一种酶法制备漆黄素的方法
阅读说明：本技术 一种酶法制备漆黄素的方法 (Method for preparing fisetin by enzyme method ) 是由 梁林辉 杜翠华 梁大伟 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酶法制备漆黄素的方法,包括将原料黄栌粉碎,加入柠檬酸溶液和植物提取复合酶使漆黄素充分溶出至柠檬酸溶液中；收集酶解液；将合并的酶解液浓缩成浸膏,在浸膏中加高醇至完全溶解,滤液经浓缩、结晶、干燥后得到漆黄素粗品；漆黄素粗品使用重结晶溶剂进行2次重结晶,2次重结晶后得到高纯度的漆黄素精制品。本发明采用柠檬酸溶液对漆黄素进行提取,使得酶解液中脂溶性物质极少,能够直接通过重结晶工艺完成精制,不需要柱层析工艺,减少了工艺操作难度和效率,提高了生产效率,适用于工业化生产。本发明优化了重结晶工艺,使得重结晶后得到的漆黄素精制品为针状晶体。(The invention discloses a method for preparing fisetin by an enzyme method, which comprises the steps of crushing cotinus coggygria serving as a raw material, adding a citric acid solution and a plant extraction complex enzyme to fully dissolve fisetin into the citric acid solution; collecting the enzymolysis liquid; concentrating the combined enzymolysis liquid into extract, adding high alcohol into the extract until the mixture is completely dissolved, and concentrating, crystallizing and drying the filtrate to obtain a fisetin crude product; and (3) recrystallizing the crude product of fisetin for 2 times by using a recrystallization solvent, and recrystallizing for 2 times to obtain a high-purity fisetin refined product. According to the method, the fisetin is extracted by adopting the citric acid solution, so that fat-soluble substances in the enzymolysis solution are few, the refining can be directly completed through a recrystallization process, a column chromatography process is not needed, the process operation difficulty and efficiency are reduced, the production efficiency is improved, and the method is suitable for industrial production. The invention optimizes the recrystallization process, so that the refined fisetin product obtained after recrystallization is a needle crystal.)
技术领域
本发明涉及中药活性成分提取技术领域，具体涉及到一种酶法制备漆黄素的方法。
背景技术
黄栌（Cotinus coggygria Scop.），漆树科黄栌属植物，是重要的观赏红叶树种，其根、茎可入药，用于治疗黄疸型肝炎、慢性肝炎等。药学实验表明，黄栌中有效成分主要为黄酮类化合物，尤其为漆黄素；黄栌中漆黄素含量约2%。漆黄素为黄色状物质，其分子结构如下图：
。
从漆黄素的化学结构式可以看出，3-OH存在，漆黄素属黄酮化合物中黄酮醇类，分子中所有原子都在同一平面内，以苷元形式存在于黄栌木质部；分子结构中四羟基的存在使漆黄素显一定酸性，极性增大，几乎不溶于水，不溶于苯、氯仿和石油醚。
