具体实施方式

以下实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例、只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

实施例1：重组新型冠状病毒蛋白NCP-RBD在5L生物反应器中的规模化培养

本重组蛋白规模化培养生产工艺分为两部分，细胞复苏与扩增培养和罐培养，细胞 复苏与扩增培养采用EX-CELL CD CHO Fusion培养基，罐培养采用EX-CELL-AdvancedCHO Fed-batch基础培养基作为起始培养，EX-CELL-Advanced CHO Feed 1补料培养基 进行流加培养增加重组蛋白表达，工艺参数具体如下：

(1)细胞复苏

从液氮罐中取工作细胞株(细胞株为表达重组新型冠状病毒NCP-RBD蛋白的重组CHO细胞株，购买于北京智仁美博生物科技有限公司，购买的细胞株可以直接用于下 面的操作，作为优选地方案，将购买的细胞株进行三级细胞库的建立后在进行下面的操 作)，按初始密度不低于3.0×10⁵个/ml接种至EX-CELL CD CHO Fusion培养基中，置 于37±1℃，5±1％CO₂，100～150rpm条件下培养2～4天，作为细胞复苏培养物。

(2)细胞扩增培养

将细胞复苏培养物，按初始密度不低于3.0×10⁵个/ml接种至EX-CELL CD CHOFusion培养基中，置于37±1℃，5±1％CO₂，100～150rpm条件下培养2～4天，如此进行 2～5次传代扩增培养，作为细胞扩增培养物。

(3)罐培养

将检定合格的细胞扩增培养物(检定合格的细胞扩增培养物为细胞密度不小于1.0 ×10⁶个/ml且细胞活率不低于90％的细胞扩增培养物。)，接种至生物反应器中进行罐培养，初始密度不低于3.0×10⁵个/ml，采用EX-CELL-Advanced CHO基础培养基作为 罐培养起始培养基，起始工作体积3L，设定温度36.5±1℃，转速不高于350rpm，pH不 低于6.5，控制溶氧不低于45％：当培养3～4天时，开始流加补充EX-CELLAdvanced CHO Feed 1补料培养基，补料量占比起始工作体积10±1％，每次补料间隔1～2天；当培养4～5天时，开始补糖，通过补加葡萄糖控制培养液中葡萄糖含量≥1g/L。当培养时间达到 7～13天且细胞活率为90±10％时，下罐，得到细胞收获液，即为生产收获物。

(4)在培养过程中每天取样检测细胞密度、抗原含量和蛋白纯度，发现细胞密度、抗原含量、和抗原纯度均随着培养的天数增加而增加，在培养至7天时细胞密度达到 1.0×10⁷个/ml以上，抗原含量达到600μg/ml以上，抗原纯度达到71.7％，结果见图9。

实施例2：三批连续规模化培养表达重组新型冠状病毒蛋白NCP-RBD

(1)通过实例1的方法进行连续三批罐培养，验证重组新型冠状病毒蛋白NCP-RBD的中试规模化培养工艺。

(2)在培养过程中每天取样检测细胞密度、抗原含量和蛋白纯度，发现细胞密度、抗原含量、和抗原纯度均随着培养的天数增加而增加，在培养至8天时细胞密度达到 1.0×10⁷个/ml以上，抗原含量均达到500μg/ml以上，最终产物的抗原纯度(蛋白纯度) 均达到50％以上，具体结果见如下表1。

表1连续三批罐培养所得产物中细胞密度和抗原含量测定

实施例3：重组新型冠状病毒蛋白NCP-RBD的纯化工艺

采用实施例1生产的表达重组新型冠状病毒蛋白NCP-RBD的生产收获物(细胞收获液)，用于重组蛋白的分离纯化，具体步骤如下：

(1)澄清过滤，采用低速离心及深层过滤进行细胞收获澄清液，获得NCP-RBD 澄清液。

1)低速离心200～1000g，5～20min，优先选择220g，10min；

2)深层过滤滤器为Supracap 100囊式滤器，标称精度为0.5～15μm；

3)膜包清洗：用纯化水清洗5～10个膜体积，再用10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0) 润洗1～5个膜体积；

4)离心后上清液用深层过滤囊式滤器进行过滤；过滤后用10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)顶洗至少1个膜体积，即为澄清液。

(2)超滤浓缩：采用超滤膜包对澄清液进行浓缩和洗滤，获得浓缩液。

1)超滤膜包为10kD～50kD超滤膜包(Pellicon 2mini cassette)；

2)膜包清洗：用纯化水清洗5～10个膜体积，再用0.5MNaOH清洗1～5个膜体积， 循环至少30min；最后用纯化水清洗5～10个膜体积；

3)膜包润洗：用10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)润洗1～5个膜体积；

4)澄清液用10kD～50kD超滤膜包浓缩2～10倍；浓缩后样品用10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)洗滤2～10倍，即为浓缩液。

