一种利用高效液相色谱分离高良姜黄酮中高良姜素的方法
阅读说明：本技术 一种利用高效液相色谱分离高良姜黄酮中高良姜素的方法 (Method for separating galangin from galangal flavone by high performance liquid chromatography ) 是由 侯红瑞 吴文 李泽玲 云娜 岑水斌 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于黄酮类化合物分离纯化的技术领域,公开了一种利用高效液相色谱分离高良姜黄酮中高良姜素的方法。方法：S1：将高良姜进行醇提取,将提取物进行纯化,获得含有高良姜素和山奈素的纯化物；S2：采用高效液相色谱分离出含有高良姜素和山奈素的纯化物中高良姜素；高效液相色谱分离的条件：流动相为氯仿、乙酸乙酯和甲醇；氯仿、乙酸乙酯和甲醇的体积比为(1～5)∶(0.5～4)∶(1～4)。本发明的方法简单、高良姜黄酮类化合物提取率高,高良姜素的分离度高,保留时间短。(The invention belongs to the technical field of separation and purification of flavonoid compounds, and discloses a method for separating galangin from galangal flavone by using high performance liquid chromatography. The method comprises the following steps: s1: extracting rhizoma Alpiniae Officinarum with alcohol, and purifying to obtain purified extract containing galangin and kaempferide; s2: separating galangin from purified product containing galangin and kaempferide by high performance liquid chromatography; conditions of high performance liquid chromatography separation: the mobile phase is chloroform, ethyl acetate and methanol; the volume ratio of the chloroform to the ethyl acetate to the methanol is (1-5) to (0.5-4) to (1-4). The method is simple, the galangal flavonoid compound extraction rate is high, the galangin separation degree is high, and the retention time is short.)
技术领域
本发明属于黄酮类化合物分离纯化的技术领域，具体涉及一种利用高效液相色谱分离高良姜黄酮中高良姜素的方法。
背景技术
高良姜是姜科山姜属类的植物高良姜的根茎部分，这种药材的化学成分较为复杂。其中，有效成分之一为高良姜黄酮化合物，具有抗溃疡、抗腹泻等功效，可以用于制药领域。高良姜黄酮化合物主要包括高良姜素、山奈素等。高良姜素黄酮化合物具有抗肿瘤、抗细菌、抗炎等作用。为了能够更一步研究高良姜黄酮化合物中各活性成分，需要将各活性成分进行分离。
然而，由于高良姜素与山奈素等结构相似，采用常规方法将高良姜酮化合物中的高良姜素进行分离时，高良姜素和山奈素的分离度不够，仍然有待进一步提高，以实现该物质与其它物质的较为彻底的分离。另外，现有的分离方法的保留时间较长，分离速率缓慢，对于批量大的操作而言，这样低速率的纯化分析效果无疑是不实用的。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种利用高效液相色谱分离高良姜黄酮中高良姜素的方法。本发明的方法，简单，高效，高良姜素分离度高，保留时间短。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种利用高效液相色谱分离高良姜黄酮中高良姜素的方法，包括以下步骤：
S1：将高良姜进行醇提取，将提取物进行纯化，获得含有高良姜素和山奈素的纯化物；
S2：采用高效液相色谱分离出含有高良姜素和山奈素的纯化物中高良姜素；高效液相色谱分离的条件：流动相为氯仿、乙酸乙酯和甲醇；氯仿、乙酸乙酯和甲醇的体积比为(1～5)∶(0.5～4)∶(1～4)。
所述流动相中氯仿、乙酸乙酯和甲醇的体积比优选为(1～5)：4：1或者4：(0.5～2)∶1或者4∶4∶(1～4)；更优选为(2～5)∶4∶1。
步骤S1中所述提取是指将高良姜进行醇提取；所述醇为乙醇或甲醇中一种以上，优选为甲醇与乙醇的混合溶液；所述甲醇与乙醇的体积比为1∶(0.5～2)，优选为1∶1。
所述提取在超声波辅助的条件下进行；超声的功率为100～200W；所述提取的次数为2～6次，每次提取的时间为30～60min。所述提取的温度为常温。
所述纯化是指采用大孔吸附树脂进行纯化；纯化时，洗脱剂为乙醇水溶液，乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为70～90％，优选为85％；洗脱剂的洗脱流速的为0.4BV/h～0.6BV/h。洗脱后，收集滤液，浓缩，干燥。
纯化时，提取物的浓度为0.8～1.2mg/mL。
本发明采用高效液相色谱的方式，并利用改良后的流动相氯仿、乙酸乙酯和甲醇对于高良姜酮内的高良姜素进行分离纯化，通过这样的流动相的选取，使得分离度保持在1.68，优于甲醇和磷酸混合液的分离度(达到1.4左右)。另外，通过这种流动相的选取，高良姜素的保留时间提前到41.1分钟。