根据相似相溶原理，目前提取漆黄素的方法主要为有机溶剂提取法。
专利1：CN201410268913.1一种从黄栌中提取漆黄素的工艺；公开了采用乙醇处理原料，超声提取后浓缩液又经大孔树脂分离等步骤得到漆黄素。
专利2：CN201210419387.5一种从黄杨木中提取漆黄素的方法；公开了使用乙醇提取，后经反复重结晶除杂质来实现分离。
专利3：CN201010500143.0一种漆黄素的提取方法，公开了以下方法：
把原料粉碎，加入10-20倍量饱和石灰水溶液浸泡提取2-3次，提取液过滤后调节pH7加入大孔树脂柱吸附，吸附结束后，水洗无糖色，再用4-6BV60-70％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液减压回收乙醇放置结晶，粗结晶滤出，5％碳酸钠溶液溶解，依次用正丁醇、乙酸乙酯萃取2-3次，去有机相，盐酸调节水相至pH4-5放置沉淀，沉淀物滤出用50-100％醇溶液回流溶解后，调节pH3-5结晶2-3次，干燥即得产品。
专利3采用石灰石氢氧化钙饱和溶液进行提取，提取液使用大孔树脂进行吸附，但是饱和氢氧化钙溶液容易形成沉淀类型的杂质等，通过重结晶后的晶体虽然具有良好的纯度，但是收率较低，在0.5%~0.6%。
专利4：CN201210073881.0从驱虫斑鸠菊果实中制备紫铆素的方法；公开了以下方法：
a、将干燥的驱虫斑鸠菊果实粉碎，加入体积5-25倍量有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯进行提取，提取次数为2-3次，每次提取时间为0.5-3.5小时，其中提取方法为浸泡、渗漉、加热回流、超声波提取或微波提取；
b、合并提取液，减压浓缩，再加水分散，用大孔树脂或聚酰胺柱层析，其中大孔树脂为D101、AB-8或NKA-9型大孔树脂；
c、再用水冲洗柱床，弃去水洗脱液，然后以浓度为20-80％乙醇水溶液冲洗柱床，收集洗脱液浓缩，得紫铆素粗品；
d、将粗品用氯仿-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、乙腈或甲醇溶解后，上硅胶柱层析或反向硅胶柱层析或葡聚糖凝胶LH-20柱层析，再用氯仿-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、乙腈或甲醇溶液洗脱即可得到紫铆素纯品。
从上述专利文献中可以看出：
现有技术中采用乙醇等有机溶剂提取虽然可以较快溶出有效成分，但有机溶剂提取易把黄栌中树脂、树胶等脂溶性成分一并提取出来，粗提物杂质成分复杂，为后续分离带来困难，这使得粗品中含有大量的树脂、树胶等脂溶性成分，这些成分在有机溶剂中的溶解度高，因此在精制过程中，为了能够去除粗品中的脂溶性成分，一般均须反复重结晶或通过柱层析分离的方法才能得到高纯度产品。
然而，众所周知，有机溶剂提取成本较高，耗能高，柱层析分离步骤繁琐，且损耗高，要得到HPLC外标法含量98%产品则须反复精制，收率更低；不利于产业化生产。
漆黄素在精制过程中，可以通过柱层析方式进行高度纯化，也可以采用重结晶的方式进行纯化。在重结晶的过程中，本发明人发现在不同工艺条件下，漆黄素重结晶的晶体形状不相同，当漆黄素重结晶的晶体形状不相同时，还表现出两者的颜色深浅程度不相同。
重结晶的漆黄素精品具有两种晶体形状，一种是针状晶体，另一种是粉末状晶体或者称为颗粒状晶体；当重结晶的工艺条件发生变化后，高纯度的漆黄素产品的晶体形状也发生变化。同时，针状晶体的颜色更接近漆黄素的本色，具有更好的生物利用度和稳定性，粉末状晶体的颜色更深，与漆黄素的自有颜色具有差异，生物利用度和稳定性较针状晶体差。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法制备漆黄素的方法，不仅能够减少有机溶剂的使用，采用柠檬酸溶液容易进行浸提，减少脂溶性物质，从而能够在精制纯化过程中通过重结晶的方式获得高纯度产品，避免必须采用柱层析等复杂精制工艺；同时本发明优化重结晶工艺，使得重结晶后能够获得针状晶体，使得产品颜色更加接近产品本色。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种酶法制备漆黄素的方法，包括以下步骤：
步骤（1）酶解：
将原料黄栌粉碎，加入原料5~20倍重量的柠檬酸溶液，调节pH值至4.5~5.5，加入植物提取复合酶，于25℃~50℃条件下搅拌，使漆黄素充分溶出至柠檬酸溶液中；然后灭活植物提取复合酶，收集酶解液；重复对原料进行酶解提取，合并酶解液；
步骤（2）粗制：
将合并的酶解液浓缩成浸膏，在浸膏中加10~20倍高醇，加热至完全溶解，然后冷却至室温过滤，滤液经浓缩、结晶、干燥后得到漆黄素粗品；
步骤（3）重结晶精制：