(3)阴离子柱层析

1)层析填料名称：选用带有-CH₂N+(CH₃)₃季铵基功能基团的阴离子交换填料，如 QSephorase HP、Q Betarose HP等；

2)柱平衡：用10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)平衡8～15个柱体积；

3)上样：将浓缩液直接上样，UV₂₈₀达到100～300mAU开始收集流穿峰；

4)复平衡：上样结束后用10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)复平衡5～10个柱体积，UV280下降至100～300mAU停止收集流穿峰；

5)浓缩液经阴离子柱层析，杂蛋白与填料结合，目的蛋白以流穿模式收集，电泳检测纯度图谱见图6，第一步柱纯化液纯度达到70％以上。

(4)阳离子柱层析

1)层析填料名称：采用带有-CH₂CH₂CHSO₃黄丙基功能基团的阳离子交换填料， 如POROS 50HS、Diamond SPMustang；

2)柱平衡：用10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)平衡5～10个柱体积；

3)上样：将第一步柱纯化液直接上样；

4)复平衡：上样结束后用10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)复平衡5～10个柱体积；

5)洗脱：用含不低于0.1M NaCl的10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)洗脱，UV₂₈₀达到100～300mAU开始收集洗脱峰，至UV280下降至100～300mAU停止收峰；

6)Q流穿经阳离子柱层析，目的蛋白以洗脱模式收集，电泳检测纯度图谱见图6，第二步柱纯化液纯度达到95％以上。

(5)灭活，采用低pH法对第二步柱纯化液稀释液进行病毒灭活。

1)稀释：向第二步柱纯化液加入适量的10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)稀释至蛋白质含量400～800μg/ml；

2)灭活：用磷酸溶液将稀释后的蛋白溶液pH值调节至3～4，混匀后，置于15～26℃， 灭活2～4h；用NaOH溶液回调pH值至6～8，即为灭活液；

(6)纳滤去除病毒和除菌过滤，将灭活液依次进行纳滤去除病毒和0.2μm滤膜过滤除菌。

1)除病毒预过滤滤器为Fluorodyne II Filter，纳滤滤器为SV4除病毒过滤器，滤器 供应商：PALL

2)滤膜清洗：无菌水冲洗5～10个膜体积；

3)滤膜润洗：用10～30mM PB缓冲液(pH6.0～7.0)润洗1～5个膜体积；

4)纳滤除病毒：灭活液通过纳滤去除病毒。

5)除菌过滤滤器为Supor EKV膜AcroPak20过滤器，滤器供应商：PALL；

6)除菌过滤：纳滤除病毒后样品经0.2μm过滤器除菌，即为原液。

最终，4L细胞收获液可获得蛋白达到1062mg，纯化终产物经高效液相色谱法(分子排阻色谱法和反相色谱法)检测，纯度均为100％，检测图谱分别见图7和图8；各 步骤关键中间品的蛋白回收率和抗原回收率见如下表2，最终纯化的蛋白回收率为 13.0％，抗原回收率为44.2％。

表2纯化过程关键步骤蛋白回收率及抗原回收率

本实施例得到的CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP-RBD蛋白可以用于制备 新冠疫苗，优选地，选择本发明的纯化后得到的重组新型冠状病毒NCP-RBD蛋白，加 入氢氧化铝佐剂制成新冠疫苗，新冠疫苗中蛋白浓度为50μg/ml。

实施例4：三批连续中试规模纯化重组新型冠状病毒蛋白NCP-RBD

(1)通过实例3的纯化方法进行连续三批中试规模纯化，验证重组新型冠状病毒蛋白NCP-RBD的中试规模纯化工艺。

(2)在纯化过程中，对关键步骤的中间品，即澄清液、浓缩液、第一步柱纯化液、 第二步柱纯化液取样检测蛋白质含量、抗原含量和蛋白纯度，以考察关键工艺参数控制 范围的合理性以及纯化过程中杂质去除的有效性。

3批次关键步骤的中间品和原液采用电泳法检测抗原纯度，澄清液、浓缩液、第一步柱纯化液、第二步柱纯化液和原液的纯度分别大于50％、60％、70％、95％和95％， 最终纯化的蛋白回收率可以达到10％以上，抗原回收率可达到30％以上，结果见如下表 3。说明每步纯化步骤均能提高蛋白的纯度，并可以获得较高的蛋白或抗原回收率，故 原液制备过程中的纯化工艺各关键步骤相关参数的设置是合理的，生产工艺可以保证抗 原纯度和回收率符合要求，结果的重现性良好，工艺稳定、可控。

表3连续三批纯化中间品的纯度和回收率检测结果

一、重组新型冠状病毒蛋白NCP-RBD的柱层析工艺填料对比实验

根据重组新型冠状病毒NCP-RBD蛋白性质，以及不同层析填料的特性，分别选用强阳离子交换树脂(POROS 50HS)、弱阳离子交换树脂(CM Sepharose FF)、强阴离 子交换树脂(Q Sepharose HP)、弱阴离子交换树脂(DEAE Sepharose FF)等填料进行对 比实验。

