一种类黄酮化合物的钙配合物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种类黄酮化合物的钙配合物及其制备方法与应用 (Calcium complex of flavonoid compound and preparation method and application thereof ) 是由 韩瑞敏 钱玲玲 杨芝音 徐怡 张建平 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抗氧化剂,具体公开了一种类黄酮化合物的钙配合物及其制备方法与应用,所述类黄酮化合物的结构通式如式I所示。本发明类黄酮化合物中的山柰酚为例,将山柰酚溶液与钙离子溶液混合后反应得到山柰酚-钙配合物,其化学结构式如式II所示。经过试验研究发现,山柰酚-钙配合物相比山柰酚具有更高的自由基清除活性以及更低的氧化还原电位,可将其作为抗氧化剂进行应用,例如应用于食品、药品、化妆品、护肤品等存在抗氧化需求的产品中。(The invention relates to an antioxidant, and particularly discloses a calcium complex of a flavonoid compound, a preparation method and application thereof. The kaempferol in the flavonoid compound is taken as an example, and a kaempferol solution and a calcium ion solution are mixed and then react to obtain a kaempferol-calcium complex, wherein the chemical structural formula of the kaempferol-calcium complex is shown as a formula II. Through experimental research, the kaempferol-calcium complex has higher free radical scavenging activity and lower oxidation-reduction potential compared with kaempferol, and can be applied as an antioxidant in products with antioxidant requirements, such as food, medicines, cosmetics, skin care products and the like.)
技术领域
本发明涉及抗氧化剂，具体地说，涉及类黄酮化合物的钙配合物。
背景技术
山柰酚(Kaempferol，Kaem)，又名百蕊草素Ⅲ，是类黄酮化合物的一种，化学名称3,5,7,4′-四羟基黄酮(3,5,7,4′-tetrahydroxyflavone)，相对分子质量286.23，单体纯品为黄色结晶状粉末。广泛存在于多种蔬菜和水果中，例如韭菜、西红柿、西兰花、柚子、草莓。人们已经从茶叶、蜂胶、巫榛子以及其他绿色植物提取到纯品。一些研究报道了山柰酚具有自由基清除活性，是一种良好的天然抗氧化剂，具有抗炎、抗癌、抗菌、治疗糖尿病等多种生物活性。
若能够对山柰酚的性能加以深入研究，甚至利用其开发出具备更高抗氧化性能的抗氧化剂，将有利于拓宽山柰酚的应用范围，更大程度地发挥其作用与优势。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种类黄酮化合物的钙配合物及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种类黄酮化合物的钙配合物，其特征在于，所述类黄酮化合物的结构通式如下：
其中，R1，R2，R3，R4，R1′，R2′，R3′，R4′，R5′分别选自氢、羟基、C1-5烷基、C3-5烯基、C1-5烷氧基中的一种或其异构体；
同时，R1，R2，R3，R4，R1′，R2′，R3′，R4′，R5′中需至少一个为羟基。
本发明所述的类黄酮化合物包括天然存在类黄酮化合物及其经化学修饰而得到的衍生物。