漆黄素粗品使用重结晶溶剂进行2次重结晶，第一次重结晶使用丙酮/乙醇混合液，第二次重结晶使用甲醇；2次重结晶后得到高纯度的漆黄素精制品。
本发明的一个优化实施例中，所述步骤（1）中加入10倍原料重量的水；所述酶解溶解时间为2h~6h。
本发明的一个优化实施例中，步骤（1）中植物提取复合酶的酶活力为15万~20万U/g，植物提取复合酶与原料的质量比为1:50~150。
本发明的一个优化实施例中，步骤（1）中植物提取复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶中的一种或者多种混合物。
本发明的一个优化实施例中，步骤（1）中灭活植物提取复合酶的方法为将酶解液加热至80℃~100℃或者为加入强碱调节酶解液pH至7~8。
本发明的一个优化实施例中，步骤（2）中的高醇为醇度大于90%的甲醇或乙醇。
本发明的一个优化实施例中，步骤（3）中漆黄素粗品与重结晶溶剂的重量比为1:20~50。
本发明的一个优化实施例中，步骤（3）中丙酮/乙醇混合液中丙酮和乙醇的体积比为1:1。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明采用柠檬酸溶液对漆黄素进行提取，在柠檬酸溶液中漆黄素具有良好的溶解度，同时脂溶性物质不能溶于柠檬酸溶液中，使得酶解液中脂溶性物质极少，能够直接通过重结晶工艺完成精制，不需要柱层析工艺，减少了工艺操作难度和效率，提高了生产效率，适用于工业化生产。
2、本发明优化了重结晶工艺，使得重结晶后得到的漆黄素精制品为针状晶体。本发明的漆黄素精制品的纯度达到99%，针状晶体的颜色更加接近于漆黄素，具有更好的生物利用度和稳定性 。
3、本发明采用植物提取复合酶处理原料，植物提取复合酶可以水解黄栌木质部纤维素、木聚糖、果胶及其他多糖类成分，破坏植物细胞壁，增加有效成分溶出效率。
4、采用酶的水溶液为提取剂，可以避免树脂、树胶等脂溶性成分的溶出，酶解温度适当，符合漆黄素在热水中溶解度增大的理化性质；酶解液浓缩膏通过加入高醇，除去水溶性杂质，如酶解后的糖类及植物提取复合酶，避免复合酶影响后续精制步骤。
5、与现有工艺相比，本发明避免有机溶剂回流提取，低耗能，且原料提取率高，后续纯化只涉及重结晶步骤，无吸附、层析等分离步骤，操作简单，生产设备要求低，利于工业化生产，能显著降低生产成本，提高生产效益。
6、相对于采用石灰石氢氧化钙饱和溶液进行提取的方法，本发明采用柠檬酸进行提取，获得了更高的收率。
附图说明
图1为本发明实验组1中漆黄素精制品的400倍显微镜图谱；
图2为本发明实验组2中漆黄素精制品的400倍显微镜图谱；
图3为本发明实验组3中漆黄素精制品的400倍显微镜图谱；
图4为本发明实验组4中漆黄素精制品的400倍显微镜图谱；
图5为本发明实验组5中漆黄素精制品的400倍显微镜图谱；
图6为本发明实验组6中漆黄素精制品的400倍显微镜图谱；
图7为本发明实验组7中漆黄素精制品的400倍显微镜图谱；
图8为本发明实验组8中漆黄素精制品的400倍显微镜图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种酶法制备漆黄素的方法，包括以下步骤：
步骤（1）酶解：
将原料黄栌粉碎，加入原料10倍重量的柠檬酸溶液，调节pH值至4.5~5.5，加入植物提取复合酶，植物提取复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶中的一种或者多种混合物。
植物提取复合酶的酶活力为15万~20万U/g，植物提取复合酶与原料的质量比为1:50~150。然后在25℃~50℃条件下搅拌2h~6h，使漆黄素充分溶出至柠檬酸溶液中。
然后灭活植物提取复合酶，收集酶解液；重复对原料进行酶解提取，合并酶解液。灭活植物提取复合酶的方法为将酶解液加热至80℃~100℃或者为加入强碱调节酶解液pH至7~8。
步骤（2）粗制：
将合并的酶解液浓缩成浸膏，在浸膏中加10~20倍高醇，高醇为醇度大于90%的甲醇或乙醇。加热至完全溶解，然后冷却至室温过滤，滤液经浓缩、结晶、干燥后得到漆黄素粗品；
步骤（3）重结晶精制：
漆黄素粗品使用重结晶溶剂进行2次重结晶，漆黄素粗品与重结晶溶剂的重量比为1:20~50。第一次重结晶使用丙酮/乙醇混合液，丙酮/乙醇混合液中丙酮和乙醇的体积比为1:1。第二次重结晶使用甲醇；2次重结晶后得到高纯度的漆黄素精制品。
实施例1：
一种酶法制备漆黄素的方法，包括以下步骤：
步骤（1）酶解：
将原料黄栌粉碎，取200g原料，加入2000ml柠檬酸溶液，调节pH值至5，加入2g植物提取复合酶，于50℃条件下搅拌4h，使漆黄素充分溶出至柠檬酸溶液中；然后灭活植物提取复合酶，收集酶解液；重复对原料进行酶解提取，合并酶解液3650ml；