对比例1：Q柱层析

采用Q Sepharose HP填料，使用10～30mM PB缓冲液(pH7.0～8.0)平衡填料；取实施例1制得的细胞收获液，经澄清获得澄清液，上样4个柱体积，若流穿出峰，则收 集流穿峰，并取样；用含不同NaCl浓度(0.2M～1.0M)的10～30mM PB缓冲液(pH7.0～8.0) 洗脱，收集洗脱峰后混匀取样；Q柱层析样品电泳检测结果见图1，上样pH8.0时，均 以流穿模式捕获目的抗原，大分子杂蛋白与填料结合后被去除。

对比例2：DEAE柱层析

采用DEAE Sepharose FF填料，使用10～30mM PB缓冲液(pH7.0～8.0)平衡填料；取实施例1制得的细胞收获液，经澄清获得澄清液，上样4个柱体积，若流穿出峰，则 收集流穿峰，并混匀取样；用含不同NaCl浓度(0.2M～1.0M)的10～30mM PB(pH7.0～8.0) 缓冲液洗脱，收集洗脱峰后混匀取样；DEAE柱层析样品电泳检测结果见图2，由于小 部分抗原与DEAE Sepharose FF填料结合，洗脱中含有目的抗原，造成抗原损失。

对比例3：CM柱层析

采用CM Sepharose FF填料，使用10～30mM PB缓冲液(pH7.0～8.0)平衡填料；取实施例1制得的细胞收获液，经澄清获得澄清液，上样4个柱体积，若流穿出峰，则收 集流穿峰，并取样；用含不同NaCl浓度(0.2M～1.0M)的10～30mM PB缓冲液(pH7.0～8.0) 洗脱，收集洗脱峰后取样；CM柱层析样品电泳检测结果见图3，上样pH7.0时，采用 CM Sepharose FF层析，目的抗原和大分子杂蛋白均以流穿模式被收集，无法提高目的 抗原纯度，同时也未达到去除杂质的目的。

对比例4：POROS柱层析

采用POROS 50HS填料，使用10～30mM PB缓冲液(pH7.0～8.0)平衡填料；取实 施例1制得的细胞收获液，经澄清获得澄清液，上样15～25个柱体积，调pH值至7.0 上样，若流穿出峰，则收集流穿峰，并取样；用含0.5M NaCl的10～30mM PB缓冲液 (pH7.0～8.0)洗脱，收集洗脱峰后混匀取样；POROS柱层析样品电泳检测结果见图4， POROS流穿中无目的抗原，因此目的抗原几乎全部与POROS 50HS填料结合，用含0.5M NaCl的10～30mM PB缓冲液(pH7.0～8.0)进行洗脱，经电泳检测，抗原可以被洗脱液 完全洗脱。

根据对比例1、2、3、4可以看出：选择Q Sepharose HP作为阴离子交换层析填料，POROS 50HS作为阳离子交换层析填料，其中Q Sepharose HP层析以流穿方式捕获目的 抗原；POROS 50HS层析，以洗脱模式捕获目的抗原。

二、重组新型冠状病毒蛋白NCP-RBD的灭活工艺对比实验

参照《中国药典》(现行版)，对目前病毒类疫苗现有的三种灭活工艺β-丙内酯灭活、低pH灭活、甲醛灭活进行研究，取样进行抗原纯度、抗原含量检测，通过比较对 照组和实验组抗原纯度和抗原比活的差异，进而分析灭活工艺对抗原是否存在影响，从 而选择对抗原影响最小的灭活方式。

按照下表4的灭活工艺取第二步柱纯化液稀释液分别进行β-丙内酯灭活、低pH灭活以及甲醛灭活三种灭活方式。

(1)β-丙内酯灭活工艺：取第二步柱纯化液稀释液，按照1:4000的比例加入β-丙内酯，2～8℃灭活24h，37℃水解2h；另设不加β-丙内酯作为对照组，2～8℃灭活24h， 37℃水解2h。

(2)低pH灭活工艺：取第二步柱纯化液稀释液，调节pH至3.5，室温放置4h后 调pH7.0；另设不调节pH作为对照组，室温放置4h。

(3)甲醛灭活工艺：取第二步柱纯化液稀释液，加入终浓度为100μg/ml的甲醛， 37℃放置24h；另设不加甲醛作为对照组，37℃放置24h。

表4灭活工艺对比表

表5灭活工艺研究抗原纯度及抗原比活检测结果

甲醛37℃灭活24h后，电泳检测对照组出现降解带，电泳结果见图5，因此排除甲醛灭活的方法。β-丙内酯灭活和低pH灭活，实验组电泳检测均未出现降解带，且纯度 检测均为100％，抗原比活均与灭活前基本一致(如上表5所示)；但两种方法相比， 低pH法安全性较高，操作方便，无其他物质残留，且该方法在目前抗体制备中应用广 泛；因此，选择低pH灭活的方法作为重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)原液灭活工 艺，β-丙内酯灭活作为备选方法。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征 进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例 技术方案的精神和范围。