本发明以山柰酚作为代表，经试验验证了其可与钙离子发生配合，形成如式II所示的山柰酚-钙配合物。进而通过多项试验推知，与山柰酚具有相同的3、4位结构(如图3所示)的类黄酮化合物，即具有上述通式结构的类黄酮化合物皆可与钙离子在3，4位发生配合，从而得到相应的类黄酮化合物的钙配合物。且根据本领域公知常识，具有上述通式结构的类黄酮化合物的3、4位相对其他取代基位置具有与金属离子更高的配合活性，因此R1，R2，R3，R4，R1′，R2′，R3′，R4′，R5′在上述范围所限制的取代基中进行选择，并不会影响类黄酮化合物与Ca(II)在3、4位发生配合。为了在与Ca(II)发生配合后提高自由基的清除活性，R1，R2，R3，R4，R1′，R2′，R3′，R4′，R5′需至少有一个取代基选为羟基，使得在类黄酮化合物与Ca(II)发生配合后，可促进其他位置羟基的自由基清除活性。
所述类黄酮化合物例如可以是如图6所示的甘草黄酮醇、异甘草黄酮醇、高良姜素、大花旋覆花素、非瑟酮、槲皮素、鼠李素、异鼠李素和杨梅素及其衍生物，但并不局限于此。
第二方面，本发明提供一种山柰酚-钙配合物，所述山柰酚-钙配合物的化学结构式如式II所示，其中，M为Ca。
本发明提供的山柰酚-钙配合物在红外光谱中，在波数为1650cm-1、1615cm-1、1365cm-1、1223cm-1和582cm-1附近存在特征吸收峰。
第三方面，本发明提供了所述山柰酚-钙配合物的制备方法，将山柰酚溶液与钙离子溶液混合后，获得反应产物，即得所述山柰酚-钙配合物。
对所得反应产物进行减压蒸干，经1:1甲醇与水混合溶剂洗涤、过滤、干燥后，得到山柰酚-钙配合物成品。
作为优选，所述钙离子溶液的溶质为弱酸钙盐。
研究发现，当采用强酸钙盐作为溶质时，需中和产物生成的强酸以促进配合物生成，即在将山柰酚溶液与钙离子溶液混合后，加入碱性物质用于中和混合后生成的酸，调节混合溶液的pH为中性。
进一步优选地，山柰酚与钙离子的摩尔比为1:19～19:1，即在该摩尔比下，均可制备得到本发明所述的山柰酚-钙配合物；为了更好的促进所述山柰酚-钙配合物的形成，可采用相对过量的钙离子以缩短所述山柰酚-钙配合物的获得时间，因此更优选上述摩尔比不大于2:1。
可选地，以乙醇作为所述山柰酚和钙离子溶液的溶剂；高浓度条件下还可利用二甲亚砜进行增溶。乙醇里二甲亚砜增溶后，山柰酚≤1mM，钙离子≤500μM。
可选地，所述山柰酚溶液的浓度可为100μM～1mM，所述钙离子溶液的浓度可为50μM～500μM。但在实际应用中，所使用的上述溶液浓度并不局限于此，例如，当以牛奶作为钙离子供体溶液时，其钙离子浓度可达到mM级别，且牛奶中酪蛋白、乳清蛋白和乳脂球均可以与类黄酮结合，提高黄酮在牛奶中的溶解性。
第三方面，本发明提供了所述山柰酚-钙配合物在作为抗氧化剂及清除自由基方面的应用。
本发明经过试验验证，所述山柰酚-钙配合物相比山柰酚具有更低的氧化还原电位，以及更高的自由基清除活性，且具有天然、无毒、有良好生理功能的特点，故而可将山柰酚-钙配合物作为抗氧化剂进行应用，例如应用于食品、药品、化妆品、护肤品等存在抗氧化需求的产品中。
所述应用具体可体现为一种提高含钙物质抗氧化性的方法，例如，对于富含钙离子的奶制品，可将山柰酚作为食品添加剂，通过向其中加入山柰酚，使山柰酚与含钙物质中的钙离子发生反应，生成具有抗氧化性的山柰酚-钙配合物，从而对含钙物质进行抗氧化保护。且由于山柰酚广泛存在于多种蔬菜和水果中，绿色、无害，安全性得到了可靠的保证。
更为具体地，当向含钙物质中添加山柰酚时，由于山柰酚微溶于水，可采用乳化剂乳化方式添加，提高其溶解性。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到
具体实施方式
。
本发明的有益效果在于：
本发明利用山柰酚与钙离子形成山柰酚-钙配合物，采用紫外可见吸收光谱、红外光谱、质谱、电化学、停留光谱和纳秒时间分辨光谱确定了山柰酚与钙生成的山柰酚-钙配合物的结构和自由基清除活性。利用了山柰酚较好的超离域和大π键共轭体系，以及Ca(II)具有的空轨道，促进了配合物的形成。
本发明进一步研究了山柰酚与Ca(II)配合物的抗氧化机理，可以为类黄酮化合物作为食品添加剂、抗氧化剂以及候选药物提供新思路。
附图说明
图1为本发明所述山柰酚-钙配合物的质谱图。
图2为本发明实验例1中紫外可见吸收光谱组分分析结果；其中，左图为山柰酚中加入Ca(II)后紫外可见吸收光谱的变化，嵌入图为等摩尔连续变化(Job-plot)组分分析结果，右图为对比芹菜素中加入Ca(II)后紫外可见吸收光谱不发生变化。
图3为山柰酚和芹菜素的化学结构式。
图4为本发明实验例1中氧化还原电势分析结果。
图5为本发明实验例1中自由基清除实验结果。
图6为可与Ca(II)在3、4位发生配合的类黄酮化合物举例。
具体实施方式