步骤（2）粗制：
将合并的酶解液浓缩成浸膏26.9g，在浸膏中加450ml的95%甲醇，加热至完全溶解，然后冷却至室温过滤，滤液经浓缩、结晶、干燥后得到漆黄素粗品6.4g；
步骤（3）重结晶精制：
漆黄素粗品6.4g使用重结晶溶剂进行2次重结晶，第一次重结晶使用1:1的丙酮/乙醇混合液192ml，第二次重结晶使用95%甲醇192ml；2次重结晶后得到高纯度的漆黄素精制品2.1g。对得到的高纯度漆黄素精制品进行检测。
HPLC检测归一法含量为98.6%，外标法含量为96.9%，收率1.05%。
实施例2
将黄栌原料粉碎，称取200g原料与三口烧瓶中，加入2000ml pH=5的柠檬酸溶液，加入2.5g植物提取复合酶，在 50℃下搅拌处理4小时，加5%NaoH溶液调节pH=7，收集酶解液；重复以上步骤合并酶解液共3700ml。
2）将酶解液真空浓缩得浸膏31g；
3）浸膏加460ml纯度 99%甲醇，加热完全溶解后冷却至室温，过滤，滤液浓缩、结晶、干燥得漆黄素粗品6.1g。
4）将6.1g漆黄素粗品重复结晶2次得漆黄素2.3g，第一次重结晶使用1:1的丙酮/乙醇混合液192ml，第二次重结晶使用98%甲醇192ml。
HPLC检测归一法含量98.7%，外标法含量97.4%；收率1.15%。
实施例3
将黄栌原料粉碎，称取50kg原料于提取罐中，加入350kg水，加柠檬酸溶液调节pH=5，加入500g植物提取复合酶，在 50℃下循环处理4小时，加热至沸腾再回来1小时，收集酶解液；重复以上步骤合并酶解液共630L。
2）将酶解液真空浓缩得浸膏7kg；
3）浸膏加70kg纯度 95%乙醇，加热完全溶解后冷却至室温，过滤，滤液浓缩、结晶、干燥得漆黄素粗品1.3kg。
4）将1.3kg漆黄素粗品重结晶2次得漆黄素505g，第一次重结晶使用1:1的98%丙酮/95%乙醇混合液192ml，第二次重结晶使用98%甲醇192ml。
HPLC检测归一法含量98.1%，外标法含量97.6%；收率1.01%。
实施例4
将黄栌原料粉碎，称取800kg原料于提取罐中，加入6000kg水，加柠檬酸酸调节pH=4.5，加入16kg植物提取复合酶，在 50℃下循环处理4小时，升温至沸腾，回流1小时灭酶活性，收集酶解液4900L；重复以上步骤收集酶解液5150L。
2）将酶解液真空浓缩至浸膏，密度1.18，重量123kg；
3）浸膏加1800kg纯度 95%乙醇，加热完全溶解后冷却至室温，过滤，滤液浓缩至密度1.09，静置结晶、离心干燥得漆黄素粗品19.6kg。
4）将19.6kg漆黄素粗品重复结晶2次得漆黄素8.96kg，第一次重结晶使用1:1的98%丙酮/98%乙醇混合液192ml，第二次重结晶使用95%甲醇192ml。
HPLC检测归一法含量98.8%，外标法含量97.4%；收率1.12%。
实验例一：不同重结晶工艺对晶体的影响
1、制备漆黄素粗品：
步骤（1）酶解：
将原料黄栌粉碎，取200g原料，加入2000ml柠檬酸溶液，调节pH值至5，加入2g植物提取复合酶，于50℃条件下搅拌4h，使漆黄素充分溶出至柠檬酸溶液中；然后灭活植物提取复合酶，收集酶解液；重复对原料进行酶解提取，合并酶解液3650ml。
步骤（2）粗制：
将合并的酶解液浓缩成浸膏26.9g，在浸膏中加450ml的95%甲醇，加热至完全溶解，然后冷却至室温过滤，滤液经浓缩、结晶、干燥后得到漆黄素粗品6.4g。
2、将漆黄素粗品进行两次重结晶，重结晶的方法保持一致，重结晶中使用的重结晶溶剂如表1所示。
表1：实验例一中每个实验组的重结晶溶剂
实验组
第一次重结晶溶剂
第二次重结晶溶剂
实验组1
98%丙酮/98%乙醇混合液
98%甲醇
实验组2
98%甲醇
98%甲醇
实验组3
98%乙醇
98%乙醇
实验组4
98%丙酮
98%丙酮
实验组5
氯仿/丙酮混合液
50%甲醇/98%乙醇
实验组6
98%甲醇
98%乙醇
实验组7
98%丙酮
98%甲醇
实验组8
98%乙醇
98%甲醇
将上述实验组1至实验组8参照实施例1的方法进行重结晶，每个实验组的重结晶步骤相同，仅仅是重结晶溶剂不相同。将实验组1至实验组8获得的高纯度漆黄素精制品使用400倍高倍镜进行观察，观察结果如图1至图8所示。
从图1至图8可以看出，实验组1的晶型为针状体晶型，实验组2-7主要为粉末状或者颗粒状晶型。从外观上进行观察，实验组1的颜色最浅，最接近漆黄素本身的颜色。从实验组1至实验组8的实验结果可以得知，当采用不同重结晶工艺时，将会获得不同形状的晶形，本发明的两次重结晶的溶剂不相同，进而获得了针状体晶型；当采用现有技术中的常规重结晶溶剂时，其获得了粉末状或者颗粒状的晶体。
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