加热浓缩，浓缩液至约30％左右时用等体积的无水乙醇洗涤，将沉淀物放入-80℃冰箱预冻4.0h后放入冷冻干燥机干燥中干燥48h，即得到壳寡糖成品。
此生产工艺所得壳寡糖，蟹壳的除蛋白率为14.78％，壳寡糖的产率为32.08％，抗氧化活性(DPPH自由基清除率)为46.90％。
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