本发明具体实施方式中所使用的试剂包括：山柰酚(Kaem，>98％)和芹菜素(Api，>98％)购自陕西惠科植物有限公司；醋酸钙(C4H6CaO4，>99％)购自上海泰坦科技股份有限公司；β-胡萝卜素、二茂铁(98％)、高氯酸钠(NaClO4,>98％)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，其中β-胡萝卜素通过正己烷和丙酮重结晶，经高效液相色谱法测得纯度为98％；DPPH·(>97％，北京)购自中生瑞泰科技有限公司；HPLC级甲醇购自Mreda有限公司(Lake Forest,CA,USA)，HPLC级乙醇(≥99.9％)精细化工研究厂(天津)，氯仿(>99％，北京化工厂)通过氧化铝柱后精馏。
本发明具体实施方式中所使用的实验仪器包括：安捷伦紫外可见分光光度计Cary60；傅里叶红外分光光度计(Bruker Tensor 27,Karlsruhe,Germany)；质谱ThermoScientificTM Q ExactiveTM HF(Waltham,MA,USA)；上海辰华电化学工作站CHI 760D；停留光谱(RX2000，Applied Photophysics Ltd,Surrey,United Kingdom)；Nd3+：YAG激光器(Quanta-Ray PRO-230,Spectra Physics Lasers,Inc.,Mountain View,CA,USA)。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种山柰酚-钙配合物
1、原料
山柰酚(Kaem，>98％)购自陕西慧科植物有限公司；醋酸钙(C4H6CaO4，>99％)购自上海泰坦科技股份有限公司；HPLC级乙醇(≥99.9％)精细化工研究厂(天津)，氯仿(>99％，北京化工厂)通过氧化铝柱后精馏。
2、制备方法
(1)配制山柰酚溶液：
将山柰酚溶于乙醇中，2％二甲亚砜增溶，超声，得到浓度为1mM的山柰酚溶液；
(2)配制钙离子溶液：
将醋酸钙溶于乙醇中，2％二甲亚砜增溶，超声，得到浓度为500μM的钙离子溶液；
(3)将上述山柰酚溶液与钙离子溶液按2:1的体积比混合，减压蒸干、洗涤、过滤、干燥，获得产物。
3、产物验证
(1)质谱分析：
对所得产物进行质谱分析(阳离子模式)，结果如图1所示。实验值(Exp.)和理论值(Cal.)，如表1所示。
表1.质谱的实验值(Exp.)和理论值(Cal.)
Exp.(m/z)
Cal.(m/z)
配合物
652/653
651/652/653
Ca(II)-(Kaem-H)<sub>2</sub>+Na<sup>+</sup>+H<sub>2</sub>O
657/658/659
657/658/659
Ca(II)-(Kaem-H)<sub>2</sub>+H<sup>+</sup>+C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>OH
注：配合物Ca(II)-(Kaem-H)2后面简写为Ca(II)-Kaem2。
(2)紫外可见吸收光谱与Job-plot等摩尔连续变化曲线分析：
首先，将山柰酚与Ca(II)在不同摩尔配比下，形成的配合物的吸收光谱：利用乙醇中20μM Kaem和2～320μM Ca(II)混合测得配合物的紫外可见吸收光谱，如图2(左图)所示。
在乙醇溶液中，山柰酚的最大吸收为368nm，加入Ca(II)后，长波处出现425nm肩峰，单独的Ca(II)在长波方向并无吸收峰的出现，证实Ca(II)与山柰酚发生配合。
其次，通过控制Ca(II)总浓度为50μM并变换山柰酚与Ca(II)摩尔比1:19～19:1，获得吸收光谱。采用Job′s plot的方法计算配合比，以吸收光谱中440nm波长下的吸收值为纵坐标，金属离子的摩尔分数为横坐标，进行线性拟合获得Job′s plot曲线，通过其交点处的横坐标即可获得山柰酚与Ca(II)反应的配比。
Job-Plot结果(图2左图内插图)显示Ca(II)与山柰酚配合比例为1：2生成Ca(II)-Kaem2，进一步结合上述质谱结果，对山柰酚-钙配合物的结构进行了验证。
进一步地，采用同为类黄酮物质的芹菜素替换山柰酚(二者的化学结构式如图3所示，4、5位基团相同)作为对比试验，经紫外可见吸收光谱分析结果显示(图2中的右图)，Ca(II)并未与芹菜素发生配合，说明Ca(II)与山柰酚不是在4、5位发生配合。
由此，可以证明，山柰酚与钙离子的配合位点在3，4位。
(3)红外光谱分析：
对所得产物与KBr混合压片，进行红外光谱振动吸收峰分析，结果如下：
单纯的山柰酚的羰基振动峰在1657cm-1，加入Ca(II)离子之后，由于羰基上的氧与Ca(II)配合，降低了羰基的电子云密度，向低波数移动7cm-1；低频指纹区582cm-1出现Ca-O的伸缩振动。
红外谱图主要频率列于表2中：
表2.红外光谱振动吸收峰(cm-1)