分离度又称分辨率，为了判断分离物质对色谱柱在色谱柱中的分离情况，常用分离度作为柱的总分离效能指标，用R表示。R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比，表示相邻两峰的分离程度，R越大，表明相邻两组分分离越好。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
本发明的方法简单，高良姜黄酮类化合物提取率高，高良姜素的分离度高，保留时间短。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细地描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的利用高效液相色谱分离高良姜黄酮中高良姜素的方法，包括以下步骤：
S1：将高良姜粉碎过筛，然后进行醇提取，将提取物进行纯化，获得含有高良姜素和山奈素的纯化物(即高良姜黄酮)；
S2：采用高效液相色谱分离出含有高良姜素和山奈素的纯化物中高良姜素。
步骤S1中所述提取是指将高良姜在醇中进行超声提取；所述醇为乙醇或甲醇中一种以上，优选为甲醇与乙醇的混合溶液；所述甲醇与乙醇的体积比为1∶(0.5～2)，优选为1∶1。超声的功率为100～200W；所述提取的次数为2～6次，每次提取的时间为30～60min。所述提取的温度为常温。超声提取时，高良姜与醇的质量体积比为1g∶(2～40)mL。
经过试验对比，单独使用甲醇和乙醇进行超声萃取的时候萃取得到提取液中的高良姜酮含量均低于40％，而采用甲醇和乙醇混合溶剂之后得到的提取物的含量在45％以上。
所述纯化是指采用大孔吸附树脂进行纯化；纯化时，洗脱剂为乙醇水溶液，乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为80～90％，优选为85％；洗脱剂的洗脱流速的为0.4BV/h～0.6BV/h。洗脱后，收集滤液，浓缩，干燥。大孔吸附树脂为黄酮类化合物纯化时的大孔吸附树脂。
步骤S2中高效液相色谱分离的条件：流动相为氯仿、乙酸乙酯和甲醇；氯仿、乙酸乙酯和甲醇的体积比为(1～5)∶(0.5～4)∶(1～4)。
所述流动相中氯仿、乙酸乙酯和甲醇的体积比优选为(1～5)∶4∶1或者4：(0.5～2)∶1或者4∶4∶(1～4)；更优选为(2～5)∶4∶1。将高良姜酮的纯化物采用5份以上的样本在步骤S2中进行高效液相色谱的分离过程，并且对于产率进行计算和平均化，并且保证相对标准偏差在3％以下。
步骤S2中高效液相色谱分离中选用的色谱柱为C18，流速为5～8mL/min；检测波长为360nm；进样量为700μL；柱温为常温。
高效液相色谱采用安捷伦公司设备，色谱柱C18为岛津ODS-3，5um，4.6mm*250mm，超声波仪器采用巩义市予华仪器公司设备；高良姜原始药材购买自同仁堂药店。
实施例1
一种利用高效液相色谱分离高良姜酮的高良姜素的方法，包括以下步骤：
S1：将干燥的高良姜粉碎，过10目筛，将高良姜粉在体积比为1∶1的甲醇和乙醇的混合溶液中进行超声辅助提取，合并提取液，获得高良姜黄酮粗提物；超声辅助提取在常温下进行，超声的功率为150W，每次提取的时间为45min，提取的次数为3次；高良姜黄酮粗提取物的高良姜酮的总含量在45.5％；
S2：将步骤S1得到的高良姜黄酮粗提取物通过吸附树脂柱(大孔吸附树脂具体为苯乙烯、二乙烯苯制成的大孔吸附树脂，如：HPD-600大孔吸附树脂)，进行纯化，得到高良姜酮纯化物，所述高良姜酮纯化物内包含高良姜素和山奈素；高良姜素黄酮粗提取物的浓度为1.0mg/mL，洗脱剂为乙醇水溶液，乙醇水溶液的乙醇体积比为85％，洗脱流速控制为0.5BV/h；洗脱后，对于收集到的过滤液进行归集浓缩和烘干，烘干温度为35℃～40℃；
S3：通过高效液相色谱对于高良姜酮纯化物进行分离，其中，检测波长为360nm，流动相采用氯仿、乙酸乙酯和甲醇；液相色谱选用的色谱柱为C18，流速为7.0mL/min；检测波长为360nm；进样量为700μ L；柱温为常温。
本实施例在步骤S3中选用不同比例的流动相(氯仿、乙酸乙酯和甲醇)进行了测试，各流动相中体积比对应氯仿、乙酸乙酯和甲醇的体积比；流动相1：体积比为4∶4∶1，流动相2：体积比为2∶4∶1，流动相3：体积比为1∶4∶1，流动相4：体积比为4∶2∶1，流动相5：体积比为4∶1∶1，流动相6：体积比为4∶0.5∶1，流动相7：体积比为4∶4∶4，流动相8：体积比为4∶4∶2。
流动相1～流动相8相应得到的分离度为：1.68、1.62、1.59、1.58、1.59、1.60、1.56、1.54。
流动相1～流动相8相应的高良姜素保留时间分别为41.1、41.3、41.6、41.5、41.6、42.0、41.8min。
本发明对于高良素药材的纯化分离过程分为了大概的三个基本步骤，第一步骤为初始的粉碎和过筛步骤，然后通过吸附树脂的方式对于药材进行进一步提取过滤，进而得到纯化后的药材。然后，通过高效液相色谱的方式，并且通过改良后的流动相氯仿、乙酸乙酯和甲醇对于高良姜酮内的高良姜素进行分离纯化，氯仿、乙酸乙酯和甲醇的体积比为4∶4∶1，通过这样的流动相的选取，使得分离度保持在1.68，高良姜素的保留时间提前到41.1分钟。相比而言，当采用甲醇和磷酸混合液的时候，甲醇和磷酸混合液的分离度达到1.4左右，保留时间在43.2分钟。
对比例1
本对比例与实施例1不同之处：高效液相色谱分离时，流动相为乙酸乙酯和甲醇，体积比为1∶1。
对比例2
本对比例与实施例1不同之处：高效液相色谱分离时，流动相为氯仿和甲醇，体积比为1∶1。
对比例3
本对比例与实施例1不同之处：高效液相色谱分离时，流动相为氯仿和乙酸乙酯，体积比为1∶1。
对比例1～3的分离度均低于1.4，其中对比例1的分离度为1.30，对比例2的分离度为1.29，对比例3的分离度为1.35。
本发明采用高效液相色谱分离高良姜素时，分离出的高良姜素纯度在99％或者以上。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。