化合物
ν(C＝O)
ν(C＝C)
ν(C-OH)
ν(C-O-C)
ν(M-O)
山柰酚
1657
1613
1372
1243
-
山柰酚-钙配合物
1650
1615
1365
1223
582
由此可以看出，山柰酚与醋酸钙发生反应后，在羰基位发生配合，配合后峰位后移。
综上，证明所得产物的结构为Ca(II)-Kaem2结构(如式II所示)。
进一步验证，与山奈酚具有相同3、4位结构的类黄酮化合物，均可与钙离子发生配合，形成相应的类黄酮化合物钙配合物。
实施例2一种山柰酚-钙配合物
本实施例与实施例1的区别在于：采用氯化钙替换醋酸钙，并在与山柰酚混合后调节溶液pH至中性。
经质谱分析和红外光谱振动吸收峰分析，验证了所得产物与实施例1和实施例2所得产物具有相同的结构。
实验例1
本实验例用于说明山柰酚-钙配合物的抗氧化性。
1、氧化还原电势
本实验例以乙醇为溶剂，通过循环伏安法分别对100μM山柰酚溶液(Kaem)和向其中加入1000μM钙离子溶液后得到的配合物溶液(Ca-Kaem2)进行氧化还原电势的测定。
循环伏安法具体为：工作电极是玻碳电极，参比电极是银离子电极(0.10μMNaClO4+0.10μM AgNO3)，辅助电极是铂电极。0.10μM NaClO4为电解质，50μM的二茂铁为内标。扫描范围为-0.5V～+0.9V，扫速为0.05V/s。
结果如图4所示，山柰酚在溶剂中的氧化还原电势为0.166V，加入过量Ca(II)溶液后，氧化还原电势显著降低至-0.081V。说明向山柰酚溶液中加入钙离子溶液，可显著降低氧化还原电势，抗氧化性获得了显著的提高。
2、自由基清除活性
(1)山柰酚及山柰酚-钙配合物对DPPH·自由基清除能力测定：使用Cary 60测得100μM DPPH·、100μM DPPH·+50μM Kaem、100μM DPPH·+50μM Kaem+50μM Ca(II)的不同时间的吸收光谱，并以516nm的吸收值(Absorbance)为纵坐标，时间(t)为横坐标，作各样品对DPPH·清除的动力学曲线，分析样品的自由基清除活性及机理，实验溶剂为乙醇。
(2)山柰酚及山柰酚-钙配合物对β-胡萝卜素阳离子自由基清除能力测定：采用光程为1cm的石英池，实验溶剂均为乙醇、氯仿＝7:3。氯仿用以促进β-胡萝卜素生成阳离子自由基。使用940nm的动力学数据分析抗氧化活性。β-Car的吸光度为0.5，Kaem的浓度是50μM，Ca(II)的浓度是500μM。
如图5所示，50μM山柰酚分别在有、无500μM钙离子条件下清除100μM DPPH·(左图，516nm)和5μMβ-胡萝卜素阳离子自由基β-Car·+(右图，940nm)的反应动力学(单独500μM钙离子做对照)。
DPPH·，分子式C18H12N5O6，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)，常温下为暗紫色晶体。DPPH·清除活性常被用来作为评价抗氧化剂以氢转移方式清除自由基能力的指标。图4中516nm动力学结果显示Ca(II)不与DPPH·发生反应，Ca(II)-Kaem2清除DPPH·的速率是Kaem母体的181倍。
类胡萝卜素自由基阳离子(Car·+)是类胡萝卜素以电子转移方式氧化后的产物自由基，光诱导生成的Car·+的快速清除动力力学可以帮助获得抗氧化能力信息。以β-Car为例：
β-Car→β-Car·++e-
940nm的动力学显示单独的Ca(II)离子或Kaem均不与β-Car·+反应，Kaem与Ca(II)配合后，显著加快β-Car·+的清除速率，二级反应速率常数为(5.44±0.02)×108L·mol-1·s-1。
对比例1
经过试验发现，某些二价金属离子(如锌离子)也可与山柰酚形成配合物，但所获得的配合物的抗氧化性远不如山柰酚-钙配合物。
为了证明这一点，本对比例采用锌离子替代钙离子，锌和山柰酚同样在3，4位配合，但依赖于配体的浓度可以分别生成1：1或2：1的山柰酚-锌配合物。山柰酚-锌配合物与山柰酚-钙配合物的氧化还原电位和清除DPPH·和β-Car·+自由基的二级反应速率常数kCar·+和kDPPH·(L·mol-1·s-1)进行比较，结果如表3所示。
表3.山柰酚-锌配合物与山柰酚-钙配合物的抗氧化性比较
注：M为Zn或Ca。
由此可以看出，相较于山柰酚-锌配合物，山柰酚-钙配合物对DPPH·和β-Car·+的清除速率显著加快，对自由基的清除作用具有更为明显的优势。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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